一种测定乳基婴幼儿配方粉中乳清蛋白含量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种测定乳基婴幼儿配方粉中乳清蛋白含量的方法，所述方法包括以下的步骤：①待检样品上样液的制备；②酪蛋白标准品和乳清蛋白标准品上样液的制备；③聚丙烯酰胺凝胶电泳；④染色与脱色；⑤成像与计算。所述的方法准确性高、操作简单、成本低，以标准蛋白质的质量和trace值作参比，无需制作标准曲线即能实现准确检测乳清蛋白的含量。
【专利说明】一种测定乳基婴幼儿配方粉中乳清蛋白含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物领域，具体涉及一种测定乳基婴幼儿配方粉中乳清蛋白含量的方 法。
【背景技术】
[0002] 牛乳中的蛋白质可大致分为酪蛋白和乳清蛋白两大类，其中酪蛋白占牛乳中蛋白 质含量的约80%，酪蛋白由a Sl-酪蛋白、a S2-酪蛋白、￠-酪蛋白和K-酪蛋白四种蛋 白质组成，且四种酪蛋白占总酪蛋白的比例分别为40%、10%、40%和10%，所述的百分比 为质量百分比；乳清蛋白约占牛乳中蛋白质含量的20%，乳清蛋白主要由P -乳球蛋白、 a _乳白蛋白、免疫球蛋白和血清白蛋白组成，分别约占总乳清蛋白的50%、20%、12%和 6%，所述的百分比为质量百分比。乳清蛋白相比于酪蛋白能为婴儿提供更高的营养，另外 婴儿的消化系统也更易消化乳清蛋白而非酪蛋白。成熟母乳中乳清蛋白和酪蛋白的比例为 60:40,为了使婴儿配方粉更接近母乳，为婴儿提供更有利于其生长的营养，我国市售的乳 基婴儿配方粉都通过添加乳清蛋白来调整乳粉内乳清蛋白的含量。
[0003] 对于乳粉内乳清蛋白含量的检测，目前国内主要依据GB/T 5413. 2 1997,该法检 测时用光密度计来检测不同蛋白的光密度，最后通过计算不同蛋白的光密度来计算乳清蛋 白的含量。光密度检测法存在一定的缺陷，因为不同的蛋白结合考马斯亮蓝的能力不同，即 使在蛋白质浓度相同的情况下，不同蛋白仍会表现出不同的光密度值，因此仅用蛋白质光 密度扫描的trace值来计算乳清蛋白的含量，会造成检测结果的准确度较低，误差较大。因 此需要探寻一种更加准确、操作简单、成本低、且能适用于乳基婴幼儿配方粉这一复杂体系 中乳清蛋白含量的检测方法。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中仅利用蛋白质光密度扫描的trace 值来检测乳粉中乳清蛋白含量时检测结果准确度较低、误差较大的缺陷，提供一种准确性 高、操作简单、成本低的测定乳基婴幼儿配方粉中乳清蛋白含量的方法。
[0005] 本发明提供一种测定乳基婴幼儿配方粉中乳清蛋白含量的方法，所述方法包括以 下的步骤：
[0006] ①待检样品上样液的制备：将待检样品搅拌并充分溶解于去离子水中，然后与 SDS-PAGE上样缓冲液混合均匀，水浴煮沸，迅速移入到冰水中冷却，即得所述待检样品上样 液；所述待检样品指非水解的乳基婴幼儿配方粉；
[0007] ②酪蛋白标准品和乳清蛋白标准品上样液的制备：将a -酪蛋白、0 -酪蛋白和 K-酪蛋白溶解于水得酪蛋白标准品的混合样；将￠-乳球蛋白、a-乳白蛋白和血清白蛋 白溶解于水得乳清蛋白标准品的混合样；将所述酪蛋白标准品的混合样和所述乳清蛋白标 准品的混合样分别和SDS-PAGE上样缓冲液混合均匀，水浴煮沸，然后迅速移入到冰水中冷 却，即得酪蛋白标准品上样液和乳清蛋白标准品上样液；
[0008] ③聚丙烯酰胺凝胶电泳：将步骤①所述待检样品上样液、步骤②所述酪蛋白标准 品上样液和所述乳清蛋白标准品的上样液上样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，得聚丙烯酰胺 凝胶；
[0009] ④染色与脱色：移出步骤③所述的聚丙烯酰胺凝胶，用染色液染色即得染色的凝 胶；将所述染色的凝胶用脱色液脱色至背景透明，即得脱色的凝胶；
[0010] ⑤成像与计算：将步骤④所述脱色的凝胶置于凝胶成像系统内，用图像处理软件 分析记录所述待检样品对应泳道各条带的trace值，对照所述酪蛋白标准品和所述乳清蛋 白标准品对应泳道各条带的trace值，并根据步骤③所上样的酪蛋白标准品或乳清蛋白标 准品的质量，计算所述待检样品中乳清蛋白占总蛋白的比例，所述的trace值为SDS-PAGE 的光密度扫描图谱内蛋白质对应峰的峰面积。
[0011] 步骤①为，待检样品上样液的制备：将待检样品搅拌并充分溶解于去离子水中，然 后与SDS-PAGE上样缓冲液混合均匀，水浴煮沸，迅速移入到冰水中冷却，即得所述待检样 品上样液；所述待检样品指非水解的乳基婴幼儿配方粉。其中，所述去离子水为本领域常规 的去离子水，较佳地为纯水，更佳地为超纯水。本发明中，所述的溶解是指在水中形成稳定、 均一的体系。所述待检样品上样液A的蛋白质含量的终浓度为本领域常规的终浓度，较佳 地，在2mg/mL?4mg/mL范围内，更佳地为3mg/mL。所述SDS-PAGE上样缓冲液为本领域常 规的SDS-PAGE上样缓冲液，较佳地为2 X SDS-PAGE上样缓冲液。较佳地，所述2 X SDS-PAGE 上样缓冲液的口^1值为6.8，含有1'1^8-1〇^1〇〇1111，5〇5〇.〇51^/1，溴酚兰〇.〇〇21^/1，0-巯 基乙醇0. lkg/L，甘油20%，所述百分比为体积百分比。所述煮沸的时间为本领域常规的时 间，较佳地为2?8min，更佳地为3?5min。
[0012] 步骤②为，酪蛋白标准品和乳清蛋白标准品上样液的制备：将a-酪蛋白、￠-酪 蛋白和K-酪蛋白溶解于水得酪蛋白标准品的混合样；将￠-乳球蛋白、a-乳白蛋白和 血清白蛋白溶解于水得乳清蛋白标准品的混合样；将所述酪蛋白标准品的混合样和所述乳 清蛋白标准品的混合样分别和SDS-PAGE上样缓冲液混合均匀，水浴煮沸，然后迅速移入到 冰水中冷却，即得酪蛋白标准品上样液和乳清蛋白标准品上样液。其中，所述酪蛋白标准品 混合样为本领域常规的酪蛋白标准品混合样，较佳地由包括以下步骤的方法制备而得：将 a-酪蛋白、￠-酪蛋白和K-酪蛋白以质量比4:3:1的比例溶解于水获得终蛋白浓度为 I. 70mg/mL的水溶液，即得。所述乳清蛋白标准品混合样为本领域常规的乳清蛋白标准品 混合样，较佳地由包括以下步骤的方法制备而得：将￠-乳球蛋白、a-乳白蛋白和血清白 蛋白以质量比8:3:1的比例溶解于水获得终蛋白浓度为1.43mg/mL的水溶液，即得。所述 SDS-PAGE上样缓冲液为本领域常规的SDS-PAGE上样缓冲液，较佳地为2X SDS-PAGE上样 缓冲液。较佳地，所述2 X SDS-PAGE上样缓冲液的pH值为6. 8,含有Tris-HCL lOOmM，SDS 0. 05kg/L，溴酚兰0. 002kg/L，P -巯基乙醇0. lkg/L，甘油20 %，所述百分比为体积百分比。 所述煮沸的时间为本领域常规的时间，较佳地为2?8min，更佳地为3?5min。
[0013] 步骤③为，聚丙烯酰胺凝胶电泳：将步骤①所述待检样品上样液、步骤②所述酪 蛋白标准品上样液和所述乳清蛋白标准品上样液上样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，得聚丙 烯酰胺凝胶。其中，所述待检样品上样液的上样量为本领域常规的上样量，较佳地为2? 6 y L，更佳地为4 y L。所述酪蛋白标准品上样液的上样量为本领域常规的上样量，较佳地为 2?8 y L，更佳地为5 y L。所述乳清蛋白标准品上样液的上样量为本领域常规的上样量， 较佳地为2?8 y L，更佳地为5 y L。所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳的条件为本领域常规的条 件，较佳地为35?45mA恒流电泳30?50min后，电流调为25?35mA恒流，电泳至蓝色条 带距胶底部0. 5cm处；更佳地为40mA恒流电泳40min后，电流调为30mA恒流，电泳至蓝色 条带距胶底部0. 5cm处。所述聚丙烯酰胺凝胶电泳的电泳液为本领域常规的电泳液，较佳 地，所述电泳液pH值为8. 6,含有Tris 25mM/L，甘氨酸192mM/L，SDS lg/L。所述聚丙烯酰 胺凝胶电泳的凝胶为本领域常规的凝胶，较佳地为5%的浓缩胶和12%的分离胶，所述百 分比为质量体积百分比（w/v)。所述聚丙烯酰胺凝胶电泳即为SDS-PAGE。
[0014] 步骤④为，染色与脱色：移出步骤③所述的聚丙烯酰胺凝胶，用染色液染色即得染 色的凝胶；将所述染色的凝胶用脱色液脱色至背景透明，即得脱色的凝胶。其中，所述的染 色液为本领域常规的染色液；较佳地为考马斯亮蓝染色液，更佳地为〇. 1 %的考马斯亮蓝 染色液。较佳地，所述0. 1 %的考马斯亮蓝染色液为，冰醋酸7. 5%，甲醇10%，考马斯亮蓝 R-250 0.1%的水溶液，所述百分比为质量百分比。所述的脱色液为本领域常规的脱色液， 较佳地为冰醋酸7. 5%、甲醇10%的水溶液，所述百分比为质量百分比。所述的染色的时间 为本领域常规的时间，较佳地为1?2小时，更佳地为1. 5小时。
[0015] 步骤⑤为，成像与计算：将步骤④所述脱色的凝胶置于凝胶成像系统内，用图像 处理软件分析记录所述待检样品对应泳道各条带的trace值，对照所述酪蛋白标准品和所 述乳清蛋白标准品对应泳道各条带的trace值，并根据步骤③所上样的酪蛋白标准品或乳 清蛋白标准品的质量，计算所述待检样品中乳清蛋白占总蛋白的比例，所述的trace值为 SDS-PAGE的光密度扫描图谱内蛋白质对应峰的峰面积。其中，所述的图像处理软件为本领 域常规的图像处理软件，较佳地为Quantity One图像处理软件。较佳地，所述峰面积的获 得是利用所述Quantity One图像处理软件，经过高斯建模后，以高斯建模后的trace值作 为蛋白质的最终trace值。
[0016] 较佳地，所述计算的方法为：分别将待检样品上样液中a-酪蛋白、￠-酪蛋白、 K-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳白蛋白和￠-乳球蛋白的trace值除以在酪蛋白标准品上 样液或乳清蛋白标准品上样液中各蛋白对应的trace值，再分别乘以在酪蛋白标准品上样 液或乳清蛋白标准品上样液中各蛋白所对应的质量，分别计算出待检样品中6种蛋白的质 量；最后通过待检样品中3种乳清蛋白，即血清白蛋白、a-乳白蛋白和￠-乳球蛋白的质 量之和，与6种蛋白，S卩a-酪蛋白、￠-酪蛋白、K-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳白蛋白和 3 _乳球蛋白的质量之和的比值计算得出乳清蛋白占总蛋白的百分比。
[0017] 以血清白蛋白、a-酪蛋白为例，其质量的计算公式为：
[0018] M待检样品（血清白蛋白）
[0019] =待检样品中血清白蛋白的trace值
[0020] /乳清蛋白标准品中血清白蛋白的trace值
[0021] X乳清蛋白标准品中血清白蛋白的上样量（ilg)
[0022] M待检样品（a-酪蛋白）
[0023] =待检样品中a -酪蛋白的trace值
[0024] /酪蛋白标准品中a -酪蛋白的trace值
[0025] X酪蛋白标准品中a -酪蛋白的上样量（ii g)
[0026] 乳清蛋白占总蛋白的百分比的计算公式为：
[0027] 乳清蛋白占总蛋白的百分比（％ )
[0028] =E M待检样品（血清白蛋白+a -乳白蛋白
[0029] +3 _乳球蛋白）/ E M待检样品（血清白蛋白+a -乳白蛋白
[0030] +P _乳球蛋白+a -酪蛋白+P -酪蛋白+K -酪蛋白）
[0031] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0032] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0033] 本发明的积极进步效果在于：1、待检样品预处理简单易行，只需要对乳基婴幼儿 配方粉进行简单地复原，即可加入上样缓冲液配制成待检样品的上样液用于进行聚丙烯酰 胺凝胶电泳实验。简化了乳清蛋白含量的检测步骤，易于操作，节省时间，检测费用低，对实 验仪器要求低，普通实验室即能开展检测工作。2、酪蛋白标准品和乳清蛋白标准品上样液 的上样量在一定的范围内，能实现准确的检测待检样的乳清蛋白含量，无需制作标准曲线 既能实现准确检测乳清蛋白的含量，且SDS-PAGE图谱中6种蛋白质（a -酪蛋白、P -酪蛋 白、K-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳白蛋白和￠-乳球蛋白）的条带均清晰可辨。因此该检 测方法的准确度高、可操作性高，且不会因为上样量的苛刻要求而造成实验的准确度降低。
【专利附图】
【附图说明】
[0034] 图1为酪蛋白标准品和乳清蛋白标准品的SDS-PAGE图谱。
[0035] 图2为酪蛋白标准品和乳清蛋白标准品SDS-PAGE胶的光密度扫描图谱。
[0036] 图3为乳基婴幼儿配方粉的SDS-PAGE图谱。
[0037] 图4为乳基婴幼儿配方粉SDS-PAGE胶的光密度扫描图谱。
[0038] 图5为自配乳基婴幼儿配方粉乳清蛋白检测的SDS-PAGE图谱。其中：a为酪蛋 白标准品；b为乳清蛋白标准品；1.乳清蛋白/酪蛋白为75:25 ;2.乳清蛋白/酪蛋白为 70:30 ;3.乳清蛋白/酪蛋白为65:35 ;4.乳清蛋白/酪蛋白为60:40 ;5.乳清蛋白/酪蛋 白为55:45 ;6.乳清蛋白/酪蛋白为50:50,所述比例为质量比。
[0039] 图6为编号1?6的市售乳基婴儿配方粉乳清蛋白检测的SDS-PAGE图谱。其中：a为酪蛋白标准品；b为乳清蛋白标准品；编号1?6表示6份不同的市售乳基婴儿配方粉。
[0040] 图7为编号7?12的市售乳基婴幼儿配方粉乳清蛋白检测的SDS-PAGE图谱。其 中：a为酪蛋白标准品；b为乳清蛋白标准品；标号7?12表示6份不同的市售乳基婴儿配 方粉。
[0041] 图8为乳基婴幼儿配方粉乳清蛋白检测的SDS-PAGE图谱
[0042] 图9为自配乳清蛋白：酪蛋白为50:50的乳基婴幼儿配方粉乳清蛋白检测的 SDS-PAGE图谱，所述比例为质量比。其中：a为酪蛋白标准品；b为乳清蛋白标准品；标号1 表不乳清蛋白：酿蛋白为50:50的乳基婴幼儿配方粉。
[0043] 图10为自配乳清蛋白：酪蛋白为75:25的乳基婴幼儿配方粉乳清蛋白检测的 SDS-PAGE图谱，所述比例为质量比。其中：a为酪蛋白标准品；b为乳清蛋白标准品；标号1 表示乳清蛋白：酪蛋白为75:25的市售乳基婴儿配方粉。
【具体实施方式】
[0044] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0045] 如下实施例，所使用的试剂包括：标准品a-酪蛋白、￠-酪蛋白、K-酪蛋白、血 清白蛋白、ct -乳白蛋白和P -乳球蛋白购自美国sigma公司；丙烯酰胺（Acr)、Tris、N-N 甲叉双丙烯酰胺（Bis)、N，N，N'，N' -四甲基乙二胺（TEMED)、十二烷基硫酸钠（SDS)、过硫酸 铵（Ap)和巯基乙醇购自上海迪申生物；冰醋酸、甲醇、甘油、考马斯蓝R-250,溴酚蓝和甘氨 酸购自国药集团。市售婴儿配方粉，从市场上购买获得。
[0046] 所用的仪器包括：Mini-PROTEAN Tetra Cell 电泳槽、164-5050 Powerpac Basic 电泳仪和Gel Doc? XR+成像系统均购自美国Bio-Rad公司。分析天平购自梅特勒-托利 多集团。
[0047] 所述的2 X SDS-PAGE上样缓冲液的pH值为6. 8,含有Tris-HCL lOOmM，SDS 0. 05kg/L，溴酚兰0. 002kg/L，P -巯基乙醇0. lkg/L，甘油20 %，所述百分比为体积百分比。 [0048] 实施例1酪蛋白标准品、乳清蛋白标准品上样液的制备和酪蛋白标准品、乳清蛋 白标准品的SDS-PAGE检测
[0049] ①酪蛋白标准品、乳清蛋白标准品上样液的制备
[0050] 酪蛋白标准品混合样：将a-酪蛋白、￠-酪蛋白和K-酪蛋白以4:3:1(质量比） 的比例配制成终蛋白浓度为I. 70mg/mL的水溶液即可；
[0051] 乳清蛋白标准品混合样：将@ _乳球蛋白、a -乳白蛋白和血清白蛋白以 8:3:1(质量比）的比例配制成终蛋白浓度为1.43mg/mL水溶液即可。
[0052] 所述酪蛋白标准品混合样和所述乳清蛋白标准品混合样分别和2XSDS-PAGE上 样缓冲液等体积混合均匀，水浴煮沸3min，然后迅速移入到冰水中冷却，即得所述酪蛋白标 准品上样液和所述乳清蛋白标准品上样液，可以用于后续检测。
[0053] ②酪蛋白标准品、乳清蛋白标准品的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)分析
[0054] 所述酪蛋白标准品上样液和所述乳清蛋白标准品上样液的上样量均为5 y L。分析 条件为：40mA恒流电泳40min后，电流调为30mA恒流电泳至蓝色条带距胶底部0. 5cm处为 止，即得电泳胶。所述电泳的电泳液pH值为8. 6,包含Tris 25mM/L，甘氨酸192mM/L，SDS lg/L〇
[0055] ③染色与脱色
[0056] 移出步骤②所述的电泳胶，用0. 1 %的考马斯亮蓝染色液染色约I. 5h，即得染色 的凝胶。所述0. 1%的考马斯亮蓝染色液为，冰醋酸7. 5%，甲醇10%，考马斯亮蓝R-250 〇. 1 %的水溶液，所述百分比为质量百分比。
[0057] 将所述染色的凝胶，用脱色液脱色至背景透明，即得脱色的凝胶。所述脱色液为： 冰醋酸7. 5%，甲醇10%的水溶液，所述百分比为质量百分比。
[0058] ④成像
[0059] 将步骤③所述的脱色的凝胶置于凝胶成像系统内，用Quantity One图像处理软件 成像。图1即为酪蛋白标准品和乳清蛋白标准品的SDS-PAGE图谱。由图1可知酪蛋白混 合标准品（a -酪蛋白、P -酪蛋白和K -酪）和乳清蛋白混合标准品（血清白蛋白、a -乳 白蛋白和￠-乳球蛋白）中各蛋白质在如上所述电泳条件下都实现了很好的分离。
[0060] 图2为酪蛋白标准品和乳清蛋白标准品SDS-PAGE胶的光密度扫描图谱。如图2 所示，扫描图谱中a-酪蛋白、￠-酪蛋白、K-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳白蛋白和￠-乳 球蛋白实现了很好的分离。图谱中K-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳白蛋白和￠-乳球蛋白 的单峰，说明这四种蛋白质与其它蛋白质实现了完全分离。
[0061] 实施例2乳基婴幼儿配方粉上样液的制备和乳基婴幼儿配方粉的SDS-PAGE检测
[0062] ①乳基婴幼儿配方粉上样液的制备
[0063] 所述乳基婴幼儿配方粉为光明乳业市售的培儿贝瑞1段产品。
[0064] 将所述乳基婴幼儿配方粉搅拌并充分溶解于超纯水中，搅拌使所述乳基婴幼儿配 方粉充分溶解使其蛋白质含量的终浓度为2mg/mL，然后和2X SDS-PAGE上样缓冲液等体积 混合均匀，水浴煮沸2min，迅速移入到冰水中冷却，即得所述乳基婴幼儿配方粉上样液，可 以用于后续检测。
[0065] ②乳基婴幼儿配方粉的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)分析
[0066] 所述乳基婴幼儿配方粉上样液的上样量为4yL。分析条件为：40mA恒流电泳 40min后，电流调为30mA恒流电泳至蓝色条带距胶底部0. 5cm处为止，即得电泳胶。所述电 泳的电泳液口!1值为8.6，包含1^8 251111/1，甘氨酸1921111/1，503 18/1。
[0067] ③染色与脱色
[0068] 移出步骤②所述的电泳胶，用0. 1 %的考马斯亮蓝染色液染色约I. 5h，即得染色 的凝胶。所述0. 1%的考马斯亮蓝染色液为，冰醋酸7. 5%，甲醇10%，考马斯亮蓝R-250 0. 1 %的水溶液，所述百分比为质量百分比。
[0069] 将所述染色的凝胶，用脱色液脱色至背景透明，即得脱色的凝胶。所述脱色液为， 冰醋酸7. 5%，甲醇10%的水溶液，所述百分比为质量百分比。
[0070] ④成像
[0071] 将步骤③所述的脱色的凝胶置于凝胶成像系统内，用Quantity One图像处理软件 成像，经过高斯建模后，以高斯建模后的trace值作为蛋白质的最终trace值。
[0072] 图3即为所述乳基婴幼儿配方粉的SDS-PAGE图谱。由图3可知乳基婴幼儿配方 粉内主要的6种蛋白质（a -酪蛋白、￠-酪蛋白、K -酪蛋白、血清白蛋白、a -乳白蛋白和 3 _乳球蛋白）在如上所述电泳条件下实现了很好的分离。
[0073] 图4即为所述为乳基婴幼儿配方粉SDS-PAGE胶的光密度扫描图谱。如图4所示， 扫描图谱中a-酪蛋白、￠-酪蛋白、K-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳白蛋白和￠-乳球蛋 白实现了很好的分离。其中K-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳白蛋白和￠-乳球蛋白在扫描 图谱中是单峰说明这四种蛋白质与其它蛋白质实现了完全分离。以上实验结果表明，该方 法适合乳粉内主要蛋白质的电泳分离，且能达到理想的效果。
[0074] 实施例3自配乳基婴幼儿配方粉的SDS-PAGE检测和乳清蛋白含量测定
[0075] ①自配乳基婴幼儿配方粉的上样液的制备
[0076] 以生产婴幼儿奶粉的生产工艺，生产乳清蛋白含量不同的配方粉。共设计6个不 同乳清蛋白含量（乳清蛋白：酪蛋白分别为50 :50,55 :45,60 :40,65 :35,70 :30和75 :25， 所述比例为质量比）的配方粉。将所述自配乳基婴幼儿配方粉搅拌并充分溶解于超纯水 中并控制其蛋白质含量的终浓度为3mg/mL，然后和2XSDS-PAGE上样缓冲液等体积混合均 匀，水浴煮沸5min，迅速移入到冰水中冷却，即得所述自配乳基婴幼儿配方粉上样液，可以 用于后续检测。
[0077] ②自配乳基婴幼儿配方粉的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)分析
[0078] 所述自配乳基婴幼儿配方粉上样液的上样量为4 y L。取实施例1获得的酪蛋白标 准品上样液和乳清蛋白标准品上样液，所述酪蛋白标准品上样液和所述乳清蛋白标准品上 样液的上样量均为5 ii L。分析条件为：40mA恒流电泳40min后，电流调为30mA恒流电泳至 蓝色条带距胶底部0. 5cm处为止，即得电泳胶。所述电泳的电泳液pH值为8. 6,包含Tris 25mM/L，甘氨酸 192mM/L，SDS lg/L。
[0079] ③染色与脱色
[0080] 移出步骤②所述的电泳胶，用〇. 1 %的考马斯亮蓝染色液染色约I. 5h，即得染色 的凝胶。所述0. 1%的考马斯亮蓝染色液为，冰醋酸7. 5%，甲醇10%，考马斯亮蓝R-250 0. 1 %的水溶液，所述百分比为质量百分比。
[0081] 将所述染色的凝胶，用脱色液脱色至背景透明，即得脱色的凝胶。所述脱色液为， 冰醋酸7. 5%，甲醇10%的水溶液，所述百分比为质量百分比。
[0082] ④成像
[0083] 将步骤③所述的脱色的凝胶置于凝胶成像系统内，用Quantity One图像处理软件 成像，经过高斯建模后，以高斯建模后的trace值作为蛋白质的最终trace值分析记录各泳 道的蛋白质条带trace值，对照标准蛋白质条带的trace值和上样量（ii g)即可以计算乳 清蛋白与总蛋白质的比例。
[0084] 图5即为所述自配乳基婴幼儿配方粉的SDS-PAGE图谱。由图5可知乳清蛋白含 量不同的乳基婴幼儿配方粉、酪蛋白标准品和乳清蛋白标准品内主要的6种蛋白质（a-酪 蛋白、￠-酪蛋白、K-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳白蛋白和￠-乳球蛋白）在如上所述电 泳条件下实现了很好的分离。
[0085] ⑤计算乳清蛋白含量
[0086] 乳清蛋白占总蛋白的百分比的计算公式为：
[0087] 乳清蛋白占总蛋白的百分比（％ )
[0088] =E M待检样品（血清白蛋白+a -乳白蛋白
[0089] +3 _乳球蛋白）/ E M待检样品（血清白蛋白+a -乳白蛋白
[0090] +P _乳球蛋白+a -酪蛋白+P -酪蛋白+K -酪蛋白）
[0091] 其中：
[0092] M待检样品（X)
[0093] =待检样品中X的trace值/A中X的trace值
[0094] XA中X的上样量（y g)
[0095] X :代表不同的蛋白质（a-酪蛋白、P -酪蛋白、K-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳 白蛋白或乳球蛋白）；A:代表乳清蛋白标准品或酪蛋白标准品。
[0096] 如待检样品中a-酪蛋白的质量的计算公式如下：
[0097] M待检样品a-酪蛋白）
[0098] =待检样品中a -酪蛋白的trace值
[0099] /酪蛋白标准品中a -酪蛋白的trace值
[0100] X酪蛋白标准品中a -酪蛋白的上样量（ii g)
[0101] A标准品中X的上样量（]i g)
[0102] = A标准品上样量（ii g) X X在A标准品中所占的比例
[0103] 如酪蛋白标准品中a -酪蛋白的上样量：
[0104] 酪蛋白标准品中a -酪蛋白的上样量（iig)
[0105] =酪蛋白标准品的上样量（y g) X [V(l+3+4)]
[0106] 所述酪蛋白标准品和乳清蛋白标准品的上样量的质量分别为4.25 yg和 3. 575 u g〇
[0107] 自配乳基婴幼儿配方粉内乳清蛋白含量的测定结果如表1所示：
[0108] 表1自配乳基婴幼儿配方粉内乳清蛋白含量的测定
【权利要求】
1. 一种测定乳基婴幼儿配方粉中乳清蛋白含量的方法，其特征在于，所述方法包括以 下的步骤： ① 待检样品上样液的制备：将待检样品搅拌并充分溶解于去离子水中，然后与 SDS-PAGE上样缓冲液混合均匀，水浴煮沸，迅速移入到冰水中冷却，即得所述待检样品上样 液；所述待检样品指非水解的乳基婴幼儿配方粉； ② 酪蛋白标准品和乳清蛋白标准品上样液的制备：将a-酪蛋白、￠-酪蛋白和k-酪 蛋白溶解于水得酪蛋白标准品的混合样；将0 _乳球蛋白、a _乳白蛋白和血清白蛋白溶解 于水得乳清蛋白标准品的混合样；将所述酪蛋白标准品的混合样和所述乳清蛋白标准品的 混合样分别和SDS-PAGE上样缓冲液混合均匀，水浴煮沸，然后迅速移入到冰水中冷却，即 得酪蛋白标准品上样液和乳清蛋白标准品上样液； ③ 聚丙烯酰胺凝胶电泳：将步骤①所述待检样品上样液、步骤②所述酪蛋白标准品上 样液和所述乳清蛋白标准品上样液上样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，得聚丙烯酰胺凝胶； ④ 染色与脱色：移出步骤③所述的聚丙烯酰胺凝胶，用染色液染色即得染色的凝胶； 将所述染色的凝胶用脱色液脱色至背景透明，即得脱色的凝胶； ⑤ 成像与计算：将步骤④所述脱色的凝胶置于凝胶成像系统内，用图像处理软件分析 记录所述待检样品对应泳道各条带的trace值，对照所述酪蛋白标准品和所述乳清蛋白标 准品对应泳道各条带的trace值，并根据步骤③所上样的酪蛋白标准品或乳清蛋白标准品 的质量，计算所述待检样品中乳清蛋白占总蛋白的比例，所述的trace值为SDS-PAGE的光 密度扫描图谱内蛋白质对应峰的峰面积。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤①中，所述水为去离子水；所述待检样 品上样液的蛋白质含量的终浓度在2mg/mL?4mg/mL范围内；所述SDS-PAGE上样缓冲液 为2 X SDS-PAGE上样缓冲液；所述2 X SDS-PAGE上样缓冲液的pH值为6. 8,含有Tris-HCL lOOmM，SDSO. 05kg/L，溴酚兰0? 002kg/L，0 -巯基乙醇0? lkg/L，甘油20 %，所述百分比为体 积百分比；和/或，所述煮沸的时间为2?8min。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤①中，所述水为超纯水；所述待检样品 上样液的蛋白质含量的终浓度为3mg/mL ;和/或，所述煮沸的时间为3?5min。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤②中，所述酪蛋白标准品混合样由包 括以下步骤的方法制备而得：将a-酪蛋白、￠-酪蛋白和k-酪蛋白以质量比4:3:1的 比例溶解于水获得终蛋白浓度为1. 70mg/mL的水溶液，即得酪蛋白标准品混合样；所述 乳清蛋白标准品混合样由包括以下步骤的方法制备而得：将￠-乳球蛋白、乳白蛋白 和血清白蛋白以质量比8:3:1的比例溶解于水获得终蛋白浓度为1.43mg/mL的水溶液， 即得乳清蛋白标准品混合样；所述SDS-PAGE上样缓冲液为2XSDS-PAGE上样缓冲液，所 述2XSDS-PAGE上样缓冲液的pH值为6. 8,含有Tris-HCL lOOmM，SDSO. 05kg/L，溴酚兰 0.002kg/L，￠-巯基乙醇0. lkg/L，甘油20%，所述百分比为体积百分比；和/或，所述煮沸 的时间为2?8min。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤②中，所述煮沸的时间为3?5min。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤③中，所述待检样品上样液的上样量为 2?6 y L ;所述酪蛋白标准品上样液的上样量为2?8 y L ;所述乳清蛋白标准品上样液的 上样量为2?8 y L ;所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳的条件为35?45mA恒流电泳30?50min 后，电流调为25?35mA恒流，电泳至蓝色条带距胶底部0. 5cm处；所述聚丙烯酰胺凝胶电 泳的电泳液pH值为8. 6,含有Tris 25mM/L，甘氨酸192mM/L，SDS lg/L ;和/或，所述聚丙 烯酰胺凝胶电泳的凝胶为5%的浓缩胶或12%的分离胶，所述百分比为质量体积百分比。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤③中，所述待检样品上样液的上样量为 4U L ;所述酪蛋白标准品上样液的上样量为5 y L ;所述乳清蛋白标准品上样液的上样量为 5 y L ;和/或，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳的条件为40mA恒流电泳40min后，电流调为30mA 恒流，电泳至蓝色条带距胶底部0. 5cm处。
8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤④中，所述的染色液为考马斯亮蓝染色 液；所述的脱色液为冰醋酸7. 5%、甲醇10%的水溶液，所述百分比为质量百分比；和/或， 所述的染色的时间为1?2小时。
9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤④中，所述的染色液为0. 1 %的考马 斯亮蓝染色液，所述〇. 1 %的考马斯亮蓝染色液为冰醋酸7. 5%，甲醇10%，考马斯亮蓝 R-2500. 1 %的水溶液，所述百分比为质量百分比；和/或，所述的染色的时间为1. 5小时。
10. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤⑤中，所述的图像处理软件为 Quantity One图像处理软件；所述峰面积的获得是利用所述Quantity One图像处理软件， 经过高斯建模后，以高斯建模后的trace值作为蛋白质的最终trace值；所述计算的方法 为：分别将待检样品上样液中a-酪蛋白、￠-酪蛋白、k-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳白 蛋白和￠-乳球蛋白的trace值除以在酪蛋白标准品上样液或乳清蛋白标准品上样液中各 蛋白对应的trace值，再分别乘以在酪蛋白标准品上样液或乳清蛋白标准品上样液中各蛋 白所对应的质量，分别计算出待检样品中6种蛋白的质量；最后通过待检样品中3种乳清蛋 白，即血清白蛋白、a-乳白蛋白和￠-乳球蛋白的质量之和，与6种蛋白，S卩a-酪蛋白、 酪蛋白、K-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳白蛋白和￠-乳球蛋白的质量之和的比值计算 得出乳清蛋白占总蛋白的百分比。
【文档编号】G01N33/68GK104360078SQ201410722848
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年12月2日 优先权日:2014年12月2日
【发明者】贾宏信, 郭本恒 申请人:光明乳业股份有限公司