一种检测禽流感病毒的表面增强拉曼光谱基底物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测禽流感病毒的表面增强拉曼光谱基底物及其应用。本发明所提供的应用具体为偶联有α(2，3)唾液酸寡糖的纳米金颗粒在作为用于检测禽流感病毒的表面增强拉曼光谱基底物中的应用。实验证明，该基底物可以特异的捕获待检样品中的禽流感病毒，通过离心收集，即可实现样品中禽流感病毒的富集，进而用于SERS光谱检测。由于病毒富集有效去除了样品杂质导致的干扰波峰，而且纳米金颗粒可有效放大光谱信号，因此该基底物可用于禽流感病毒的SERS光谱检测。该基底物对禽流感病毒的快速检测和鉴别具有重要意义。
【专利说明】一种检测禽流感病毒的表面增强拉曼光谱基底物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于病毒检测领域，涉及一种检测禽流感病毒的表面增强拉曼光谱基底物 及其应用。
【背景技术】
[0002] 1928年印度物理学家C. V. Raman发现当单色光入射到样品以后，样品中的分子 会对入射光产生散射，散射光除了有与入射光频率相同的谱线外，还存在发生位移的谱线， 我们称这种散射为拉曼（Raman)散射。拉曼光谱属于分子转动和振动光谱范畴，现有的 分子结构信息大多是从分子光谱学中获得的。因此拉曼光谱学在物理、化学、生命科学、 医学、材料科学等领域有重要的应用价值。但是自发拉曼散射信号很弱，因此限制了其应 用。当一些分子吸附于或靠近某些粗糙的金属表面时，他们的拉曼信号强度会增加IO2-IO7倍，这种拉曼信号强度显著增强的现象称为表面增强拉曼散射（Surface-enhanced Raman Scattering，SERS)效应。SERS光谱以其高分辨率、高灵敏度、溶液干扰性小、稳定性好等特 点在很多领域得到了应用。
[0003] 实验证明，出现SERS效应现象的金属材料只有少数几种，目前已经发现能产生 SERS效应的有贵金属金、银、铜等和一些常用的过渡金属（如铁、钴、镍）等。金属电极是最 早研究的一项SERS基底制备技术，也是目前技术相对成熟、使用范围较为广泛的衬底制备 技术。贵金属溶胶颗粒法也是一种较常用的SERS基底制备方法。此样品优点是可以较长 时间放置在空气中，而且比较稳定，比金属电极活性衬底具有更广阔的使用范围。好的基底 的选择和制备是获得SERS信号的前提。
[0004] 禽流感病毒是一种以野禽为天然宿主的RNA病毒，可以感染家禽，是影响我国养 禽业最为严重的病毒，每年导致经济损失达数百亿元。禽流感病毒偶尔也会感染人，1918年 的西班牙大流感造成了超过4千万人的死亡，后证明该病毒来源于禽流感病毒，1997年和 2003年的H5N1病毒以及2013年的H7N9病毒导致我国上百人死亡，也都是禽流感病毒。可 见，禽流感病毒对家禽业养殖业和人类健康构成极大的威胁。表面增强拉曼光谱技术可被 应用于禽流感病毒的检测，然而由于待检测的临床样品多为粪便或泄殖腔拭子，样品成分 复杂，而且病毒含量较低，因此SERS光谱的杂峰会掩盖有效波峰，造成假阴性结果。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供偶联有a (2, 3)唾液酸寡糖的纳米金颗粒的一种新用 途。
[0006] 本发明所提供的偶联有a (2, 3)唾液酸寡糖的纳米金颗粒的新用途，具体为偶联 有a (2, 3)唾液酸寡糖的纳米金颗粒在作为用于检测禽流感病毒的表面增强拉曼光谱基 底物中的应用。
[0007] 本发明的另一个目的是提供一种利用表面增强拉曼光谱检测或辅助检测待测样 品中是否含有禽流感病毒的试剂盒。
[0008] 本发明所提供的利用表面增强拉曼光谱检测或辅助检测待测样品中是否含有禽 流感病毒的试剂盒，含有偶联有a (2, 3)唾液酸寡糖的纳米金颗粒和说明书；
[0009] 所述说明书中记载有如下内容：
[0010] 用所述偶联有a (2,3)唾液酸寡糖的纳米金颗粒检测待测样品中是否含有禽流 感病毒的方法，包括如下步骤：
[0011] (al)实验组：将所述表面增强拉曼光谱基底物与待测样品按照10:1的体积比进 行混合，20-25°C (如25°C )静置IOmin ;8000g离心30min，取沉淀用PBS (pH7. 4)重悬后进 行表面增强拉曼光谱检测；
[0012] 其中，"离心-PBS重悬"的步骤可以重复操作一次；重悬沉淀所用的PBS的量均可 为所述待测样品的10倍体积用量。
[0013] 所述PBS的溶剂为水，溶质及浓度如下：0. 274M氯化钠，0. 005M氯化钾，0. 012M磷 酸氢二钠，〇. 004M磷酸二氢钾，pH7. 4。
[0014] 对照组：与所述实验组相比，仅将所述待测样品替换为等量的水，其余均相同；
[0015] (a2)根据步骤（al)的检测结果，按照如下确定所述待测样品中是否含有禽流感 病毒：若所述实验组的表面增强拉曼光谱信号强于所述对照组的表面增强拉曼光谱信号， 则所述待测样品中含有或候选含有禽流感病毒；若所述实验组的表面增强拉曼光谱信号不 强于所述对照组的表面增强拉曼光谱信号，则所述待测样品中不含有或候选不含有禽流感 病毒
[0016] 在实际应用中，判断所述实验组的表面增强拉曼光谱信号和所述对照组的表面增 强拉曼光谱信号的强弱具体可根据表面增强拉曼光谱图的峰高进行确定。具体如下：若所 述实验组的表面增强拉曼光谱图的峰高高于相同拉曼位移下所述对照组的表面增强拉曼 光谱图的峰高，则所述实验组的表面增强拉曼光谱信号强于所述对照组的表面增强拉曼光 谱信号；反之，则所述实验组的表面增强拉曼光谱信号不强于所述对照组的表面增强拉曼 光谱信号。
[0017] 所述（al)中，进行所述表面增强拉曼光谱检测时的参数具体如下：拉曼测定功率 为80mW，波长为785nm，积分时间为20s ;
[0018] 在本发明中，步骤（al)中进行所述表面增强拉曼光谱检测时采用的仪器具体为 RamTracer-200-HS高灵敏度激光拉曼光谱仪。
[0019] 在如上所述应用或试剂盒中，所述偶联有a (2, 3)唾液酸寡糖的纳米金颗粒为在 表面通过S-Au共价键连接了式I所示化合物和式II所示化合物的金纳米颗粒：
[0020] 式 I :
【权利要求】
1. 偶联有a(2, 3)唾液酸寡糖的纳米金颗粒在作为用于检测禽流感病毒的表面增强 拉曼光谱基底物中的应用。
2. -种利用表面增强拉曼光谱检测或辅助检测待测样品中是否含有禽流感病毒的试 剂盒，含有偶联有a(2, 3)唾液酸寡糖的纳米金颗粒和说明书； 所述说明书中记载有如下内容： 用所述偶联有a(2,3)唾液酸寡糖的纳米金颗粒检测待测样品中是否含有禽流感病 毒的方法，包括如下步骤： (al)实验组：将所述偶联有a(2,3)唾液酸寡糖的纳米金颗粒与所述待测样品按照 10:1的体积比进行混合，20-25°C静置lOmin;8000g离心30min，取沉淀用PBS重悬后进行 表面增强拉曼光谱检测； 对照组：与所述实验组相比，仅将所述待测样品替换为等量的水，其余均相同； (a2)根据步骤（al)的检测结果，按照如下确定所述待测样品中是否含有禽流感病毒： 若所述实验组的表面增强拉曼光谱信号强于所述对照组的表面增强拉曼光谱信号，则所述 待测样品中含有或候选含有禽流感病毒；若所述实验组的表面增强拉曼光谱信号不强于所 述对照组的表面增强拉曼光谱信号，则所述待测样品中不含有或候选不含有禽流感病毒。
3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述（al)中，进行所述表面增强拉曼 光谱检测时的参数如下：拉曼测定功率为80mW，波长为785nm，积分时间为20s;
4. 根据权利要求1所述的应用或权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：所述偶 联有a(2, 3)唾液酸寡糖的纳米金颗粒为在表面通过S-Au共价键连接了式I所示化合物 和式II所示化合物的金纳米颗粒：
II：H0(CH2CH20)m(C0)n(CH2)k(CH)pSR； 所述式I和所述式II中，X为1-3的整数，m为0-6的整数，n为0-1的整数，k为0-11 的整数，P为0或2,R为S或H,Ac为乙酰基，R1为轻基或乙酰胺基，R2为氢或L-岩藻糖， R3为氢或硫酸酯，R4为轻基或乙酰胺基。
5. 根据权利要求4所述的应用或试剂盒，其特征在于：所述式I和所述式II中，X为 1，m为3,n为1，k为4,p为1，R为S，R1为轻基，R2为氢，R3为氢，R4为轻基。
6. 根据权利要求1-5中任一所述的应用或试剂盒，其特征在于：所述纳米金颗粒的直 径为 10-30nm。
7. 根据权利要求6所述的应用或试剂盒，其特征在于：所述纳米金颗粒的直径为 10_15nm〇
8. 根据权利要求1-7中任一所述的应用或试剂盒，其特征在于：构成所述偶联有a(2， 3)唾液酸寡糖的纳米金颗粒的所述式I所示化合物、所述式II所示化合物和所述金纳米颗 粒的摩尔比为10000?80000 :2000?16000 :1。
9. 根据权利要求8所述的应用或试剂盒，其特征在于：构成所述偶联有a(2,3)唾液 酸寡糖的纳米金颗粒的所述式I所示化合物、所述式II所示化合物和所述金纳米颗粒的摩 尔比为 40000 :8000 :1。
【文档编号】G01N21/65GK104406954SQ201410697470
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月26日 优先权日:2014年11月26日
【发明者】刘文军, 李学兵, 杨利敏, 李晶, 贾晓娟, 孙蕾 申请人:中国科学院微生物研究所