一种活体无损伤观察二色补血草盐腺的新方法
【专利摘要】本发明涉及一种活体无损伤观察二色补血草盐腺的新方法，包括如下步骤：首先，采用乙烯基聚硅氧烷树脂对二色补血草的叶片下表皮进行负向印记；其次，将聚合的环氧树脂涂抹在二色补血草叶片的负向印迹上，得叶片的正向印迹；最后，利用普通的光学显微镜和普通CCD照相设备，观察并记录叶片的正向印迹，得二色补血草叶片的生长形态图谱。与传统的指甲油、火棉胶相比，真正实现了无损伤活体观察，取完印迹后的叶片可以继续培养，实现对叶片发育的完整跟踪。本发明在其他植物叶片表皮的观察中同样有良好的观察效果(如模式植物拟南芥等)。各观察结果间可比性强，可准确反映出细胞的形状和行为对叶的形状的影响。
【专利说明】一种活体无损伤观察二色补血草盐腺的新方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞学领域，特别涉及一种活体无损伤观察二色补血草盐腺的新方法。
【背景技术】
[0002]在植物发育过程中，细胞的大小和形状对植物形态建成具有重要的贡献(Kim andSinha, 2003 ；Guimil and Dunand, 2006)。Tsukaya(2003)提出的细胞决定理论，则认为细胞是生物体的基本单位，也是器官发生和形态建成的单位，细胞的形状和行为决定了叶的形状。这种理论强调，叶的最终形状是细胞学水平各种状态的叠加，并在原有细胞理论的基础上增加了新内容，认为细胞的状态和行为之间存在着相互影响，特别是叶细胞数量和体积相互补偿。因此，研究植物发育过程中细胞数目和大小的变化对阐明植物发育过程中的细胞学基础理论具有十分重要的意义。
[0003]在细胞学、育种学以及植物生理学的研究过程中，经常需要测定叶下表皮气孔的分布、形状和大小等数据。许多研究者会直接撕取植物材料的表皮制成临时装片，在显微镜下观察，或采用印迹法，即在植物叶的表面涂抹火棉胶(或牛皮胶液)和醋酸纤维素胶液等，还有人利用指甲油(Ferris and Tayler, 1994 ;林月惠，1996 ;Berger andAltmann, 2000)和乒乓球制液(张秀芳等，2002)，胶体风干后凝成薄膜，此膜就印有表皮组织各细胞的界迹边痕及气孔结构。该种方法的优点是胶膜干燥速度快，缺点是薄膜太薄，在取下的过程中薄膜易拉伸变形。更重要是，上述方法都只能用于观察离体叶片，缺乏对同一叶片不同生长阶段形态信息的记录，导致各观察结果间可比性差，无法准确反映出细胞的形状和行为对叶的形状的影响。这些传统方法均是离体取材，对叶片产生了不可逆转的损害，无法实现叶片发育的连续观察，所以实现对叶片表皮结构的活体连续观察意义重大。
[0004]另外，现有的技术主要针对气孔等表皮结构展开，而本发明采用的二色补血草具有一种特有的表皮结构——盐腺，如何活体跟踪盐腺的发育成为了技术上的瓶颈问题。
【发明内容】
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[0005]针对上述问题，本发明采用活体叶片两次印迹，并可以针对同一叶片同一盐腺的生长变化进行观察，避免了传统的离体方法对叶片的损害。而且在对盐腺观察的基础上，可以应用到气孔和其他植物的表皮结构的观察。与传统的指甲油、火棉胶相比，真正实现了无损伤活体观察，取完印迹后的叶片可以继续培养，实现对叶片发育的完整跟踪。
[0006]为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
[0007]—种活体无损伤观察二色补血草盐腺的新方法，包括如下步骤:
[0008]I)将乙烯基聚硅氧烷树脂，涂抹在待测二色补血草的叶片下表皮，静置5-10min，挑起树脂，得二色补血草叶片的负向印记；
[0009]2)将取完印迹的待测二色补血草放回培养室继续培养I?2小时后，即可再次进行印迹，为待印迹二色补血草；
[0010]3)将聚合的环氧树脂涂抹在二色补血草叶片的负向印迹上，待凝固后，揭下涂层，得叶片的正向印迹，即完整的叶片复制体；
[0011]4)利用普通的光学显微镜和普通CXD照相设备，观察并记录叶片的正向印迹，即得二色补血草叶片下表皮形态图1;
[0012]5)取步骤2)中待印迹的二色补血草，在叶片的相同位置，重复步骤1)_4)，即得二色补血草叶片下表皮形态图1I ；
[0013]6)多次重复上述步骤1-5，即得二色补血草叶片表皮各结构的生长形态图谱。
[0014]进一步地，所述二色补血草叶片的下表皮包括表皮细胞、盐腺细胞、气孔。
[0015]优选的是，所述的二色补血草为萌发6?30天的二色补血草幼苗。
[0016]更优选的是，所述的二色补血草为萌发8?12天的二色补血草幼苗。
[0017]上述的方法在观察模式植物拟南芥叶片表皮方面有很好的应用(如图3所示)。
[0018]上述的方法在观察植物幼苗叶片表皮结构方面的应用。
[0019]本发明还提供了一种活体无损伤观察拟南芥叶片的新方法，包括如下步骤:
[0020]I)将乙烯基聚硅氧烷树脂，涂抹在待测拟南芥的叶片下表皮，静置5-10min，挑起树脂，得拟南芥叶片的负向印记；
[0021]2)将取完印迹的待测拟南芥放回培养室继续培养I?2小时后，即可再次进行印迹，为待印迹拟南芥；
[0022]3)将聚合的环氧树脂涂抹在拟南芥叶片的负向印迹上，待凝固后，揭下涂层，得叶片的正向印迹，即完整的叶片复制体；
[0023]4)利用普通的光学显微镜和普通CXD照相设备，观察并记录叶片的正向印迹，即得拟南芥叶片下表皮形态图1;
[0024]5)取步骤2)中待印迹的拟南芥，在叶片的相同位置，重复步骤1)_4)，即得拟南芥叶片下表皮形态图1I。
[0025]6)多次重复上述步骤1-5，即得拟南芥叶片的生长形态图。
[0026]进一步地，所述拟南芥叶片的下表皮包括表皮细胞、气孔。
[0027]优选的是，所述的拟南芥为萌发6?30天的拟南芥幼苗。
[0028]更优选的是，所述的拟南芥为萌发8?12天的拟南芥幼苗。
[0029]本发明还提供了一种活体无损伤观察植物幼苗叶片下表皮结构的新方法，包括如下步骤:
[0030]I)将乙烯基聚硅氧烷树脂，涂抹在待测植物幼苗的叶片下表皮，静置，待树脂变硬后，
[0031]挑起树脂，得二色补血草叶片的负向印记；
[0032]2)将取完印迹的待测植物幼苗放回培养室继续培养I?2小时后，即可再次进行印迹，为待印迹植物幼苗；
[0033]3)将聚合的环氧树脂涂抹在植物幼苗叶片的负向印迹上，待凝固后，揭下涂层，得叶片的正向印迹，即完整的叶片复制体；
[0034]4)利用普通的光学显微镜和普通CXD照相设备，观察并记录叶片的正向印迹，即得植物幼苗叶片下表皮形态图1;
[0035]5)取步骤2)中待印迹的二色补血草，在叶片的相同位置，重复步骤1)-4)，即得植物幼苗叶片下表皮形态图1I。
[0036]6)多次重复上述步骤1-5，即得植物幼苗叶片表皮各结构的生长形态图谱。
[0037]本发明有益的效果是:
[0038]1.本发明与传统的指甲油、火棉胶相比，真正实现了无损伤活体观察，取完印迹后的叶片可以继续培养，实现对叶片发育的完整跟踪。第一次负向印迹采用的树脂是“乙烯基聚硅氧烷树脂”，在医学中一般用于牙科的印模，具有可渗透性好、精细程度高和无损害性的优点，本发明首次将其用于植物叶片，能够保证对叶片进行的是活体观察，即不需要将叶片取下，直接在生长的叶片上进行操作，取下树脂印迹后叶片还可以继续生长，而叶片表皮此时的发育状态就完全印迹在树脂上，所以该“乙烯基聚硅氧烷树脂”与普通的指甲油、火棉胶相比，最大的优势是获得叶片印迹后，叶片可以继续放回培养，可以针对同一个叶片进行连续的跟踪观察，对于观察叶片的分化有重要作用。而普通的指甲油、火棉胶处理后的叶片已经死亡，无法对叶片进行连续的跟踪观察。
[0039]2.本发明通过两次印迹获得了叶片复制体，与常规的一次印迹后的胶膜相比，其突出的特点和优势是，采用的两种树脂连续印迹方法，获得的是叶片的正向印迹，观察植物叶片的结构和发育时更加直观。传统对叶片的印迹观察采用的是一次印迹，获得的是负向印迹，本发明巧妙的利用了两种不同的树脂材料进行两次印迹，实现了叶片的正向印迹观察。
[0040]3.本发明不仅适用于二色补血草盐腺及表皮结构的观察，而且在其他植物的表皮，如模式植物拟南芥中，同样有较好的观察效果，可以清楚的观察到拟南芥的气孔和表皮细胞等结构(图3)。
[0041]4.本发明通过对同一叶片不同生长阶段形态信息的连续记录，实现了无损伤活体观察，各观察结果间可比性强，可准确反映出细胞的形状和行为对叶的形状的影响以及二色补血草的盐腺幼苗时期的生长状况和变化规律。
【专利附图】
【附图说明】
[0042]图1 二色补血草活体无损伤观察盐腺的流程图
[0043]图2利用两次印迹法观察二色补血草盐腺
[0044]图3利用两次印迹法观察拟南芥叶片表皮
【具体实施方式】
[0045]下面结合附图对本发明进行进一步的阐述。应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
[0046]实施例1:
[0047]实验材料:二色补血草(Limonium bicolor)萌发6天的幼苗,观察真叶的发育。
[0048]实验试剂:乙烯基聚硅氧烷(树脂材料)，聚合的环氧树脂。(皆为市售产品)
[0049]实验仪器:普通光学显微镜，普通CXD照相设备。
[0050]实验步骤:
[0051]I)将乙烯基聚硅氧烷树脂，涂抹在二色补血草的叶片下表皮，静置7.5min，利用注射器的尖头将树脂挑起，得二色补血草叶片的负向印记；
[0052]2)将步骤I)中取完印迹的二色补血草放回培养室继续培养1.5h，使叶片继续生长分化，即可再次进行印迹，记为待印迹二色补血草；
[0053]3)将环氧树脂AB胶水涂抹在二色补血草叶片的负向印迹上，待凝固后，揭下涂层，得叶片的正向印迹，即完整的叶片复制体；
[0054]4)利用普通的光学显微镜和普通CXD照相设备，观察并记录叶片的正向印迹，即得二色补血草叶片下表皮形态图1;
[0055]5)取步骤2)中待印迹的二色补血草，在叶片的相同位置，重复步骤1)_4)，即得二色补血草叶片下表皮形态图1I。
[0056]6)每隔1.5h重复上述步骤I)-5)，即得二色补血草叶片表皮各结构的生长形态图
-1'TfeP曰。
[0057]实施例2:
[0058]实验材料:二色补血草(Limonium bicolor)萌发30天的幼苗,观察真叶的发育。
[0059]实验试剂:乙烯基聚硅氧烷(树脂材料)，聚合的环氧树脂。(皆为市售产品)
[0060]实验仪器:普通光学显微镜，普通CXD照相设备。
[0061]实验步骤:
[0062]I)将乙烯基聚硅氧烷树脂，涂抹在二色补血草的叶片下表皮，静置lOmin，利用注射器的尖头将树脂挑起，得二色补血草叶片的负向印记；
[0063]2)将步骤I)中取完印迹的二色补血草放回培养室继续培养2h，即可再次进行印迹，记为待印迹二色补血草；
[0064]3)将无色指甲油涂抹在二色补血草叶片的负向印迹上，待凝固后，揭下涂层，得叶片的正向印迹，即完整的叶片复制体；
[0065]4)利用普通的光学显微镜和普通CXD照相设备，观察并记录叶片的正向印迹，即得二色补血草叶片下表皮形态图1;
[0066]5)取步骤2)中待印迹的二色补血草，在叶片的相同位置，重复步骤1)_4)，即得二色补血草叶片下表皮形态图1I。
[0067]6)每隔2h重复上述步骤1)-5)，即得二色补血草叶片表皮各结构的生长形态图
-1'TfeP曰。
[0068]实施例3:
[0069]实验材料:二色补血草(Limonium bicolor)萌发10天的幼苗,观察真叶的发育。
[0070]实验试剂:乙烯基聚硅氧烷(树脂材料)，聚合的环氧树脂。(皆为市售产品)
[0071]实验仪器:普通光学显微镜，普通CXD照相设备。
[0072]实验步骤:
[0073]I)将乙烯基聚硅氧烷树脂，涂抹在二色补血草的叶片下表皮，静置5min，利用注射器的尖头将树脂挑起，得二色补血草叶片的负向印记；
[0074]2)将步骤I)中取完印迹的二色补血草放回培养室继续培养lh，即可再次进行印迹，记为待印迹二色补血草；
[0075]3)将环氧树脂AB胶水涂抹在二色补血草叶片的负向印迹上，待凝固后，揭下涂层，得叶片的正向印迹，即完整的叶片复制体；
[0076]4)利用普通的光学显微镜和普通CXD照相设备，观察并记录叶片的正向印迹，即得二色补血草叶片下表皮形态图1;
[0077]5)取步骤2)中待印迹的二色补血草，在叶片的相同位置，重复步骤1)_4)，即得二色补血草叶片下表皮形态图1I。
[0078]6)每隔Ih重复上述步骤1)_5)，即得二色补血草叶片表皮各结构的生长形态图
-1'TfeP曰。
[0079]实施例4:
[0080]实验材料:二色补血草(Limonium bicolor)萌发20天的幼苗,观察真叶的发育。
[0081]实验试剂:乙烯基聚硅氧烷(树脂材料)，聚合的环氧树脂。(皆为市售产品)
[0082]实验仪器:普通光学显微镜，普通CXD照相设备。
[0083]实验步骤:
[0084]I)将乙烯基聚硅氧烷树脂，涂抹在二色补血草的叶片下表皮，待树脂变硬后，利用注射器的尖头将树脂挑起，得二色补血草叶片的负向印记；
[0085]2)将步骤I)中取完印迹的二色补血草放回培养室继续培养1.5h，即可再次进行印迹，记为待印迹二色补血草；
[0086]3)将环氧树脂AB胶水涂抹在二色补血草叶片的负向印迹上，待凝固后，揭下涂层，得叶片的正向印迹，即完整的叶片复制体；
[0087]4)利用普通的光学显微镜和普通CXD照相设备，观察并记录叶片的正向印迹，即得二色补血草叶片下表皮形态图1;
[0088]5)取步骤2)中待印迹的二色补血草，在叶片的相同位置，重复步骤1)_4)，即得二色补血草叶片下表皮形态图1I。
[0089]6)每隔1.5h重复上述步骤I)-5)，即得二色补血草叶片表皮各结构的生长形态图
-1'TfeP曰。
[0090]实施例5:
[0091]实验材料:拟南芥萌发15天的幼苗，观察真叶的发育。
[0092]实验试剂:乙烯基聚硅氧烷(树脂材料)，聚合的环氧树脂。(皆为市售产品)
[0093]实验仪器:普通光学显微镜，普通CXD照相设备。
[0094]实验步骤:
[0095]I)将乙烯基聚硅氧烷树脂，涂抹在拟南芥的叶片下表皮，静置7.5min，挑起树脂，得拟南芥叶片的负向印记；
[0096]2)将步骤I)中取完印迹的拟南芥放回培养室继续培养1.5小时，即可再次进行印迹，记为待印迹拟南芥；
[0097]3)将无色指甲油涂抹在拟南芥叶片的负向印迹上，待凝固后，揭下涂层，得叶片的正向印迹，即完整的叶片复制体；
[0098]4)利用普通的光学显微镜和普通CXD照相设备，观察并记录叶片的正向印迹，即得拟南芥叶片下表皮形态图1;
[0099]5)取步骤2)中待印迹的拟南芥，在叶片的相同位置，重复步骤1)_4)，即得拟南芥叶片下表皮形态图1I。
[0100]6)每隔1.5h重复上述步骤I)-5)，即得拟南芥叶片表皮各结构的生长形态图谱。
[0101]上述虽然对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
【权利要求】
1.一种活体无损伤观察二色补血草盐腺的新方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)将乙烯基聚硅氧烷树脂，涂抹在待测二色补血草的叶片下表皮，静置5-10min，挑起树脂，得二色补血草叶片的负向印记； 2)将取完印迹的待测二色补血草放回培养室继续培养I?2小时后，即可再次进行印迹，为待印迹二色补血草； 3)将聚合的环氧树脂涂抹在二色补血草叶片的负向印迹上，待凝固后，揭下涂层，得叶片的正向印迹，即完整的叶片复制体； 4)利用普通的光学显微镜和普通CCD照相设备，观察并记录叶片的正向印迹，即得二色补血草叶片下表皮形态图1; 5)取步骤2)中待印迹的二色补血草，在叶片的相同位置，重复步骤1)_4)，即得二色补血草叶片下表皮形态图1I ； 6)多次重复上述步骤I)_5)，即得二色补血草叶片表皮各结构的生长形态图谱。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二色补血草叶片的下表皮包括表皮细胞、盐腺细胞、气孔。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的二色补血草为萌发6?30天的二色补血草幼苗。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的二色补血草为萌发8?12天的二色补血草幼苗。
5.权利要求1所述的方法在观察模式植物拟南芥叶片表皮结构方面的应用。
6.权利要求1所述的方法在观察植物幼苗叶片表皮结构方面的应用。
【文档编号】G01N21/84GK104359909SQ201410677157
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月21日 优先权日:2014年11月21日
【发明者】袁芳, 王宝山 申请人:山东师范大学