一种基于HS-β-CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器的制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于免疫分析和生物传感【技术领域】，其公开了一种基于HS-β-CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器的制备方法及应用，用于快速检测猪瘟病毒抗原CSFV。其制作方案是：以裸铂碳电极为工作电极，将MWCNTs-CD-Fc-Ab1对其进行修饰，然后依次加入牛血清白蛋白、猪瘟病毒抗原CSFV以及Ab2-HS-β-CD-Ag-GOD共轭物。HS-β-CD-Ag-GOD共轭物可以转化葡萄糖为葡萄糖酸，并传递两个质子和两个电子给氧分子，产生双氧水，HS-β-CD-Ag纳米材料作为一种模拟酶，催化双氧水的还原，实现了电化学信号的双重放大，实现了较高的灵敏度，检测限可低至0.33pg/mL。
【专利说明】—种基于HS- β -CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于免疫分析与生物传感【技术领域】，具体涉及一种基于HS-β -⑶-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器的制备及应用，研制一种快速检测猪瘟病毒抗原CSFV的夹心型电化学免疫传感器。
【背景技术】
[0002]猪瘟病毒抗原CSFV，或称猪霍乱，是一种急性、热性、高度接触性传染病，主要特征是高温、微血管变性而引起全身出血、坏死、梗塞。由于其高度的致病性和可引起广泛的死亡，给养猪业造成严重的经济损失。许多国家制定兽医法规，将猪瘟病毒列为法定传染病之一，也就是必须列表上报的疾病。发生疫情或可疑疫情，要尽快上报，立刻对疫点及其邻近牧场采取紧急兽医卫生防疫措施。
[0003]目前国内外绝大多数检测机构都在使用酶联免疫法对猪瘟病毒抗原CSFV进行检测。由于其检测周期长，程序复杂所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学生物化学，分子生物学的不断发展，电化学免疫传感器已经引起广泛的研究兴趣。
[0004]本发明采用夹心型电化学免疫传感器，结合双重放大技术，提高了传感器的检测灵敏度，另外，电化学免疫传感器以其选择性好、结构简单、操作简便、易于小型化、可连续、快速自动化检测分析等优点，可以被广泛的应用预防检测当中。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于避免传统检测方法的仪器设备复杂、操作过程繁琐、检测人员要求高、检测成本高等缺点，提供了一种灵敏度高、特异性强、重现性好、操作简便且价廉易得的检测猪瘟病毒抗原CSFV的夹心型电化学免疫传感器的制备方法。
[0006]为了实现上述目的，本发明是通过以下措施来实现的。本发明的技术方案，包括以下步骤。
[0007]1.一种基于HS- β -⑶-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器的制备方法
(1)将直径4mm的玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05 mm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，然后将电极置于5 mmol.Γ1铁氰化钾溶液中，在-0.2?0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于80 mV ；
(2)将pH7.0,0.1 mo I/L的磷酸盐缓冲溶液分散的MWCNTs-⑶-Fc-Ab1修饰于玻碳电极表面，室温干燥，所述MWCNTs-CD-Fc-Ab1的浓度为1.0?3.0 mg.mL—1 ；
(3)滴涂3μ?,ΙΟΟ Pg 的牛血清白蛋白溶液至电极表面，4°C下湿润条件下晾干；
(4)滴涂6μ?、0.001?5.0 ng.mL—1的猪瘟病毒抗原CSFV标准溶液至电极表面，4°C下湿润条件下晾干；
(5)滴涂6?的Ab2-⑶-Ag-GOD溶液至电极表面,4°C下湿润条件下晾干,制得一种基于HS- β -⑶-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器。
[0008]2.如上所述Ab2-HS- β -CD-Ag-GOD共轭物溶液的制备方法
(1)HS- β -⑶-Ag纳米材料的制备
将 I mL，0.005-0.015 mol/L 的 AgNO3 和 I mL，0.02-0.04 mol/L 的柠檬酸三钠加入到97 mL的高纯水中，搅拌均匀，震荡滴加I mL，1.5-2.0 mg/mL的NaBH4，充分搅拌20 min，加Λ 0.0238 g的巯基化β环糊精HS-β-⑶，磁力搅拌24 h，转速为11000 rpm的条件下离心10 min，恒温60 1:真空干燥；
(2)金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD的制备
称取25-41 mg金刚烷甲酸ADA于40 mL超纯水中，加入200 μ L，0.5-1.5 mol/mL的NaOH溶液，溶液澄清后稀释至100 mL，在1-3 mL的金刚烷甲酸ADA溶液中加入10 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS和2 mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液，室温搅拌0.5 h，加入200 μ L，0.5-1.5 mg/mL的葡萄糖氧化酶，恒温4 °C过夜，转速为8000 rpm的条件下离心8 min，于-20 °C的条件下保存，制得100-300μ g/mL的金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD溶液；
(3)金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab2的制备
称取25-41 mg金刚烷甲酸ADA于40 mL超纯水中，加入200 μ L，0.5-1.5 mol/mL的NaOH溶液，溶液澄清后稀释至100 mL，在1-3 mL的金刚烷甲酸ADA溶液中加入10 mg 1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS和2 mL,pH为7.4的PBS缓冲溶液，室温搅拌0.5 h，加入200 μ L，0.5-1.5 mg/mL检测抗体Ab2,恒温4 °C过夜，转速为8000 rpm的条件下离心8 min，加入I mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液，于-20 V的条件下保存，制得100-300 μ g/mL的金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab2溶液；
(4)Ab2-HS- β -CD-Ag-GOD共轭物溶液的制备
将金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab2和金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD 稀释至 40-60 μ g/mL,取 200 μ L, 40-60 μ g/mL ADA-Ab2 和 200 μ L, 40-60 μ g/mL ADA-G0D，加入 200 μ L,3-5 mg/mL HS-β-CD-Ag，恒温 4 1:孵化过夜，转速为 8000 rpm的条件下离心8 min，弃去上清液，加入200 μ L，pH为7.4的PBS缓冲溶液，于-20 °C的条件下保存，制得Ab2-HS- β -CD-Ag-GOD共轭物溶液；
(5)多壁碳纳米管-β-环糊精-二茂铁MWCNTs-⑶-Fe复合材料的制备
称取0.4-0.6 g多壁碳纳米管MWCNTs，加入到已配好的H2SO4和HNO3为3:1的混合溶液中，恒温40 °C超声3 h，冷却至室温，用超纯水稀释到500 mL,使用0.22 μπι的滤膜进行真空抽滤，超纯水洗涤到PH为中性，恒温60 1:真空干燥，制得羧基化多壁碳纳米管MWCNTs-COOH ；
称取20-30 mg MWCNTs-COOH，分散到50 mL超纯水中，然后加入150-250 mg的β-环糊精⑶，震荡12 h，离心，水洗4次，恒温60 °C真空干燥，60-100 mg 二茂铁甲酸Fe加入到50mL的二氯甲烷中，加入20-30 mg MWCNTs-⑶，搅拌12 h，离心干燥，得多壁碳纳米管-β-环糊精-二茂铁MWCNTs-CD-Fc复合材料；
(6)多壁碳纳米管-β-环糊精-二茂铁-捕获抗体MWCNTs-⑶-Fc-Ab1的制备
称取3-5 mg的MWCNTs-CD-Fc分散到2 mL, pH为7.4的PBS缓冲溶液中，加入10 mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS，恒温4 °C搅拌0.5 h,加入200 UL, 0.5-1.5 mg/mL捕获抗体Ab1,恒温4 °C震荡12h，制得多壁碳纳米管-β -环糊精-二茂铁-捕获抗体MWCNTs-⑶-Fc-Ab115
[0009]3.猪瘟病毒抗原CSFV的检测方法
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，钼丝电极为辅助电极，所制备的一种基于HS-β -CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器为工作电极，在10 mL、4(T60 mmol/L的pH6.0?8.0磷酸盐缓冲溶液中测定其电流变化；
(2)根据所得电流差值与猪瘟病毒抗原CSFV浓度呈线性关系，绘制工作曲线；
(3)依据工作曲线的绘制方法进行样品中猪瘟病毒抗原CSFV的检测，检测结果从工作曲线中查得。
[0010]本发明的有益成果
(1)本发明是基于HS-β-⑶-Ag-GOD共轭物，构建了一种夹心型电化学免疫传感器，金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD可以转化葡萄糖为葡萄糖酸，并传递两个质子和两个电子给氧分子，产生双氧水，HS-β-CD-Ag纳米材料作为一种模拟酶，催化双氧水的还原，实现了电化学信号的双重放大；
(2)本发明采用的HS-β-CD-Ag纳米材料具有良好的分子识别能力，可以有效地捕捉金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD和金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab2 ；
(3)本发明利用MWCNTs-CD-Fc复合材料大的比表面积，良好的生物相容性和高的导电性，来有效地固定捕获抗体Ab1，提高免疫传感的检测灵敏度；
(4)本发明将该传感器应用于猪瘟病毒抗原CSFV的高灵敏、特异性检测，线性范围为0.001-5 ng/mL,检出限为 0.33 pg/mL。
【具体实施方式】
[0011 ] 实施例1 HS- β -⑶-Ag纳米材料的制备
将I mL，0.005 mol/L的AgNO3和I mL，0.02 mol/L的柠檬酸三钠加入到97 mL的高纯水中，搅拌均匀，震荡滴加I mL, 1.5 mg/mL的NaBH4，充分搅拌20 min，加入0.0238 g的巯基化β环糊精HS-β -⑶,磁力搅拌24 h,转速为11000 rpm的条件下离心10 min,恒温60 °C真空干燥；
实施例2 HS- β -⑶-Ag纳米材料的制备
将I mL，0.01 mol/L的AgNO3和I mL，0.03 mol/L的柠檬酸三钠加入到97 mL的高纯水中，搅拌均匀，震荡滴加I mL, 1.79 mg/mL的NaBH4，充分搅拌20 min，加入0.0238 g的巯基化β环糊精HS-β -⑶,磁力搅拌24 h,转速为11000 rpm的条件下离心10 min,恒温60 °C真空干燥；
实施例3 HS- β -⑶-Ag纳米材料的制备
将I mL，0.015 mol/L的AgNO3和I mL, 0.04 mol/L的柠檬酸三钠加入到97 mL的高纯水中，搅拌均匀，震荡滴加I mL, 2.0 mg/mL的NaBH4，充分搅拌20 min，加入0.0238 g的巯基化β环糊精HS-β -⑶,磁力搅拌24 h,转速为11000 rpm的条件下离心10 min,恒温60 °C真空干燥；
实施例4金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD的制备称取25 mg金刚烷甲酸ADA于40 mL超纯水中，加入200 μ L,0.5 mol/mL的NaOH溶液，溶液澄清后稀释至100 mL，在I mL的金刚烷甲酸ADA溶液中加入10 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS和2 mL, pH为7.4的PBS缓冲溶液，室温搅拌0.5 h，加入200 μ L，0.5 mg/mL的葡萄糖氧化酶，恒温4 °C过夜，转速为8000 rpm的条件下离心8 min,于-20 V的条件下保存，制得100 μ g/mL的金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD溶液；
实施例5金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD的制备称取33 mg金刚烷甲酸ADA于40 mL超纯水中，加入200 μ L，I mol/mL的NaOH溶液，溶液澄清后稀释至100 mL，在2 mL的金刚烷甲酸ADA溶液中加入10 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS和2 mL, pH为7.4的PBS缓冲溶液，室温搅拌0.5 h，加入200 μ L，I mg/mL的葡萄糖氧化酶，恒温4 °C过夜，转速为8000 rpm的条件下离心8 min，于-20 °C的条件下保存，制得200 μ g/mL的金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD溶液；
实施例6金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD的制备称取41 mg金刚烷甲酸ADA于40 mL超纯水中，加入200 μ L，1.5 mol/mL的NaOH溶液，溶液澄清后稀释至100 mL，在1-3 mL的金刚烷甲酸ADA溶液中加入10 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS和2 mL, pH为7.4的PBS缓冲溶液，室温搅拌0.5 h，加入200 μ L，1.5 mg/mL的葡萄糖氧化酶，恒温4 °C过夜，转速为8000 rpm的条件下离心8 min,于-20 V的条件下保存，制得300 μ g/mL的金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD溶液；
实施例7金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab2的制备
称取25 mg金刚烷甲酸ADA于40 mL超纯水中，加入200 yL,0.5 mol/mL的NaOH溶液，溶液澄清后稀释至100 mL，在1-3 mL的金刚烷甲酸ADA溶液中加入10 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS和2 mL, pH为7.4的PBS缓冲溶液，室温搅拌0.5 h，加入200 UL, 0.5 mg/mL检测抗体Ab2，恒温4 °C过夜，转速为8000 rpm的条件下离心8 min，加入I mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液，于-20 °〇的条件下保存，制得100 μ g/mL的金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab2溶液；
实施例8金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab2的制备
称取33 mg金刚烷甲酸ADA于40 mL超纯水中，加入200 μ L，I mol/mL的NaOH溶液，溶液澄清后稀释至100 mL，在2 mL的金刚烷甲酸ADA溶液中加入10 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS和2 mL, pH为7.4的PBS缓冲溶液，室温搅拌0.5 h，加入200 μ L，I mg/mL检测抗体Ab2，恒温4 °C过夜，转速为8000 rpm的条件下离心8 min，加入I mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液，于-20 °C的条件下保存，制得200 μ g/mL的金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab2溶液；
实施例9金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab2的制备
称取41 mg金刚烷甲酸ADA于40 mL超纯水中，加入200 μ L，1.5 mol/mL的NaOH溶液，溶液澄清后稀释至100 mL，在1-3 mL的金刚烷甲酸ADA溶液中加入10 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS和2 mL, pH为7.4的PBS缓冲溶液，室温搅拌0.5 h，加入200 UL, 1.5 mg/mL检测抗体Ab2，恒温4 °C过夜，转速为8000 rpm的条件下离心8 min，加入I mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液，于-20 °〇的条件下保存，制得300 μ g/mL的金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab2溶液。
[0012]实施例10 Ab2-HS- β -CD-Ag-GOD共轭物溶液的制备
将金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab2和金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD稀释至 40 yg/mL，取 200 μ L,40 μ g/mL ADA-Ab2 和 200 μ L,40 μ g/mL ADA-GOD,加入200 yL,3 mg/mL HS-β-CD-Ag，恒温4 1:孵化过夜，转速为8000 rpm的条件下离心8 min,弃去上清液，加入200 μ L，pH为7.4的PBS缓冲溶液，于-20 °C的条件下保存，制得 Ab2-HS- β -CD-Ag-GOD 共轭物溶液；
实施例11 Ab2-HS- β -CD-Ag-GOD共轭物溶液的制备
将金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab2和金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD稀释至 50 yg/mL，取 200 μ L,50 μ g/mL ADA-Ab2 和 200 μ L,50 μ g/mL ADA-GOD,加入200 μ L,4 mg/mL HS-β-Q)-Ag,恒温4。(!'孵化过夜,转速为8000 rpm的条件下离心8 min,弃去上清液，加入200 μ L，pH为7.4的PBS缓冲溶液，于-20 °C的条件下保存，制得 Ab2-HS- β -CD-Ag-GOD 共轭物溶液；
实施例12 Ab2-HS- β -CD-Ag-GOD共轭物溶液的制备
将金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab2和金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD稀释至 60 yg/mL，取 200 μ L,60 μ g/mL ADA-Ab2 和 200 μ L,60 μ g/mL ADA-GOD,加入200 yL,5 mg/mL HS-β-CD-Ag，恒温4 1:孵化过夜，转速为8000 rpm的条件下离心8 min,弃去上清液，加入200 μ L，pH为7.4的PBS缓冲溶液，于-20 °C的条件下保存，制得 Ab2-HS- β -CD-Ag-GOD 共轭物溶液；
实施例13多壁碳纳米管-β -环糊精-二茂铁MWCNTs-CD-Fc复合材料的制备称取0.4g多壁碳纳米管MWCNTs，加入到已配好的H2SO4和HNO3为3:1的混合溶液中，恒温40 °C超声3 h，冷却至室温，用超纯水稀释到500 mL,使用0.22 μ m的滤膜进行真空抽滤，超纯水洗涤到PH为中性，恒温60 °C真空干燥，制得羧基化多壁碳纳米管MWCNTs-COOH ；
称取20mg MWCNTs-COOH，分散到50 mL超纯水中，然后加入150 mg的β -环糊精CD，震荡12 h,离心,水洗4次,恒温60。(!'真空干燥,60 mg 二茂铁甲酸Fe加入到50 mL的二氯甲烷中，加入20 mg MWCNTs-⑶，搅拌12 h，离心干燥，得多壁碳纳米管-β -环糊精-二茂铁MWCNTs-CD-Fc复合材料；
实施例14多壁碳纳米管-β -环糊精-二茂铁MWCNTs-⑶-Fe复合材料的制备称取0.5 g多壁碳纳米管MWCNTs，加入到已配好的H2SO4和HNO3为3:1的混合溶液中，恒温40 °C超声3 h，冷却至室温，用超纯水稀释到500 mL,使用0.22 μ m的滤膜进行真空抽滤，超纯水洗涤到PH为中性，恒温60 °C真空干燥，制得羧基化多壁碳纳米管MWCNTs-COOH ；
称取25 mg MWCNTs-COOH，分散到50 mL超纯水中，然后加入200 mg的β-环糊精CD，震荡12 h,离心,水洗4次,恒温60。(!'真空干燥,80 mg 二茂铁甲酸Fe加入到50 mL的二氯甲烷中，加入25 mg MWCNTs-⑶，搅拌12 h，离心干燥，得多壁碳纳米管-β -环糊精-二茂铁MWCNTs-CD-Fc复合材料；
实施例15多壁碳纳米管-β -环糊精-二茂铁MWCNTs-⑶-Fe复合材料的制备称取0.6 g多壁碳纳米管MWCNTs，加入到已配好的H2SO4和HNO3为3:1的混合溶液中，恒温40 °C超声3 h，冷却至室温，用超纯水稀释到500 mL,使用0.22 μ m的滤膜进行真空抽滤，超纯水洗涤到PH为中性，恒温60 °C真空干燥，制得羧基化多壁碳纳米管MWCNTs-COOH ；
称取30 mg MWCNTs-COOH，分散到50 mL超纯水中，然后加入250 mg的β-环糊精CD，震荡12 h，离心，水洗4次，恒温60 °C真空干燥，100 mg 二茂铁甲酸Fe加入到50 mL的二氯甲烷中，加入30 mg MWCNTs-⑶，搅拌12 h，离心干燥，得多壁碳纳米管-β -环糊精-二茂铁MWCNTs-CD-Fc复合材料；
实施例16多壁碳纳米管-β -环糊精-二茂铁-捕获抗体MWCNTs-CD-Fc-Ab1的制备称取3 mg的MWCNTs-CD-Fc分散到2 mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液中，加入10 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS，恒温4 V搅拌0.5 h，加入200 UL, 0.5 mg/mL捕获抗体Ab1,恒温4 °C震荡12h，制得多壁碳纳米管-β -环糊精-二茂铁-捕获抗体MWCNTs-⑶-Fe- Ab1 ；
实施例17多壁碳纳米管-β -环糊精-二茂铁-捕获抗体MWCNTs-⑶-Fc-Ab1的制备称取4 mg的MWCNTs-CD-Fc分散到2 mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液中，加入10 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS，恒温4 V搅拌0.5 h,加入200 uL, I mg/mL捕获抗体Ab1,恒温4 °C震荡12h，制得多壁碳纳米管-β -环糊精-二茂铁-捕获抗体MWCNTs-CD-Fc-Ab1 ；
实施例18多壁碳纳米管-β -环糊精-二茂铁-捕获抗体MWCNTs-⑶-Fc-Ab1的制备称取5 mg的MWCNTs-CD-Fc分散到2 mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液中，加入10 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS，恒温4 V搅拌0.5 h，加入200 UL, 1.5 mg/mL捕获抗体Ab1,恒温4 °C震荡12h，制得多壁碳纳米管-β -环糊精-二茂铁-捕获抗体MWCNTs-⑶-Fc-Ab1 ；
实施例19猪瘟病毒抗原CSFV的检测方法
实施例f 18中任一所述的一种高灵敏猪瘟病毒抗原CSFV免疫传感器，用于猪瘟病毒抗原CSFV的检测，包括以下步骤:
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，钼丝电极为辅助电极，所制备的一种基于HS-β -CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器为工作电极，在10 mL、40mmol/L的pH6.0磷酸盐缓冲溶液中测定其电流变化；
(2)根据所得电流差值与猪瘟病毒抗原CSFV浓度呈线性关系，绘制工作曲线；
(3)依据工作曲线的绘制方法进行样品中猪瘟病毒抗原CSFV的检测，检测结果从工作曲线中查得。
[0013]实施例20猪瘟病毒抗原CSFV的检测方法
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，钼丝电极为辅助电极，所制备的一种基于HS-β -CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH7.0磷酸盐缓冲溶液中测定其电流变化；
(2)根据所得电流差值与猪瘟病毒抗原CSFV浓度呈线性关系，绘制工作曲线；
(3)依据工作曲线的绘制方法进行样品中猪瘟病毒抗原CSFV的检测，检测结果从工作曲线中查得。
[0014]实施例21猪瘟病毒抗原CSFV的检测方法
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，钼丝电极为辅助电极，所制备的一种基于HS-β -CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器为工作电极，在10 mL、60 mmol/L的pH 8.0磷酸盐缓冲溶液中测定其电流变化；
(2)根据所得电流差值与猪瘟病毒抗原CSFV浓度呈线性关系，绘制工作曲线；
(3)依据工作曲线的绘制方法进行样品中猪瘟病毒抗原CSFV的检测，检测结果从工作曲线中查得。
【权利要求】
1.一种基于HS-β -⑶-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器的制备方法,其特征在于，步骤如下: (1)将直径4mm的玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05 mm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，然后将电极置于5 mmol.Γ1铁氰化钾溶液中，在-0.2?0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于80 mV ； (2)将pH7.0,0.1 mo I/L的磷酸盐缓冲溶液分散的MWCNTs-⑶-Fc-Ab1修饰于玻碳电极表面，室温干燥，所述MWCNTs-CD-Fc-Ab1的浓度为1.0?3.0 mg.mL—1 ； (3)滴涂3μ?,ΙΟΟ Pg 的牛血清白蛋白溶液至电极表面，4°C下湿润条件下晾干； (4)滴涂6μ?、0.001?5.0 ng.mL—1的猪瘟病毒抗原CSFV标准溶液至电极表面，4°C下湿润条件下晾干； (5)滴涂6?的Ab2-⑶-Ag-GOD溶液至电极表面,4°C下湿润条件下晾干,制得一种基于HS- β -⑶-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器。
2.如权利要求1所述的一种基于HS-β-CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器的制备方法，所述Ab2-HS- β -⑶-Ag-GOD共轭物溶液的制备方法，步骤如下: (1)HS- β -⑶-Ag纳米材料的制备 将 I mL，0.005-0.015 mol/L 的 AgNO3 和 I mL，0.02-0.04 mol/L 的柠檬酸三钠加入到97 mL的高纯水中，搅拌均匀，震荡滴加I mL，1.5-2.0 mg/mL的NaBH4，充分搅拌20 min，加入0.0238 g的巯基化β环糊精HS-β-⑶，磁力搅拌24 h，转速为11000 rpm的条件下离心10 min，恒温60 1:真空干燥； (2)金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD的制备 称取25-41 mg金刚烷甲酸ADA于40 mL超纯水中，加入200 μ L,0.5-1.5 mol/mL的NaOH溶液，溶液澄清后稀释至100 mL，在1-3 mL的金刚烷甲酸ADA溶液中加入10 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS和2 mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液，室温搅拌0.5 h，加入200 μ?, 0.5-1.5 mg/mL的葡萄糖氧化酶，恒温4 °C过夜，转速为8000 rpm的条件下离心8 min，于-20 °C的条件下保存，制得100-300Kg/mL的金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD溶液； (3)金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab2的制备 称取25-41 mg金刚烷甲酸ADA于40 mL超纯水中，加入200 μ?,Ο.5-1.5 mol/mL的NaOH溶液，溶液澄清后稀释至100 mL，在1-3 mL的金刚烷甲酸ADA溶液中加入10 mg 1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS和2 mL,pH为7.4的PBS缓冲溶液，室温搅拌0.5 h，加入200 μ?, 0.5-1.5 mg/mL检测抗体Ab2,恒温4 °C过夜，转速为8000 rpm的条件下离心8 min，加入I mL，pH为7.4的PBS缓冲溶液，于-20 V的条件下保存，制得100-300 Pg/mL的金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab2溶液； (4)Ab2-HS- β -CD-Ag-GOD共轭物溶液的制备 将金刚烷甲酸功能化的检测抗体ADA-Ab2和金刚烷甲酸功能化的葡萄糖氧化酶ADA-GOD 稀释至 40-60 Pg/mL，取 200 μ?, 40-60 Pg/mL ADA-Ab2 和 200 μ?, 40-60 Pg/mLADA-GOD,加入 200 μ?, 3-5 mg/mL HS- β _CD_Ag，恒温 4 V孵化过夜，转速为 8000 rpm 的条件下离心8 min,弃去上清液，加入200 μ?, pH为7.4的PBS缓冲溶液，于-20 V的条件下保存，制得Ab2-HS- β -CD-Ag-GOD共轭物溶液； (5)多壁碳纳米管-β-环糊精-二茂铁MWCNTs-⑶-Fe复合材料的制备 称取0.4-0.6 g多壁碳纳米管MWCNTs，加入到已配好的H2SO4和HNO3为3:1的混合溶液中，恒温40 °C超声3 h，冷却至室温，用超纯水稀释到500 mL，使用0.22 Mm的滤膜进行真空抽滤，超纯水洗涤到PH为中性，恒温60 °C真空干燥，制得羧基化多壁碳纳米管MWCNTs-COOH ； 称取20-30 mg MWCNTs-COOH，分散到50 mL超纯水中，然后加入150-250 mg的β -环糊精⑶，震荡12 h，离心，水洗4次，恒温60 °C真空干燥，60-100 mg 二茂铁甲酸Fe加入到50mL的二氯甲烷中，加入20-30 mg MWCNTs-⑶，搅拌12 h，离心干燥，得多壁碳纳米管-β -环糊精-二茂铁MWCNTs-CD-Fc复合材料； (6)多壁碳纳米管-β-环糊精-二茂铁-捕获抗体MWCNTs-⑶-Fc-Ab1的制备 称取3-5 mg的MWCNTs-CD-Fc分散到2 mL, pH为7.4的PBS缓冲溶液中，加入10 mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐EDC、10 mg N-羟基丁二酰亚胺NHS，恒温4 °C搅拌0.5 h,加入200 μ?, 0.5-1.5 mg/mL捕获抗体Ab1,恒温4 °C震荡12h，制得多壁碳纳米管-β -环糊精-二茂铁-捕获抗体MWCNTs-⑶-Fc-Ab115
3.如权利要求1所述的制备方法制备的一种基于HS-β -CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器，用于猪瘟病毒抗原CSFV检测，其特征在于，包括如下步骤: (1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，钼丝电极为辅助电极，所制备的一种基于HS-β -CD-Ag-GOD共轭物的电化学免疫传感器为工作电极，在10 mL、4(T60 mmol/L的pH6.0?8.0磷酸盐缓冲溶液中测定其电流变化； (2)根据所得电流差值与猪瘟病毒抗原CSFV浓度呈线性关系，绘制工作曲线； (3)依据工作曲线的绘制方法进行样品中猪瘟病毒抗原CSFV的检测，检测结果从工作曲线中查得。
【文档编号】G01N33/569GK104459124SQ201410727327
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月4日 优先权日:2014年12月4日
【发明者】吴丹, 高健, 魏琴, 闫涛, 马洪敏, 张勇, 罗川南, 杜斌, 庞雪辉 申请人:济南大学