乳腺癌分子探针及其制造方法
【专利摘要】本发明公开了一种乳腺癌分子探针，由信号组件和亲和组件构成，其特征在于其亲和组件是对乳腺癌干细胞靶点特异性结合的组件；信号组件是由近红外荧光信号单元和磁共振信号单元组成。其制备方法为：采用化学共价偶联方法将信号功能单元与乳腺癌干细胞的特异性表面标志物单克隆抗体偶联，再经过纯化。本发明是对乳腺癌干细胞多靶点特异结合的分子探针，通过该分子探针能够解决对乳腺癌干细胞的在体检测和定量分析，为实体肿瘤干细胞成像诊断和靶向治疗疗效评估新策略提供依据，为肿瘤早期诊断和分级提供“新模式”，为肿瘤治疗提供精确信息和评估方法，并为进一步解决复发、转移问题垫定诊断信息基础。
【专利说明】乳腺癌分子探针及其制造方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医学成像【技术领域】，具体来说是一种分子探针，特别是一种乳腺癌分子探针，用于医学上乳腺癌诊断和治疗的成像。
【背景技术】
[0002]乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10%，在妇女仅次于子宫癌，已成为威胁妇女健康的主要病因。它是一种通常发生在乳房腺上皮组织，严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。乳腺癌男性罕见，仅约1-2%的乳腺患者是男性。
[0003]乳腺癌的治疗原则临床上对早、中期以手术治疗为首选，采用根治性切除为主。中、晚期以综合治疗为主。癌症治疗中的放、化疗的副作用给病人正常机体带来的伤害和痛苦是有目共睹的。
[0004]对于癌症的治疗，早发现早治疗的效果要优于晚期治疗。然而，乳腺癌的早期可无症状，随着病情发展，可能表现出局部及全身症状。例如肿块、疼痛、乳房皮肤改变、乳腺轮廊改变、乳头乳晕改变、乳头溢液、区域淋巴结肿大以及远处转移表现等。因此，对于乳腺癌的早期准确诊断，是早发现和有效治疗的基础和保障。乳腺癌的诊断方法很多，传统方法主要包括:X线诊断、超声显像检查、细胞学及组织学诊断等，这些方法虽然在乳腺癌的常规检测中发挥了重要作用，但其检测的都是疾病终末期的解剖改变，难以实现真正意义上的早期诊断。
[0005]分子影像学是采用高精度影像成像技术，无创性地对活体内参与生理或病理过程的分子、基因和细胞的变化进行可视化的定性和定量检测。分子影像学主要应用领域是肿瘤学，其基本策略是向体内引入能与靶标特异结合的分子探针(由信号组件和亲和组件两部分构成)，通过直接检测探针上的信号组件，或者间接检测分子探针在细胞内外作用后的产物，获得分子信息，以达到示踪和诊断目的。分子影像学是在真实、完整的生理环境中通过图像直接监视细胞和分子通路，对生物活动的发生、发展过程进行实时成像。分子影像技术与传统方法相比可以更好地在分子水平研宄疾病的机制和特征，可以活体上早期、连续地观测治疗机制和疗效，是一种真正的癌症早期检测手段，对提高诊断和治疗效果，减少复发率，降低死亡率都具有重量意义。
[0006]分子影像中的关键技术是分子探针的制备和应用。分子探针是指对某一特定生物分子(如蛋白、DNA和RNA)具有特异性的、并能进行体内或体外示踪的标记化合物分子，这些标记化合物分子能够在体或离体反映其靶生物分子的量或功能。分子探针通常由信号组件和亲和组件两部分构成。信号组件是指能产生影像学信号且能被高精度成像技术探测的对比剂或标记物部分(如放射性核素、荧光素或顺磁性分子)，亲和组件是与成像靶点特异性结合的部分(如配体或抗体等)。
[0007]李绪斌等用化学偶联法，将超顺磁性氧化铁颗粒(SP1)与生长激素抑制素类似物奥曲肽(OCT)偶联，制备对乳腺癌细胞表皮长生激素受体(SSTR)的特异性结合的磁共振分子探针SP1-OCT，该分子探针细胞阳性标记率达到96.15% (北京大学学报医学版，Vol.41Νο.2Apr.2009)。
[0008]朱媛等以乳腺癌表皮生长因子受体2 (HER2)为靶点，制备以顺磁性粒子钆为载体的磁共振(MR)分子探针，通过MR靶向成像为乳腺癌个体化治疗提供影像学依据。材料与方法利用课题组前期制备的针对HER2的荧光标记探针FITC-LTVSPWY与钆喷替酸葡甲胺(Gd-DTPA)偶联获得MR靶向探针(“乳腺癌HER2靶向分子探针的制备及体外MRI初步研宄”，《中国医学影像学杂志》2014年22卷第5期)。
[0009]中国专利文献CN102399772A公开了对质粒DNA进行荧光标记，获得HER2、T0P2A、AGTRE基因探针。
[0010]然而，目前公布的乳腺癌分子探针，还普通具有如下不足:(I)获得的分子影像不能更全面反映乳腺癌的生物学行为，基于目前分子探针成像技术进行诊断和治疗，乳腺癌复发率高，放化疗效果不佳。(2)目前的不同乳腺癌分子探针其成像各有不足。其中荧光成像虽然无创、敏感性高，可进行在体实时多目标成像，但存在空间分辨率低、解剖背景不清晰的弱点。与之相反，磁共振成像具有极高的空间分辨力和组织分辨力、无创、无辐射，但是敏感性相对较差。(3)乳腺癌等大多数肿瘤是多基因性疾病，平均每个肿瘤病人有8-10个与肿瘤有关的基因异常变异，当前采用单一靶标的肿瘤或肿瘤干细胞靶向治疗多数疗效不佳。
[0011]随着乳腺癌干细胞(breast cancer stem cell，BCSC)的成功分离、鉴定，和对其生理作用和过程的研宄，表明乳腺癌细胞中存在着一部分具有自发更新、多向分化潜能以及高度致瘤能力的细胞亚群一一乳腺癌干细胞。乳腺癌干细胞在乳腺癌组织中占比小(平均约2-9% )，在转移灶或转移性淋巴结中绝对含量更少，因此其检测难度大。但其与肿瘤侵袭转移、复发和治疗抵抗密切相关(“乳腺癌干细胞的研宄进展”，刘明明等，《中国癌症杂志》，2013年第23卷第8期)。根据2012年2月13日发表在《干细胞》期刊上的一篇文章，美国加州大学旧金山分校的研宄人员第一次报道了放射疗法在杀死肿瘤细胞同时，也能够将其他癌细胞转变为抵抗治疗的乳腺癌干细胞。而一些研宄人员认为乳腺癌干细胞是乳腺癌复发的唯一来源。然而，虽然乳腺癌干细胞的分离和鉴别，以及对其作用的研宄已经取得了许多科研成果，但还未有报道有对乳腺癌干细胞靶向成像的分子探针，因此提供一种能够对乳腺癌干细胞靶向成像的分子探针，以解决乳腺癌干细胞活体成像和定量分析，为乳腺癌的早期诊断和疗效评估提供新方法，为乳腺癌靶向治疗提供新策略，具有重要意义。
【发明内容】
[0012]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新型的乳腺癌分子探针，通过对乳腺癌干细胞靶向分子成像，为乳腺癌的早期诊断和疗效评估提供新方法，为乳腺癌干细胞和/或乳腺癌靶向的肿瘤治疗提供新策略。
[0013]本发明采用的技术该案为:一种乳腺癌分子探针，由信号组件和亲和组件构成，其特征在于其亲和组件是对乳腺癌干细胞靶点特异性结合的组件，信号组件是由近红外荧光信号单元和磁共振信号单元组成。虽然乳腺癌分子探针的信号组件可以为现有分子影像学中已有的信号组件，但本发明考虑到辐射对活体的影响问题，以及为解决单一荧光成像和单一磁共振成像在分辨力和敏感性上的不足，本发明优选荧光-磁共振双模态成像，即所述信号组件是将适用于分子探针的荧光物质与磁共振成像物质偶合成一体的信号组件制成双模态分子探针。
[0014]进一步地，所述亲和组件是乳腺癌干细胞的特异性表面标志物⑶44+、ESA+或CD24-中的配体。由于其他细胞膜上没有或极少有CD44+与ESA+，故选择此两个靶标能使本探针靶向特异性高。优选CD44+和/或ESA+配体，特别是选用特异性更好的CD44单克隆抗体CD44_和/或ESA单克隆抗体ESA mAb，采用抗原-抗体特异性结合的分子成像策略。
[0015]由于普通荧光穿透活体组织能力比较弱，本发明优选波长在700nm-1200nm的近红外荧光材料作为信号组件，该波长范围内的近红外荧光对组织的穿透力强，而此范围内生物组织本身的自发荧光较弱，从而避免背景干扰，提高检测灵敏度。近红外荧光组件可以是有机荧光染料，最好是用具有优异光学性质的量子点(quantum dots, QDs)作为荧光材料，QDs是由I1-VI族或II1-V族或1-1I1-VI族元素组成的、直径约Inm-lOnm、能够接受激发光产生荧光的半导体纳米晶粒，QDs克服了以往常用于细胞和生物分子荧光标记成像的有机染料分子的较大缺陷(激发光谱窄、发射光谱很宽且不对称；荧光谱峰之间很大重叠，限制了可同时应用的荧光探针数量；光稳定性差、易发生光漂白和光解，光解产物对生物分子往往有杀伤作用等)，具有激发光谱宽且连续分布，可以用各种不同波长的光进行激发；发射光谱窄、对称而不重叠；光稳定性好、颜色丰富可调等多种优势。其中波长650nm-900nm的近红外QDs相对较易合成，能承受多次的激发和光发射，有持久的光化学稳定性，能够在体内外长时间的连续成像观测。同时由于近红外QDs的荧光波长可以根据量子点粒径大小进行精确调节，因此是可视化区分不同靶标的最佳探针。
[0016]进一步地，本发明的较佳实施例，是将不同粒径的QDs标记不同靶标，在同一激发光下可呈现不同颜色的荧光，从而实现多靶向分子成像。
[0017]在现有的QDs中，研宄发现含镉QDs (如CdTe)含有轻毒性，为提高分子探针的安全性，本发明优选非镉近红外QDsJn InP、CuInS。本发明QDs优选采用Zn-Cu-1n-S核量子点，最优选的是还可对该核量子点进行表面无机层(如ZnS)包覆，形成的核壳近红外QDs，可提高核壳量子点的荧光效率和光化学稳定性。
[0018]对于磁共振分子成像探针信号组件可以用超顺磁性氧化铁(SP1)和顺磁性钆(Gd3+)。本发明人在本项研宄中发现，SP1纳米颗粒具有很强的光吸收性，对与其偶合的QDs荧光有较强的淬灭效应，影响QDs体内荧光成像效果。因此本发明优选顺磁性钆(Gd3+)作为双模态分子探针的MR成像信号功能单元。
[0019]作为本发明优选实施例，本发明将Gd3+作和近红外QDs两个功能单元，组装成优势互补的焚光效率高、顺磁性好的近红外非镉量子点纳米颗粒(paramagnetic QDs, pQDs)作为双模态探针的信号组件。同时选取不同粒径(对应不同发射波长)的近红外非镉QDs分别与Gd3+)构建双模态分子探针标记不同靶标，实现多靶向分子双模态成像。
[0020]为实现多靶向分子成像，本发明优选的亲和组件是基于特异性表面标志物CD44+和ESA+的配体，将⑶44_和ESAmAb两种单克隆抗体分别与不同波长的近红外pQDs偶联，形成BCSC靶向的两种双模态分子探针，其不同波长的近红外pQDS选择波长如700nm和800nm两种，分别表示为pQD700、pQD800，对应地本发明的两种双模态分子探针为pQD.-⑶44mAb和PQD80O-ESAiiia13,或者为 pQD.-CDA^b和 pQD 7(l(l_ESAmiib。
[0021]对于双模态探针，在偶联前，需要磁共振成像材料先偶合在荧光材料表面。例如在偶合前先通过在QDs表面修饰Gd3+螯合剂DOTA，将Gd3+螯合在纳米QDs表面。本方法通过在QDs表面修饰Gd3+螯合剂DOTA，提供高密度的Gd3+结合位点，减少了 Gd3 +旋转来提高其弛预速率，提高敏感性。
[0022]在本发明的一种较佳实施例中，为躲避网状内皮系统的捕捉，增加探针在体内循环的时间，消除在非病灶部位的非特异性吸附，降低本底信号和假阳性，还用高分子材料如聚乙二醇(PEG)、丙烯酸树脂(PAA)或多羟基醇等对pQDs进行表面修饰。
[0023]本发明还提供了前述乳腺癌分子探针的制备方法:采用化学共价偶联方法将荧光/磁共振双信号功能单元与乳腺癌干细胞的特异性表面标志物偶联，再经过纯化。
[0024]本发明的技术效果和意义体现在如下几个方面:
[0025](I)与现有公开的乳腺癌分子探针不同，本发明是对乳腺癌干细胞多靶点特异结合的分子探针，通过该分子探针能够解决对乳腺癌干细胞的在体检测和定量分析，为实体肿瘤干细胞成像诊断和靶向治疗疗效评估新策略提供依据，为肿瘤早期诊断和分级提供“新模式”，为肿瘤治疗提供精确信息和评估方法，并为进一步解决复发、转移问题垫定诊断信息基础。
[0026](2)采用双模态分子探针，使荧光和MR成像得以扬长避短和优势互补，可成倍增加单个BCSC上信号组分的数量和密度，提高分子探针的敏感性和分辨率，能够检测更低含量甚至微量的BCSC。
[0027](3)采用多靶向技术，结合双模态，能够得到BCSC在活体上的位置、含量和分布等重要信息，并检测前哨淋巴结中BCSC的重要信息，为手术方式的选择、放疗计划等提供精确信息，为个性化治疗提供依据。此外，依据BCSC灭活和残存情况，来早期无创性评价治疗疗效，及时调整并加强针对BCSC的治疗该案，能更有效预防乳腺癌复发和转移。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为量子点的TEM图。
[0029]图2为Zn-Cu-1n-S及其Zn-Cu-1n-S/ZnS核壳量子点的荧光发射光谱。其中的插图为Zn-Cu-1n-S/ZnS核壳量子点在不同发射波长下的荧光效率。
[0030]图3为Zn-Cu-1n-S和Zn-Cu-1n-S/ZnS核壳量子点的荧光衰减图。
[0031]图2、3中的ZCIS为Zn-Cu-1n-S量子点的缩写。
[0032]图4为亲水性非镉Zn-Cu-1n-S/ZnS核壳量子点的体内活体荧光成像。
[0033]图5a为对照组(QDs经PAA修饰但未螯合Gd3+) Tl测量图；
[0034]图5b为实验组(pQDs，即QDs经PAA修饰且螯合Gd3+)的Tl测量；
[0035]图5c为Tl加权成像(TR = 100ms, TE = 3.1ms)显示，其中I为去离子水信号，II为未螯合Gd3+探针的QDs信号；111为pQDs信号。
【具体实施方式】
[0036]下面结合最佳实施例，以双模态分子探针为例对本发明作进一步说明，以助于理解本发明的内容。
[0037]1、分子探针的制备
[0038]1.1顺磁性量子点制备
[0039]1.1.1亲油性量子点的制备
[0040]本实施例采用1-1I1-VI族元素(如铜，铟，硫，锌等)，通过高温油相法制备出单分散性好且结晶度高的Zn-Cu-1n-S核量子点。为获得更具光稳定性的量子点，继而对该核量子点进行表面无机层(如ZnS)包覆，提高核壳量子点的荧光效率和光化学稳定性。在设计壳层的组分和结构时需综合考虑壳层与核量子点的晶格匹配参数，以及壳层材料的禁带宽度，合理结构和组分的核壳量子点对外界物理、化学环境具有很强的抵抗作用，在亲水性修饰过程中能很好的维持原有的荧光效率。具体合成过程如下:
[0041]Zn-Cu-1n-S核量子点制备过程:分别称取醋酸铜(0.1mmol)，醋酸铟(0.2mmol)，醋酸锌(0.1mmol)，量取0.5mL油酸，将其混合溶解在1mL十八烯中。整个混合体系抽真空30分钟后通氩气，再加热到120摄氏度，直到混合体系变得光学透明，再加入1.0mL正十二烷基硫醇。反应继续升温到200摄氏度，再加入0.3mmol硫源(9.7mg溶解在0.5mL油胺和
1.0mL十八烯中)，整个体系维持在200摄氏度反应2小时。
[0042]Zn-Cu-1n-S/ZnS核壳量子点制备过程:先配置好壳层的锌前体，即称取0.1mmol的醋酸锌，使其溶解在体积比(1/4)的油胺/十八烯溶液中。取上述得到的4.0mLZn-Cu-1n-S核量子点，再加入5mL十八烯和ImL正十二烷基硫醇，通氩气30分钟后开始加热升温到220摄氏度，再注入事先配置好的锌前体，维持体系温度在220摄氏度，反应I小时后降温到室温，加入无水乙醇，离心纯化得到Zn-Cu-1n-S/ZnS核壳量子点。
[0043]采用高分辨透射电子显微镜(HRTEM)、原子力显微镜(AFM)、光电子能谱、粒度分析仪、荧光和紫外-可见分光光度计等对量子点的形貌、结构、粒径、光谱等进行表征。
[0044]由图1可以看出，量子点的尺寸在4纳米左右，尺寸均一。
[0045]由图2和3可以看出，采用ZnS包裹后的核壳量子点比未包裹的核量子点荧光效率提高数倍，衰减速度明显降低。
[0046]1.1.2量子点亲水性改性
[0047]双亲性高分子的制备--聚(叔丁基丙烯酸脂乙基丙烯酸脂甲基丙烯酸)三嵌段共聚物与辛胺以1:40的摩尔比混合溶解在DMF中，加入偶联剂EDC反应12h，得到的混合物透析纯化，冻干后保存待用。
[0048]取适量的亲油性量子点粉末和双亲性三嵌段高分子溶解在氯仿/乙醇混合溶液中，搅拌数小时以除去氯仿有机溶剂。再加入适量的PBS缓冲溶液，超声分散3分钟。所得到的溶液过0.22um膜以除去大量未结合的高分子，过膜后溶液变得光学透明。所得溶液过凝胶色谱柱(G200)，进一步除去未结合的高分子，最终得到纯化好的亲水性量子点。
[0049]1.1.3顺磁性量子点制备
[0050]将亲水性量子点与DOTA-NH2分子偶联，再加入GdCl 3进行Gd3+螯合，获得顺磁性量子点。具体制备过程是:按照摩尔比1:100:4000将亲水性量子点，DOTA-NH2和碳二亚胺盐酸盐混合，室温反应2小时，超速离心纯化得到QDs-DOTA。再在所获得的QDs-DOTA基础上，加入Gd3+，室温螯合反应4小时，再经过超速离心纯化得到顺磁性量子点。
[0051]根据纳米量子点粒径不同，分别获得pQD700、pQD800。
[0052]为考察本发明顺磁性量子点的MR成像特性，进行MR成像实验。如图5所示，图5a为对照组(QDs经PAA修饰但未螯合Gd3+) Tl测量。图5b为实验组(pQDs，即QDs经PAA修饰且螯合Gd3+)的Tl测量。两者比较后发现，pQDs的Tl时间明显缩短，弛豫率明显升高。图5c为Tl加权成像(TR = 100ms, TE = 3.1ms)显示，pQDs信号强度(III)显著高于去离子水(I)和未螯合Gd3+探针的QDs (II)。
[0053]1.2革El向乳腺癌干细胞的顺磁性量子点制备
[0054]将顺磁性量子点与单克隆抗体分子CD44mAb、ESAmAb偶联，获得可特异性识别乳腺癌干细胞的顺磁性量子点。具体制备过程是:按照摩尔比1:10:4000将顺磁性量子点，抗体和碳二亚胺盐酸盐混合，室温反应2小时。超速离心纯化得到靶向乳腺癌干细胞的顺磁性量子点 pQDTOO-aMtAdP PQD800-ESA.。
[0055]2、活体测试
[0056]为了验证本发明的分子探针用于BCSC多靶向双模态成像效果和安全性，进行如下实验:
[0057]2.1基于亲水性非镉Zn-Cu-1n-S/ZnS核壳量子点的体内活体荧光成像
[0058]将亲水性Zn-Cu-1n-S/ZnS核壳量子点首先进行了细胞毒性实验，结果表明所制备的亲水性Zn-Cu-1n-S/ZnS核壳量子点具有良好的生物相容性。随后进行了体内荧光成像的研宄，结果如图4所示，结果表明制备的近红外非镉Zn-Cu-1n-S/ZnS核壳量子点可以进行活体荧光成像。
[0059]2.2安全性实验
[0060]配置不同浓度的分子探针，经过细胞毒性3-(4，5-dimethylthiazol_2-yl)-2，5_diphenyltetrazolium bromide (MTT)试验，本发明的分子探针具有很好的生物安全性。以Cu含量计算，Cu离子含量在2 μΜ，经过96小时共孵育，细胞存活率在95%以上。
[0061]2.3成像敏感性实验
[0062]对装有经双模态分子探针标记但BCSC数目不同的(BCSC细胞数分别为1、5、I X 10\50,1 X 12U X 10\ I X 10\ I X 15)的Ep管分别行荧光成像、MR Tl成像，观察并比较荧光成像、MR Tl成像能够检测的最低细胞数。实验数据表明，荧光成像模式的最低可分辨的成像细胞个数为5 ；MR Tl成像模式的最低可分辨的成像细胞个数为50。
[0063]2.4靶向特异性实验
[0064]以⑶44-/ESA-的乳腺癌细胞做对照，将BCSC分别与pQD700_⑶44mAb双模态分子探针、PQD700共培养孵育，洗涤后与荧光显微镜下观测BCSC和CD44-/ESA-的乳腺癌细胞的荧光信号，再分别行MR TlW成像，评价荧光信号与磁共振信号是否一致，并判断该探针的靶向性能。对PQDSOO-ESAmAb双模态分子探针同样进行上述实验。经过细胞靶向成像实验，本发明的双模态分子探针具有优异的靶向性检测效果。
【权利要求】
1.一种乳腺癌分子探针，由信号组件和亲和组件构成，其特征在于其亲和组件是对乳腺癌干细胞靶点特异性结合的组件；信号组件是由近红外荧光信号单元和磁共振信号单元组成。
2.如权利要求1所述的乳腺癌分子探针，其特征在于:所述亲和组件是乳腺癌干细胞的特异性表面标志物⑶44+和/或23八—的配体。
3.如权利要求1所述的乳腺癌分子探针，其特征在于:所述亲和组件是0)44单克隆抗体⑶44-和/或单克隆抗体
4.如权利要求3所述的乳腺癌分子探针，其特征在于:所述荧光信号单元为近红外量子点。
5.如权利要求4所述的乳腺癌分子探针，其特征在于:所述近红外量子点为211-011-111-8非锦量子点。
6.如权利要求4所述的乳腺癌分子探针，其特征在于:所述近红外量子点为211-011-111-8核量子点外包括有2113的核壳结构量子点。
7.如权利要求4所述的乳腺癌分子探针，其特征在于:所述磁共振信号材料为顺磁性钆。
8.如权利要求5所述的乳腺癌分子探针，其特征在于:所述探针为多靶向双模态分子探针，为和？卯口叫与？卯2在近红外波段但波长不同。
9.一种权利要求1至8中之一所述乳腺癌分子探针的制造方法，其特征在于:采用化学共价偶联方法将信号功能单元与乳腺癌干细胞的特异性表面标志物单克隆抗体偶联，再经过纯化。
10.如权利要求9所述的制造方法，其特征在于:还用聚乙二醇、丙烯酸树脂或多羟基醇对？如8进行表面修饰。
【文档编号】G01N24/10GK104483296SQ201410718641
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月1日 优先权日:2014年12月1日
【发明者】方向明, 张兵波, 胡春洪 申请人:无锡市人民医院