一种心型脂肪酸结合蛋白检测试剂及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种心型脂肪酸结合蛋白检测试剂及其制备方法，其由试剂一和试剂二配合而成，其中，所述试剂一和试剂二的体积比为5∶1；所述试剂一中包括：20～50mmol/L的缓冲液、2％w/v的促凝剂、2％w/v的BSA、0.1％～0.5％w/v的防腐剂；所述试剂二中包括：0.1％～0.5％w/v标记有抗人H-FABP抗体的胶体金颗粒、2％～5％w/v的稳定剂、20～50mmol/L的缓冲液、0.1％～0.5％w/v的防腐剂，所述标记有抗人H-FABP抗体的胶体金颗粒的直径为60nm～90nm。本发明具有检测灵敏度高，检测线性范围大，且检测简单快速，操作性好等诸多优点。
【专利说明】一种心型脂肪酸结合蛋白检测试剂及其制备方法 【【技术领域】】
[0001] 本发明涉及一种心型脂肪酸结合蛋白检测试剂及其制备方法，具体涉及用于检测 血清或血浆中H-FABP的匀相溶胶颗粒型H-FABP免疫测定试剂，属于医疗器械体外诊断试 剂领域。 【【背景技术】】
[0002] 心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP)是心脏中富含的一种新型小胞质蛋白，它具有高 度心脏特异性（也就是主要在心脏组织中表达），但在心脏以外的组织中也有低浓度表达。 心肌缺血性损伤出现后，H-FABP可以早在胸痛发作后1?3小时在血液中被发现，6?8小 时达到峰值而且血浆水平在24?30小时内恢复正常。心脏脂肪酸结合胞质蛋白由132个 氨基酸组成，分子量为15kDa。心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP)基因位于染色体I上。它是 心脏最丰富的蛋白质之一。H-FABP结合两个脂肪酸分子并参与脂肪酰基辅酶A的运输，活 跃于氧化过程，从而在线粒体中产生能量。
[0003]H-FABP的几个生物学方面表明它可能是一种对心肌损伤的早期诊断有用的生物 标志物：（1)在心肌中高浓度；（2)在细胞质中限制；（3)低分子量和面积小；(4)相对组织 特异性；（5)与心脏以外组织中CK-MB的分布相似，以及（6)在心肌损伤后早释进入血浆和 尿液。
[0004] 缺血损伤后快速出现H-FABP表明它可能通过经内皮途径到达循环。几项临床观 察结果表明这种蛋白质主要通过肾排除。症状发作后不久H-FABP出现在患者的尿液中。
[0005]H-FABP的特征看似与肌红蛋白的相似。这两种在心肌和骨骼组织中表达的低分子 量胞质蛋白是线粒体氧化的基质而且在症状发作后2小时内释放，6小时出现最大浓度，24 小时内恢复基线浓度。然而，他们在心脏和肌肉组织中的浓度不同。心脏中H-FABP浓度比 骨骼肌中高2?10倍（（净重0. 5vs. 0. 05?0. 2mg/g)。与此相反，心脏细胞中肌红蛋白浓 度比骨骼细胞中低2倍（2. 5和4.Omg/g净重）。肌红蛋白的正常血浆浓度（20?80yg/ 1)比H-FABP的（< 5yg/1)高10?15倍。游离血浆肌红蛋白水平升高是被广泛接受的 早期心肌损伤标志而且在1994年Bhayana等人证明了血楽肌红蛋白水平升高比CK-MB和 cTnT水平升高在症状发作后3?6小时内排除急性心肌梗塞（AMI)上具有优越性。尽管在 发表的几个准则中肌红蛋白被推荐为心脏损伤的早期标志物，但H-FABP更加具有心脏特 异性而且由于其生物学特性它可能被认为是一种更准确的诊断试验。
[0006] 如先前讨论的那样，H-FABP和肌红蛋白还存在于骨骼肌中但是缺少心脏特异性。 由于这些蛋白质在心脏和骨骼肌中不同程度地表达，肌红蛋白/H-FABP比率被用于更好地 区别心脏和肌肉特异性损害。比值为5被认为具有心脏特异性而比值在21?70之间表 明更倾向于骨骼肌损害。Furuhashi等人发现这个比值对肾功能障碍患者有用，他们确定 H-FABP/肌红蛋白比值为0. 147是心脏病变的临界值。其他作者质疑肌红蛋白/H-FABP比 值作为一种有助于检测急性缺血性损伤的试验的优势。
[0007]H-FABP与急性心肌梗塞的关系
[0008] 1988年，Glatz等人提出H-FABP用作鼠类AMI的新型生物化学标志物。1991年， 这一观察结果被Abe等人和Tanaka等人在人类中得到确认，表明人类H-FABP可被用作一 种对心肌梗塞检测具有高灵敏度和检测率的良好生物标志物。后来的研究证实了这一假 设。H-FABP在症状发作后早期释放到血流中而且在20分钟后可以被检测到。最大浓度在 胸痛发作后3?5小时出现，在20小时内恢复正常基线值。Kleine等人报告在症状发作 后30?210分钟内诊断出AMI的灵敏度高于80%。2004年，Chan等人报告了对218位 入院时伴随胸痛的疑似AMI患者进行的研究结果。对于在症状发作后24小时内入院的患 者来说，在第一份监测样本中H-FABP的灵敏度和阴性预测值（72和67% )好于CPK(54和 55% )及H-FABP(51和51% )。此外，对于入院后1小时被监测的样本，与CPK或H-FABP 测定相比H-FABP的灵敏度和阴性预测值增加到100%。因此，连续两个样本H-FABP监测可 以在1小时内确定几乎所有患持续AMI的患者而且可以100%排除非AMI患者，不会有假阴 性结果。对于其他心脏标志物比如CK-MB、H-FABP和cTnT，据报道在症状发作后间隔0? 6小时内检测出AMI的灵敏度约为64%。在一项前瞻性多中心试验中，Nakata等人研究了 133位到达急诊室时疑似患有急性冠状动脉综合征（ACS)的患者，证明与肌红蛋白、TnT和 CK-MB相比H-FABP在症状发作后12小时内检测出ACS和AMI的R0C曲线下面积最高（对 于ACS，H-FABP的曲线下面积为0. 936,肌红蛋白0. 862,TnT0. 734以及CK-MB0. 793 ;对 于AMI，H-FABP0. 907,肌红蛋白 0. 860，TnT0. 838 以及CK-MB0. 880)。R0C分析结果表明 在这些生物标志物中H-FABP提供最强的诊断能力，尤其是在急性缺血事件的前6小时内， 有助于快速危险分层和更早预测患者预后。
[0009]H-FABP的早期使用可以克服急性胸痛早期心肌肌钙蛋白检测的陷阱。心肌肌钙蛋 白在循环中越持久，可能越有助于急性心肌损伤的后期诊断。
[0010] 在大多数研究中，用于诊断ACS的H-FABP临界值是6. 2ng/ml，但是Nakata等人呈 现的结果显示9. 5和13ng/ml分别是更适于诊断ACS和AMI的临界值。H-FABP通过肾从血 流中排除。AMI患者尿液中H-FABP浓度高于正常值。在症状发作后1. 5小时内发现尿液浓 度升高。进行了不同的动物研究以调查尿液中H-FABP的浓度曲线。结果显示只有在冠状 动脉结扎30分钟后H-FABP才对AMI有诊断意义。市场上可以买到几种测量H-FABP尿液 浓度的试验。但是，用尿液H-FABP进行AMI早期诊断时必须谨慎因为结果可能受几种因素 的影响，比如异常肾血流、灌注压力、肾小球滤过率、肾小管吸收和肾衰竭，可能低估或高估 AMI的面积。
[0011] 在肾衰竭患者中，基线梗塞前H-FABP血浆浓度通常高于正常值因为肾清除率降 低，血清浓度升高和循环时间延长。由于肌内注射、心脏电复律和心肺复苏术引起的骨骼肌 损伤可能导致H-FABP血浆浓度显著升高，也可能干预试验结果，使得AMI诊断更困难。只有 少数研究评估了H-FABP用于检测ACS的情况。Ishii等人比较了 104位健康志愿者和165 位胸痛发作后6小时内入院的患者。ACS患者和健康志愿者之间的H-FABP(0. 946,95%置 信区间（CI) = 0? 913 ?0? 979)和肌红蛋白（0? 895,95%CI= 0? 846 ?0? 944)的R0C曲 线明显大于肌红蛋白/H-FABP比率以下的面积（0. 823,95%CI= 0. 765?0. 881)。在ACS 患者中，H-FABP灵敏度为81 %、特异性86%和预测准确度84%。作者总结对于AMI早期诊 断而言H-FABP是比肌红蛋白更灵敏和特效的标志物。Tsuji等人观察到97位疑似ACS患 者的H-FABP浓度为3. 5± 1. 7iig/1 (正常范围值0. 0?0. 6iig/1和上限3iig/1)。在症状 发作后3小时内和3?6小时之间被检测的91. 4% (64/70)和100% (111/111)样本显示 AMI患者的血清H-FABP水平高于正常值。在0?3和3?6小时之间分别有20% (8/40) 和66. 3% (53/80)血清样本显示AMI患者的CK-MB活性呈阳性。Alhadi和Fox进行的先导 研究初步结果表明H-FABP可能在诊断不稳定心绞痛中起作用。Kleine等人报告说H-FABP 比CK-MB更适合作为AMI早期标志。
[0012] Abe等人在1991年报告说H-FABP还对血栓溶解疗法后再灌注检测灵敏。他们表 示血栓溶解疗法后30分钟H-FABP比率基线升至> 1. 5与再灌注检测100%绝对准确度有 关。血栓溶解疗法1小时后，准确度降低至94%。Ishii等人在1997年证实了这些结果， 表示H-FABP比率> 1. 8对再灌注检测的准确度在15分钟时为93%，在30分钟时为98% 以及在60分钟时为100%。Groot等人给出了相同结果，证实了对于冠状动脉再灌注检测 的检验高可靠性。
[0013] H-FABP，由于AMI确诊后其在血清中的释放模式，也可用作为早期再梗塞检测的 理想标志物。与以前的数值相比，血清中H-FABP浓度快速升高表示再梗塞。只有达到最高 血浆浓度后6小时H-FABP才能充分灵敏地检测到再梗塞。
[0014]H-FABP可用于梗塞面积的早期估计。1993年，Sohmiya等人在一个实验模型中证 明了通过H-FABP血浆浓度估计心肌梗塞面积与氯化三苯四唑染色之间的良好相关。Glatz 等人用CK-MB、a-羟丁酸脱氢酶替代氯化三苯四唑在人类中发现了相似的结果。用H-FABP 的主要优势是比用其他标志物更早完成ACS估计（H-FABP24小时而CK-MB48小时）。
[0015]H-FABP和手术后急性心肌损伤的关系
[0016] H-FABP用于早期检测心肌损伤还被延伸到心脏手术。在心脏手术中松开主动脉钳 夹后H-FABP血清浓度比CK-MB和TnT更早达到最高水平。Suzuki等人证明H-FABP在冠状 动脉患者释放主动脉交叉钳夹后47. 3±2分钟时达到最高值。Fransen等人表示围手术期 心肌损伤可从有各种心脏疾病和手术的患者再灌注后0. 5小时H-FABP释放进血浆诊断出 来。Hayashida等人发现H-FABP达到最高浓度的时间为松开主动脉钳夹后1. 4±0. 5小时， CK-MB为2. 5±0. 5小时而cTnT为6. 6±1. 3小时。Petzold等人早在再灌注开始后1小时 确定了平均最高水平。Fransen等人和Suzuki等人也提到了这点，他们报告说围手术期心 肌梗塞患者的一个H-FABP水平模型等于常见病例。Petzold等人和Fransen等人关于"上 升和下降模型"修改的观察报告已被其他作者证实。Adams表示，在心肌损伤的情况下，每个 标志蛋白质都有一个典型的浓度模型，而且在缺少这种模型的情况下高血清水平可能导致 假阳性结果。Fransen等人指出在一组接受非体外循环手术的冠状动脉疾病患者中H-FABP 血清水平好像不受手术创伤的影响。
[0017]Hanegawa等人证明在他们的研究中，儿童手术前基线血清H-FABP水平（平均值= 4. 3±0. 2ng/ml)与以前报道的成年患者的（平均值=3. 8±0. 2ng/ml)相似。另一方面， 心肌损伤后儿童患者的血清最高H-FABP水平比成年患者更易升高。在Hanegawa的文章 中接受外科手术不包括心室切开术的儿童的血清最高H-FABP水平在48和1，200ng/ml之 间变化（平均值=260±25. 7ng/ml)，但是Suzuki等人报告说成人的水平范围是64. 9? 139. 0ng/ml(平均值=93. 2±5. 4ng/ml)。Toyoda等人暗示血清H-FABP在儿科心脏手术松 开主动脉钳夹后1小时达到最高水平。普遍认为H-FABP释放量反映心肌损伤的程度。 【
【发明内容】
】
[0018] 为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种检测灵敏度高，检测线性范围大，且 检测简单快速，操作性好的心型脂肪酸结合蛋白检测试剂。
[0019] 本发明的第二目的在于提供一种心型脂肪酸结合蛋白检测试剂的制备方法。
[0020] 为实现上述第一目的，本发明采取的技术方案为：一种心型脂肪酸结合蛋白检测 试剂，其由试剂一和试剂二配合而成，其中，所述试剂一和试剂二的体积比为5 : 1;所述试 剂一中包括：20?50mmol/L的缓冲液、2%w/v的促凝剂、2%w/v的BSA、0. 1 %?0? 5%w/ v的防腐剂；所述试剂二中包括：0. 1%?0. 5%w/v标记有抗人H-FABP抗体的胶体金颗粒、 2%?5%w/v的稳定剂、20?50mmol/L的缓冲液、0? 1%?0? 5%w/v的防腐剂，所述标记 有抗人H-FABP抗体的胶体金颗粒的直径为60nm?90nm。
[0021] 本发明的心型脂肪酸结合蛋白检测试剂进一步为：所述试剂一和试剂二中的缓冲 液具体为含有〇. 5%?5. 0%w/vBSA的Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸盐缓冲液或 甘氨酸缓冲液中的一种或几种。
[0022] 本发明的心型脂肪酸结合蛋白检测试剂进一步为：所述试剂一、试剂二的pH值为 7. 0 ?9. 0〇
[0023] 本发明的心型脂肪酸结合蛋白检测试剂进一步为：所述BSA浓度为1%w/v，试剂 一、试剂二的pH值为8. 0±0. 2。
[0024] 本发明的心型脂肪酸结合蛋白检测试剂进一步为：所述试剂一中的促凝剂为 PEG6000或&'ij-35中的至少任一种。
[0025] 本发明的心型脂肪酸结合蛋白检测试剂进一步为：所述试剂二中的胶体金颗粒直 径为75nm?85nm，颗粒含量为0. 08?0. 8mg/mL。
[0026] 本发明的心型脂肪酸结合蛋白检测试剂进一步为：所述胶体金颗粒含量为 0. 4mg/mT,n
[0027] 本发明的心型脂肪酸结合蛋白检测试剂还可为：所述标记有抗人H-FABP抗体为 具有不同免疫活性位点多个克隆株单抗的混合物。
[0028] 为实现上述第二目的，本发明采取的技术方案为：一种心型脂肪酸结合蛋白检测 试剂的制备方法，其包括如下步骤：
[0029]1)，将促凝剂、BSA和防腐剂加入到缓冲液，制得试剂一；
[0030] 2)，将氯金酸与柠檬酸三钠按照质量比1 : 1加热煮沸制得胶体金溶液；将 H-FABP抗体加入到胶体金溶液中，并加入稳定剂、缓冲液、防腐剂，制得试剂二；所述配置 氯金酸与柠檬酸三钠溶液时，使用〇. 2um滤膜过滤；
[0031]3)，将试剂一和试剂二按照5 : 1的体积比配合使用，即得心型脂肪酸结合蛋白检 测试剂。
[0032] 为实现上述第二目的，本发明采取的另一技术方案为：一种心型脂肪酸结合蛋白 检测试剂的制备方法，其包括如下步骤：
[0033](一），胶体金颗粒的制备
[0034] 1)将玻璃容器先用洗洁剂洗涤并用流水冲洗干净，然后用硅化试剂浸泡过夜，对 所用金属器皿的内表面做硅化处理，再用蒸馏水冲洗干净，备用；
[0035] 2)配制1 % (w/v)氯金酸和1 % (w/v)柠檬酸三钠溶液，使用0? 2um滤膜过滤；
[0036] 3)在清洗干净的1000ml圆底烧瓶中放入磁力搅拌子1枚，加入1000ml超纯水；
[0037] 4)加入浓度为1 % (w/v)氯金酸，600rpm高速搅拌，并加热至溶液沸腾，然后将 浓度为1 %柠檬酸钠溶液快速加入到烧瓶中，保持加热和剧烈搅拌l〇min，溶液颜色先变黑 色，然后逐渐变紫红色；
[0038] 5)冷却：关闭加热开关并继续搅拌lOmin，然后停止搅拌冷却至室温，用超纯水恢 复到原体积；
[0039](二），试剂一的制备
[0040]将Tris-HCl缓冲液、0? 9 %NaCl(w/v)、2 %BSA(w/v)、0? 1 %NaN3 (w/v)、0? 05 % Tween20(w/v)混合，并根据Tris的质量控制缓冲液的浓度，根据HC1的使用量来调整缓冲 液的pH值；
[0041](三），标记有抗人H-FABP抗体的胶体金颗粒的制备
[0042] 取1毫升制备好的胶体金液体加入到1. 5毫升的离心管内；
[0043] 用10%的碳酸钾溶液将离心管内的胶体金溶液调至pH8?10之间；
[0044] 将抗体到上述的离心管中，震荡30分钟；
[0045] 向上述溶液中加入lOOullO%的NaCl溶液，混匀，静置2h后观察各管是否有颜 色改变或者沉淀析出，当无颜色改变和无沉淀析出表明加入的抗体分子小于蛋白最大需求 量；
[0046] 将500ml胶体金溶液加入三角瓶中，边搅拌边用10 %的碳酸钾调整溶液的pH值至 8?10,并用pH试纸检测调整过程；
[0047] 将确定的抗体用量加入到上述溶液中，继续搅拌30分钟，超滤收集标记物；
[0048](四），试剂二的制备
[0049]将Tris-HCl缓冲液、0? 9 % (w/v)NaCl、2 % (w/v)BSA、0. 1 % (w/v)NaN3、0. 05 % (w/v)Tween20,5% (w/v)鹿糖或海藻糖，2% (w/v)甘氨酸，2% (w/v)PEG6000以及步骤 (三）的标记物相混合制得试剂二；
[0050](五），将试剂一和试剂二按照5 : 1的体积比配合使用，即得肌钙蛋白I检测试 剂。
[0051] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0052] 1.本发明利用胶体金匀相颗粒特性，将特定的H-FABP抗体标记于胶体金颗粒表 面，当检测系统或检测环境中存在H-FABP时，胶体金颗粒表面的抗体即将与之对应的抗原 捕获，并形成抗原-抗体复合物，进而造成局部胶体金颗粒的聚合或堆积，使胶体金匀相试 剂透光光谱由红色向蓝色光谱移动，从而达到定量检测检体中H-FABP抗原的目的，同时避 免了同类检测项目乳胶增强免疫比浊法试剂在反应后产生胶乳微球交联物吸附比色杯不 易清洗的缺点。
[0053] 2.本发明可用于检测血清或血浆中H-FABP含量，适用于临床检测过程中使用的 分光光度计、半自动生化分析仪和全自动生化分析仪等仪器。
[0054] 3.本发明检测H-FABP的灵敏度可以达到20ng/mL，检测线性范围达10?1200ng/ mL，具有高分析灵敏度，高特异性等特点。 【【专利附图】
【附图说明】】
[0055] 图1是为不同颗粒大小的胶体金标记物校准曲线图。
[0056] 图2是本发明试剂与市售相关试剂分析线性比较图。 【【具体实施方式】】
[0057] 首先，需要说明的是，本发明中涉及的重量体积比记为"w/v"，单位为"g/mL"。
[0058] 本发明为一种心型脂肪酸结合蛋白检测试剂，其由试剂一和试剂二配合而成，其 中，所述试剂一和试剂二的体积比为5 : 1。
[0059] 所述试剂一中包括：20?50mmol/L的缓冲液、2%w/v的促凝剂、2%w/v的BSA、 0. 1%?0. 5%w/v的防腐剂。其中，所述试剂一的缓冲液具体为含有0. 5%?5. 0%w/vBSA 的Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸盐缓冲液或甘氨酸缓冲液中的一种或几种。所述 试剂一的pH值为7.0?9.0,优选的pH值为8.0±0.2。所述BSA浓度为1%w/v。所述促 凝剂为PEG6000或Brij-35中的至少任一种。
[0060] 所述试剂二中包括：0.1 %?0.5%w/v标记有抗人H-FABP抗体的胶体金颗粒、 2%?5%w/v的稳定剂、20?50mmol/L的缓冲液、0? 1%?0? 5%w/v的防腐剂。其中，所 述标记有抗人H-FABP抗体的胶体金颗粒的直径为60nm?90nm。所述试剂二的缓冲液具体 为含有0. 5%?5. 0%w/vBSA的Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸盐缓冲液或甘氨酸 缓冲液中的一种或几种。所述试剂二的pH值为7.0?9.0,优选的pH值为8. 0±0. 2。优 先的胶体金颗粒直径为75nm?85nm，颗粒不宜过小，否则会造成反应速度变慢；颗粒也不 宜过大，会造成标记物聚集沉降进一步影响测定结果。所述胶体金颗粒颗粒含量为0. 08? 0. 8mg/mL，优先的颗粒含量为0. 4mg/mL。所述标记有抗人H-FABP抗体为具有不同免疫活性 位点多个克隆株单抗的混合物。
[0061] 所述心型脂肪酸结合蛋白检测试剂的制备方法如下：
[0062]1)，将促凝剂、BSA和防腐剂加入到缓冲液，制得试剂一；
[0063] 2)，将氯金酸与柠檬酸三钠按照质量比1 : 1加热煮沸制得胶体金溶液；将 H-FABP抗体加入到胶体金溶液中，并加入稳定剂、缓冲液、防腐剂，制得试剂二；其中，配置 氯金酸与柠檬酸三钠溶液时，使用〇. 2um滤膜过滤；
[0064]3)，将试剂一和试剂二按照5:1的体积比配合使用，即得心型脂肪酸结合蛋白检 测试剂。
[0065] 以下为本发明的心型脂肪酸结合蛋白检测试剂的具体实施例。
[0066] 实施例一
[0067] 胶体金颗粒的制备（以下所有操作需在高洁净度无尘空间内完成）
[0068] 1)准备工作：所有用到的玻璃容器先用洗洁剂洗涤并用流水冲洗干净，然后用硅 化试剂浸泡过夜，对所用金属器皿的内表面做硅化处理，再用蒸馏水冲洗干净，备用；
[0069] 2)配制1%(w/v)氯金酸和1%(w/v)柠檬酸钠溶液，使用0? 2um滤膜过滤；
[0070] 3)在清洗干净的1000ml圆底烧瓶中放入磁力搅拌子1枚，加入1000ml超纯水；
[0071] 4)加入一定体积浓度为1% (w/v)氯金酸，600rpm左右高速搅拌，并加热至溶液沸 腾，然后迅速将一定体积浓度为1 %柠檬酸钠溶液快速加入到烧瓶中，保持加热和剧烈搅拌 lOmin，溶液颜色先变黑色，然后逐渐变紫红色；
[0072] 5)冷却：关闭加热开关并继续搅拌lOmin，然后停止搅拌冷却至室温，用超纯水恢 复到原体积；
[0073] 6)不同粒径的胶体金颗粒可根据加入氯金酸和柠檬酸钠的比例进行控制，最终以 电子粒度仪检测l〇mL胶体金溶液，以粒度仪显示结果为金颗粒的粒径结果使用。
[0074] 实施例二
[0075] 试剂一的制备
[0076]试剂一的配方如下：Tris-HCl缓冲液、0.9%NaCl(w/v)、2%BSA(w/v)、0. 1% NaN3(w/v)、0. 05%Tween20(w/v)，可根据Tris的质量控制缓冲液的浓度，根据HC1的使用 量来调整缓冲液的pH值。
[0077] 实施例三
[0078] 标记物的制备
[0079] 取1毫升制备好的胶体金液体加入到1. 5毫升的离心管内；
[0080] 用10%的碳酸钾溶液将离心管内的胶体金溶液调至pH8?10之间；
[0081] 将一定量抗体到上述的离心管中，震荡30分钟；
[0082] 向上述溶液中加入lOOullO%的NaCl溶液，混匀，静置2h后观察各管是否有颜 色改变或者沉淀析出，当无颜色改变和无沉淀析出表明加入的抗体分子小于蛋白最大需求 量；
[0083] 将500ml胶体金溶液加入三角瓶中，边搅拌边用10 %的碳酸钾调整溶液的pH值至 8?10,并用精密pH试纸检测调整过程；
[0084] 按所述的方法将确定的抗体用量加入到上述溶液中，继续搅拌30分钟，超滤收集 标记物。
[0085] 实施例四
[0086] 试剂二的制备
[0087] 试剂二缓冲液中溶解的生物大分子和化学物质为Tris-HCl缓冲液、0? 9% (w/v) NaCl、2% (w/v)BSA、0.1% (w/v)NaN3、0.05% (w/v)Tween20,5% (w/v)鹿糖或海藻糖，2% (w/v)甘氨酸，2% (w/v)PEG6000,本部分缓冲液配制同试剂一保持一致，再次不再赘述。 [0088] 将配制好的试剂儿缓冲溶液同超滤收集得到的标记物相混合，最终控制标记物金 颗粒浓度为〇. 4mg/mL即可。
[0089] 实施例五
[0090]校准品的制备
[0091] 将市售的人源H-FABP蛋白纯品用2% (w/v)BSA溶液溶解或稀释，制得1200ng/mL 校准品，使用时根据所需要浓度梯度用〇. 9% (w/v)NaCl稀释即可。
[0092] 实施例六
[0093] 不同颗粒度胶体金颗粒的选择
[0094] 根据以上实施例中胶体金颗粒的制备不同粒径的胶体金颗粒完成标记制得试剂 二，选择同一缓冲液浓度和pH进行实验。
[0095] 实验方法：
[0096] 将校准品、试剂一和试剂二按照体积比为3 : 250 : 50依次混合，37°C下充分反 应。
[0097]在7180全自动生化分析仪上记录540 ± 10nm处吸光度值。
[0098] 比较不同颗粒大小胶体金标记物校准曲线最终确定最佳颗粒大小。
[0099] 根据校准曲线（附图1)判断选择75nm?85nm范围的金颗粒较为合适，大颗粒分 析灵敏度较好但是易产生HOOK效应不利于检测，而小颗粒在高值区的分析能力却明显不 如75nm?85nm颗粒。
[0100] 本发明试剂与市售相关项目试剂分析线性比较
[0101] 试验方法：以一临床高值样本为例，将其倍比稀释如下梯度，分别用对照试剂和本 发明试剂检测，并拟合其线性，结果如附图2所示：
[0102] 表1线性数据结果
【权利要求】
1. 一种心型脂肪酸结合蛋白检测试剂，其特征在于：由试剂一和试剂二配合而成，其 中，所述试剂一和试剂二的体积比为5 : 1 ;所述试剂一中包括：20?50mmol/L的缓冲 液、2% w/v的促凝剂、2% w/v的BSA、0. 1 %?0. 5% w/v的防腐剂；所述试剂二中包括： 0. 1%?0. 5% w/v标记有抗人H-FABP抗体的胶体金颗粒、2%?5% w/v的稳定剂、20? 50mmol/L的缓冲液、0. 1%?0. 5% w/v的防腐剂，所述标记有抗人H-FABP抗体的胶体金颗 粒的直径为60nm?90nm。
2. 如权利要求1所述的心型脂肪酸结合蛋白检测试剂，其特征在于：所述试剂一和试 剂二中的缓冲液具体为含有〇. 5%?5. 0% w/vBSA的Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、硼 酸盐缓冲液或甘氨酸缓冲液中的一种或几种。
3. 如权利要求2所述的心型脂肪酸结合蛋白检测试剂，其特征在于：所述试剂一、试剂 二的pH值为7.0?9.0。
4. 如权利要求2所述的心型脂肪酸结合蛋白检测试剂，其特征在于：所述BSA浓度为 1% w/v，试剂一、试剂二的pH值为8. 0±0. 2。
5. 如权利要求1所述的心型脂肪酸结合蛋白检测试剂，其特征在于：所述试剂一中的 促凝剂为PEG6000或Brij-35中的至少任一种。
6. 如权利要求1所述的心型脂肪酸结合蛋白检测试剂，其特征在于：所述试剂二中的 胶体金颗粒直径为75nm?85nm，颗粒含量为0? 08?0? 8mg/mL。
7. 如权利要求6所述的心型脂肪酸结合蛋白检测试剂，其特征在于：所述胶体金颗粒 含量为〇. 4mg/mL。
8. 如权利要求1所述的心型脂肪酸结合蛋白检测试剂，其特征在于：所述标记有抗人 H-FABP抗体为具有不同免疫活性位点多个克隆株单抗的混合物。
9. 一种心型脂肪酸结合蛋白检测试剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤： 1) ，将促凝剂、BSA和防腐剂加入到缓冲液，制得试剂一； 2) ，将氯金酸与柠檬酸三钠按照质量比1 : 1加热煮沸制得胶体金溶液；将H-FABP抗 体加入到胶体金溶液中，并加入稳定剂、缓冲液、防腐剂，制得试剂二；所述配置氯金酸与柠 檬酸三钠溶液时，使用〇? 2um滤膜过滤； 3) ，将试剂一和试剂二按照5 : 1的体积比配合使用，即得心型脂肪酸结合蛋白检测试 剂。
10. -种心型脂肪酸结合蛋白检测试剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤： (一），胶体金颗粒的制备 1) 将玻璃容器先用洗洁剂洗涤并用流水冲洗干净，然后用硅化试剂浸泡过夜，对所用 金属器皿的内表面做硅化处理，再用蒸馏水冲洗干净，备用； 2) 配制1% (w/v)氯金酸和1% (w/v)柠檬酸三钠溶液，使用0. 2um滤膜过滤； 3) 在清洗干净的1000ml圆底烧瓶中放入磁力搅拌子1枚，加入1000ml超纯水； 4) 加入浓度为1% (w/v)氯金酸，600rpm高速搅拌，并加热至溶液沸腾，然后将浓度为 1 %柠檬酸钠溶液快速加入到烧瓶中，保持加热和剧烈搅拌l〇min，溶液颜色先变黑色，然后 逐渐变紫红色； 5) 冷却：关闭加热开关并继续搅拌lOmin，然后停止搅拌冷却至室温，用超纯水恢复到 原体积； (二） ，试剂一的制备 将 Tris-HCl 缓冲液、0.9 % NaCl(w/v)、2 % BSA(w/v)、0. 1 % NaN3(w/v)、0.05 % Tween20(w/v)混合，并根据Tris的质量控制缓冲液的浓度，根据HC1的使用量来调整缓冲 液的pH值； (三） ，标记有抗人H-FABP抗体的胶体金颗粒的制备 取1毫升制备好的胶体金液体加入到1. 5毫升的离心管内； 用10%的碳酸钾溶液将离心管内的胶体金溶液调至p!19?10之间； 将抗体到上述的离心管中，震荡30分钟； 向上述溶液中加入100 U 110 %的NaCl溶液，混匀，静置2h后观察各管是否有颜色改变 或者沉淀析出，当无颜色改变和无沉淀析出表明加入的抗体分子小于蛋白最大需求量； 将500ml胶体金溶液加入三角瓶中，边搅拌边用10 %的碳酸钾调整溶液的pH值至8? 10,并用pH试纸检测调整过程； 将确定的抗体用量加入到上述溶液中，继续搅拌30分钟，超滤收集标记物； (四） ，试剂二的制备 将 Tris-HCl 缓冲液、0.9% (w/v)NaCl、2% (w/v)BSA、0.1% (w/v)NaN3、0.05% (w/v) Tween20,5% (w/v)鹿糖或海藻糖,2% (w/v)甘氨酸,2% (w/v)PEG6000以及步骤（三）的 标记物相混合制得试剂二； (五） ，将试剂一和试剂二按照5 : 1的体积比配合使用，即得H-FABP检测试剂。
【文档编号】G01N33/531GK104330576SQ201410648637
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年11月17日 优先权日:2014年11月17日
【发明者】王会中 申请人:中国人民解放军第三0五医院