用于检测猪组织中赭曲霉毒素a的预处理试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于检测猪组织中赭曲霉毒素A的预处理试剂盒，其特征在于：包括缓冲液、提取液1、提取液2、IAC柱、淋洗液和洗脱液。本发明还提供了利用所述预处理试剂盒进行猪组织中赭曲霉素A检测的方法，其特征在于用所述试剂盒对猪组织进行预处理后，在一定的液谱和质谱条件下经液质联用技术，对赭曲霉素A进行定量检测。本发明提供的试剂盒和方法具有检测限低、灵敏度高的特点，具有较高的稳定性、精密度和准确性。
【专利说明】用于检测猪组织中赭曲霉毒素 A的预处理试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品化学检测领域，特别涉及一种用于检测猪组织中赭曲霉毒素A的 预处理试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 赭曲霉素A (Ochratoxin Α，0ΤΑ)是曲霉属和青霉属菌产生的一类毒性化合物，常 常污染食品和饲料。OTA在世界范围造成经济损失居毒枝菌素的第二位，仅次于黄曲霉毒 素。赭曲霉毒素具有致畸、致癌、致突变、免疫学毒性等毒性，国际癌症研究机构（IARC)将 赫曲霉毒素A定为2B类致癌物。赭曲霉毒素主要靶器官是肾脏，能引起肾脏疾病。动物试 验表明，赭曲霉毒素A可导致实验动物肝肾损害，诱发肝肾肿瘤，造成肾肿大；也可造成肠 炎、淋巴坏疽、肝肿大等疾病。
[0003] 赫曲霉毒素A在谷物中自然广生，特别在大麦中广泛存在，一般易感染赫曲霉毒 素A的食品包括：大?、绿?、咖啡?、酒、甸甸汁、调味品、早本植物等。动物吃了含赫曲霉 毒素A的饲料后会导致体内赫曲霉毒素A蓄积，因此在动物性食品中，尤其是猪的肾脏、肝 脏、肌肉、血液等中常有赫曲霉毒素A被检出；人们通过食用被赭曲霉毒素A污染的食品， 从而将赭曲霉毒素A引入人体，造成毒性伤害。随着对赭曲霉毒素A危害的深入研究，公众 逐渐认识到对社会经济和人类健康造成严重的威胁，各国政府对药品食品中赭曲霉毒素A 的分布及检测也给与了极大的关注，世界粮农组织和世界卫生组织食品添加剂专家委员会 (The Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, JECFA)经过对是赫曲霉毒素 A毒性的评价后，将是赭曲霉毒素A每周的最大耐受摄入量定为0. lug · kg-1。美国、欧盟 和我国对食品、饲料中的是赭曲霉毒素A制定了严格的限量标准。
[0004] 我国在食品方面已相继出台了很多霉菌毒素的法定标准（参见GB2715-2005食品 中真菌毒素限量[s]和GB2761-2011食品中真菌毒素限量[S]，但对赭曲霉毒素A在食品中 的检查仅限于谷物及其制品、豆类及其制品，猪组织中赭曲霉毒素A无标准出台。
[0005] 因此，急需开发猪组织中赭曲霉毒素A残留的高效测定方法。
【发明内容】
[0006] 鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供一种用于猪组织的预处理试剂盒，以及利 用该试剂盒连同色谱净化超高液相色谱-串联质谱测定猪组织中赭曲霉毒素A的方法。该 试剂盒和方法可用于猪组织中赭曲霉毒素A残留的测定，为拟定食品中赭曲霉毒素A的标 准提供技术服务。
[0007] 本发明的技术方案如下：
[0008] -种用于检测猪组织中赭曲霉毒素A的预处理试剂盒，其特征在于：包括缓冲液、 提取液1、提取液2、IAC柱、淋洗液和洗脱液；
[0009] 所述缓冲液为lmol/L的磷酸溶液；
[0010] 所述提取液1为乙酸乙酯；
[0011] 所述提取液2为0· 5mol/L、ρΗ8· 4的碳酸氢钠溶液；
[0012] 所述淋洗液为150g氯化钠、2. 5g碳酸氢钠溶于水中，加0. Iml吐温-20并用水定 容至IL获得的溶液；
[0013] 所述洗脱液为甲醇：乙酸（V: V) = 49:1的甲醇/乙酸混合液。
[0014] 一种检测猪组织中赭曲霉素A的方法，包括如下步骤：
[0015] (1)获取标准曲线：
[0016] a.将赭曲霉毒素A标准品溶于体积比为99:1的冰醋酸：苯配制成1 μ g/mL的OTA 标准品储备液；
[0017] b.将OTA标准品储备液用色谱流动相溶液稀释成不同浓度的系列OTA标准溶液；
[0018] c.将空白样品猪组织进行匀浆处理，并利用所述的试剂盒对空白样品猪组织匀浆 进行预处理：
[0019] i.并准确称取2. Og空白样品猪组织匀浆，加入0. 6ml缓冲液中，涡旋混匀后，用 5ml提取液1提取3次，再用5ml提取液2提取2次；
[0020] ii.所得提取后的溶液再经缓冲液调节pH至6. 8-8. 0,然后将所得溶液通过IAC 柱；
[0021] iii.用IOml淋洗液淋洗，3ml洗脱液洗脱；
[0022] iv.收集洗脱后的溶液，用氮气吹干获得空白样品产物；
[0023] d.将上述系列OTA标准溶液分别注入空白样品产物中，获得系列梯度浓度的标准 曲线溶液；
[0024] e.取10 μ 1上述系列梯度浓度的标准曲线溶液进行超高液相色谱-串联质谱仪检 测，以标准曲线溶液中的OTA浓度为横坐标，定量离子峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；
[0025] (2)检测待测样品：
[0026] a.采集待测猪组织进行匀浆处理；
[0027] b.利用权利要求1所述的试剂盒按照第（1)步中c部分i?iv所述的步骤对待 测猪组织匀浆进行预处理，将氮气吹干后的待测样品产物溶于Iml色谱流动相溶液获得供 试品溶液；
[0028] c.将10 μ 1供试品溶液进行超高液相色谱-串联质谱仪检测，将测得定量离子峰 面积代入上述标准曲线可获得供试品溶液中OTA的浓度。
[0029] 所述色谱流动相溶液由A相和B相组成，A相为乙腈，B相为5mM醋酸铵0. 01%甲 酸水溶液；流动相流速为：〇. 35ml/min采用梯度洗脱，按表1所示参数进行。
[0030] 所述超高液相色谱-串联质谱仪在检测时的色谱条件为：采用粒径为I. 7um，柱内 径2. 1mm，柱长为IOOmm的C18柱；质谱条件为：电喷雾离子化源ESI源，质谱参数如表2所 示：
[0031] 表1.流动相梯度
[0032]
【权利要求】
1. 一种用于检测猪组织中赫曲霉毒素 A的预处理试剂盒，其特征在于：包括缓冲液、提 取液1、提取液2、IAC柱、淋洗液和洗脱液； 所述缓冲液为Imol/L的磯酸溶液； 所述提取液1为己酸己醋； 所述提取液2为0. 5mol/L、P服.4的碳酸氨轴溶液； 所述淋洗液为150g氯化轴、2. 5g碳酸氨轴溶于水中，加0. 1ml吐温-20并用水定容至 1L获得的溶液； 所述洗脱液为甲醇：己酸（V:V) = 49:1的甲醇/己酸混合液。
2. -种检测猪组织中赫曲霉素 A的方法，包括如下步骤： (1) 获取标准曲线： a. 将赫曲霉毒素 A标准品溶于体积比为99:1的冰醋酸：苯配制成1 y g/mL的0TA标 准品储备液； b. 将0TA标准品储备液用色谱流动相溶液稀释成不同浓度的系列0TA标准溶液； C.将空白样品猪组织进行匀浆处理，并利用权利要求1所述的试剂盒对空白样品猪组 织匀浆进行预处理： i. 并准确称取2. Og空白样品猪组织匀浆，加入0. 6ml缓冲液中，润旋混匀后，用5ml提 取液1提取3次，再用5ml提取液2提取2次； ii. 所得提取后的溶液再经缓冲液调节抑至6. 8-8. 0,然后将所得溶液通过IAC柱； iii. 用10ml淋洗液淋洗，3ml洗脱液洗脱； iv. 收集洗脱后的溶液，用氮气吹干获得空白样品产物； d. 将上述系列0TA标准溶液分别注入空白样品产物中，获得系列梯度浓度的标准曲线 溶液； e. 取10 y 1上述系列梯度浓度的标准曲线溶液进行超高液相色谱-串联质谱仪检测， W标准曲线溶液中的0TA浓度为横坐标，定量离子峰面积为纵坐标，绘制标准曲线； (2) 检测待测样品： a. 采集待测猪组织进行匀浆处理； b. 利用权利要求1所述的试剂盒按照第（1)步中C部分i?iv所述的步骤对待测猪 组织匀浆进行预处理，将氮气吹干后的待测样品产物溶于1ml色谱流动相溶液获得供试品 溶液； C.将10 y 1供试品溶液进行超高液相色谱-串联质谱仪检测，将测得定量离子峰面积 代入上述标准曲线可获得供试品溶液中0TA的浓度。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述色谱流动相溶液由A相和B相组成， A相为己膳，B相为5mM醋酸馈0. 01%甲酸水溶液；流动相流速为；0. 35ml/min采用梯度洗 脱，按表1所示参数进行。
4. 根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述超高液相色谱-串联质谱仪在检 测时的色谱条件为；采用粒径为1. 7um，柱内径2. 1mm，柱长为100mm的柱；质谱条件为： 电喷雾离子化源ESI源，质谱参数如表2所示： 表1.流动相梯度
5. 权利要求1所述的预处理试剂盒的制备方法，包括如下步骤；配制Imol/L的磯酸溶 液作为缓冲液；W己酸己醋作为提取液1 ;配制0. 5mol/L、P服.4的碳酸氨轴溶液作为提取 液2 ;将150g氯化轴、2. 5g碳酸氨轴溶于水中，加入0. 1ml吐温-20并用水定容至1L配制 得到淋洗液；按体积比49:1配制甲醇：己酸溶液作为洗脱液；上述溶液连同IAC柱一起组 装成所述试剂盒。
6. 权利要求1所述的预处理试剂盒在检测猪组织中赫曲霉素 A方面的应用。
【文档编号】G01N30/02GK104391057SQ201410682086
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月24日 优先权日:2014年11月24日
【发明者】米自由, 何义刚, 侯亚莉, 苏亮, 丁平, 李玉平, 周莉 申请人:重庆市动物疫病预防控制中心