一种用于检测铅的生物传感器及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于检测铅的生物传感器及其制备方法和应用，该生物传感器包括一在三电极系统中用作工作电极的玻碳电极，玻碳电极的反应端表面修饰有L-赖氨酸，L-赖氨酸表面修饰有有序介孔碳-金纳米粒子，有序介孔碳-金纳米粒子表面修饰有纳米金膜，纳米金膜表面组装有DNAzyme探针，DNAzyme探针与DNA探针通过互补配对连接。其制备方法包括修饰L-赖氨酸、修饰有序介孔碳-金纳米粒子、电沉积纳米金膜，组装DNAzyme探针等步骤。其应用方法为将生物传感器插入待测溶液中，根据铅离子浓度与阻值差的变化测定待测溶液中的铅离子浓度。本发明的生物传感器具有制作简单、使用寿命长、抗干扰能力强、检测精度和效率高等优势。
【专利说明】一种用于检测铅的生物传感器及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物传感器【技术领域】，尤其涉及一种用于检测铅的生物传感器及其制 备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 随着工业进步和社会发展，水污染状况日趋严重，已经成为世界性的头号环境治 理难题。中国作为世界上最大的发展中国家，随着城市化进程的加速，工农业的飞速发展， 大量环境污染物排入水体中，造成了严重的环境污染以及生态破坏，并直接危害人类的健 康。在排入水体的大量环境污染物中，重金属污染的危害尤为严重。人类摄入被重金属镉 污染的水、食物后，会造成肾和骨骼的病变，摄入硫酸镉20毫克，就会造成死亡。人类摄入 含砷的水、食物后，会发生急性或慢性中毒，重金属砷会使体内酶活性受到抑制或失活，造 成机体代谢障碍，甚至引发皮肤癌。人类摄入被重金属铅污染的水、食物后，导致人体贫血， 并出现头痛、晕眩、乏力、困倦等症状。
[0003] 铅是一种蓄积性的元素，可以通过食物链在生物组织富集，对人类的健康以及自 然界环境造成巨大危害。并且铅对机体的损伤呈现多系统性、多器官性，作为中枢神经系统 毒物，对儿童的健康和危害更为严重。现行国家环境标准监测方法中规定水质铅的测定有 双硫腙分光光度法和火焰原子吸收分光光度法，检出浓度最低能达到0. 〇lmg/L，这些方法 虽然灵敏度高、特异性强，但样品前处理复杂、仪器昂贵或者耗时长，需要专门的操作技术 人员，检测成本高，经济效益相对较低。所以研宄出一种快速、简便、低成本、高灵敏度的铅 离子检测手段具有十分重要的意义。
[0004] 现今，电化学及生物学检测技术日益发展成熟，这为环境样品中重金属离子的快 速检测提供了各种可行的技术手段，如电化学分析法-阳极溶出伏安法（ASV)和重金属离 子的生物学检测方法等，其中重金属离子生物学检测方法包括免疫检测技术和DNA检测技 术。运用生物传感器来检测环境中的重金属、病原微生物、有毒有机物时，生物传感器具有 特异性强、检测灵敏度高、检测效率高、成本低廉的特点，因此成为了环境保护工作中的一 个研宄热点。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种使用寿命长、抗干扰 能力强、检测精度强和效率高的用于检测铅的生物传感器，此外相应提供一种方法简单、成 本低廉、制作快速的生物传感器的制备方法，在此基础上，还提供一种前述生物传感器的应 用，该应用能够以低成本、简化操作、快速响应、高检测精度及较强抗干扰性等特点实现对 铅尚子的尚效检测。
[0006] 为解决上述技术问题，提供了一种用于检测铅的生物传感器，包括一在三电极系 统中用作工作电极的玻碳电极，玻碳电极的反应端表面修饰有L-赖氨酸，L-赖氨酸表面修 饰有有序介孔碳-金纳米粒子，有序介孔碳-金纳米粒子表面修饰有纳米金膜，纳米金膜表 面组装有单链DNAzyme探针，DNA探针与DNAzyme探针通过互补配对连接。
[0007] 前述的生物传感器，优选的，DNAzyme探针为具有SEQ ID NO. 1的核苷酸序列，DNA 探针为具有SEQ ID NO. 2的核苷酸序列。具有SEQ ID NO. 1的核苷酸序列和具有SEQ ID NO. 2的核苷酸序列互补配对形成双链探针。当生物传感器用于检测时，如果检测环境中存 在铅离子，双链断开，导致界面电阻发生改变，根据浓度与电阻之间的关系达到检测环境中 铅离子的目的。
[0008] 在本发明的技术方案中，DNAzyme探针为用于检测铅的DNAzyme探针，DNA探针和 用于检测铅的DNAzyme探针并不仅限于本发明提供的两条核苷酸序列，任一用于检测铅的 DNAzyme探针与之配对的DNA探针进行结合后，均能实现对铅离子的检测，并达到相同或相 似的技术效果。
[0009] 作为本发明的同一技术构思，本发明还提供了上述的生物传感器的制备方法，包 括以下步骤：
[0010] S1、修饰L-赖氨酸：制作一玻碳电极，将L-赖氨酸电沉积于玻碳电极的反应端表 面得到L-赖氨酸修饰的玻碳电极；
[0011] S2、修饰有序介孔碳-金纳米粒子：在L-赖氨酸修饰的玻碳电极的反应端表面滴 加有序介孔碳-金纳米粒子得到有序介孔碳-金纳米粒子/L-赖氨酸修饰的玻碳电极；
[0012]S3、电沉积纳米金：在有序介孔碳-金纳米粒子/L-赖氨酸修饰的玻碳电极的反应 端表面电沉积纳米金膜，得到纳米金膜/有序介孔碳-金纳米粒子/L-赖氨酸修饰的玻碳 电极；
[0013]S4、组装DNAzyme探针：在纳米金膜/有序介孔碳-金纳米粒子/L-赖氨酸修饰 的玻碳电极的反应端表面滴加DNAzyme探针，使DNAzyme探针通过金硫共价键固定在纳米 金膜/有序介孔碳-金纳米粒子/L-赖氨酸修饰的玻碳电极的反应端表面，得到组装有 DNAzyme探针的纳米金膜/有序介孔碳-金纳米粒子/L-赖氨酸修饰的玻碳电极；
[0014] S5、连接DNA探针：将组装有DNAzyme探针的纳米金膜/有序介孔碳-金纳米粒子 /L-赖氨酸修饰的玻碳电极浸泡在DNA探针溶液中培养，使DNAzyme探针与DNA探针进行互 补配对连接，完成生物传感器的制备。
[0015] 进一步的，步骤S2中的有序介孔碳-金纳米粒子是采用包括以下步骤的方法制 得：
[0016]S2-1、合成硅基分子筛SBA-15:将嵌段共聚物P123和正硅酸乙酯混合后在140? 150°C下油浴、然后焙烧得到硅基分子筛SBA-15 ;
[0017]S2-2、合成有序介孔碳：硅基分子筛SBA-15与水、蔗糖、浓硫酸混合得到混合物， 将混合物置于100?160°C温度下干燥直至混合物变为黑色；然后将黑色的混合物置于惰 性气体保护下进行高温热解得到热解产物，将热解产物进行洗涤、干燥步骤得到有序介孔 碳；
[0018] S2-3、在超声条件下，将所述步骤S2-2制备得到的有序介孔碳与氯金酸按照质量 比为1 : 50进行超声混合（超声混合时间是12h);然后依次加入1%柠檬酸钠、0.075%硼 氢化钠，再次超声（超声时间是30min)得到黑色溶液，将黑色溶液离心、洗涤、干燥，得到有 序介孔碳-金纳米粒子。
[0019] 优选的，步骤S2-2中，混合物中，硅基分子筛SBA-15与水、蔗糖、浓硫酸按照质量 比为I: 4?5 : 1.25 ?2.5 : 0.12 ?0.16。
[0020] 进一步的，步骤Sl具体为将玻碳电极浸入L-赖氨酸的水溶液中，用CV法扫 描-2. 0?+2.OV范围，30段，使玻碳电极表面形成一层L-赖氨酸薄膜，得到L-赖氨酸修饰 的玻碳电极。
[0021] 进一步的，赖氨酸的水溶液为浓度I.OXl(T3mol/L的L-赖氨酸水溶液，L-赖氨酸 水溶液采用pH为8. 0的PBS溶液配制；前述CV法的扫描速率为0. 05Vs'
[0022] 进一步的，步骤S2中将有序介孔碳-金纳米粒子配制成悬浮液滴加在L-赖氨酸 修饰的玻碳电极的反应端表面，有序介孔碳-金纳米粒子悬浮液的浓度为0. 5mg/mL。
[0023] 进一步的，步骤S3中，将有序介孔碳-金纳米粒子/L-赖氨酸修饰的玻碳电极放 入0. 1%HAuCljK溶液中，采用循环伏安法将纳米金粒子电沉积在前述修饰玻碳电极的反 应端表面，前述循环伏安法中扫描电位为0?I. 6V，扫描速率为20mV/s，扫描圈数为6圈， 得到纳米金膜/有序介孔碳-金纳米粒子/L-赖氨酸修饰的玻碳电极。
[0024] 进一步的，前述步骤S4具体为：将浓度为10?20μM的DNA滴加在前述纳米金膜 /有序介孔碳-金纳米粒子/L-赖氨酸修饰的玻碳电极的反应端表面，在4°C下反应12h(反 应时间还可以是12小时以上），再转入ImM的6-巯基乙醇溶液中培养1?2h得到前述组 装有DNA探针的修饰玻碳电极。优选的，DNA探针滴加的体积为5?10μL。
[0025] 作为本发明的同一技术构思，本发明还提供了一种采用前述的生物传感器或采用 前述制备方法制得的生物传感器在检测铅中的应用，包括以下步骤：
[0026] (1)以生物传感器的玻碳电极作为工作电极浸泡在铁氰、亚铁氰和KCl的混合溶 液中建立三电极系统，将前述三电极系统与电化学工作站连接，测试交流阻抗谱；
[0027] (2)然后将玻碳电极浸泡在含铅离子的缓冲溶液中，使铅与DNAzyme探针充分结 合，然后取出玻碳电极洗净、干燥后浸泡在铁氰、亚铁氰和KCl的混合溶液中以相同的方 式测试交流阻抗谱；优选的，步骤（2)中玻碳电极浸泡在含铅离子的缓冲溶液中的时间为 30 ?60min〇
[0028] (3)根据铅离子浓度与阻值差的变化构建线性回归方程，即可测定待测溶液中的 铅离子。
[0029] 进一步的，前述铅离子浓度与阻值差的变化的线性回归方程为：
[0030] Y= ( - 373. 7486±8· 6726)Χ+(3778· 9752±60· 8136) (1)
[0031] 式（1)中，Y为铅离子检测时交流阻抗图谱阻值的变化负值，即-ARct，单位为 Ω;X为待测溶液中铅离子浓度值自然对数负值，即-log[Pb2+]，铅离子浓度的单位为μΜ; 式（1)的相关系数R= 0.9758,铅离子检测线性范围为SXKTkiM?5Χ10_5Μ，检测下限为 2XKT10M0
[0032] 进一步的，前述铁氰、亚铁氰和KCl的混合溶液中铁氰的浓度为5.OmM，亚铁氰的 浓度为5.OmM，KCl的浓度为10mM。
[0033] 与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0034] (1)本发明提供的用于检测铅的生物传感器具有优化的微观结构。首先，将玻碳 电极用L-赖氨酸修饰，使有序介孔碳-金纳米粒子能够更多，更稳定的固定在修饰电极表 面，使得有序介孔碳-金纳米粒子的复合膜更均匀，同时也提高了传感器的使用寿命；其 次，有序介孔碳-金纳米粒子具有优越的电子传递能力和导电性能，能够显著提高生物传 感器和待测溶液间电子的转移速度；电沉积纳米金膜为DNAzyme探针提供了结合位点，使 得DNAzyme探针通过金硫共价键（Au-S)能够稳定的固定在玻碳电极上，使生物传感器通过 协同增效，大大提高了生物传感器的稳定性、重复性和传感器结构的可靠性，提高了生物传 感器的检测水平。
[0035] (2)本发明提供的用于检测铅的生物传感器特异性强、检测精度高、效率高、成本 低廉，可以实现对铅离子的高效检测。
[0036] (3)本发明的生物传感器的制备方法不仅工艺步骤简单、成本低廉，且制作效率 尚。
[0037] (4)本发明采用生物传感器检测重金属铅离子的应用方法，生物传感器中DNA探 针、DNAzyme探针互补配对形成的双链探针，在铅离子特异性的作用下，双链探针中DNA探 针会发生断裂，从而使铁氰溶液中的氧化还原电子对发生改变，以改变交流阻抗谱，实现对 铅离子的快速和特异性检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0038] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例 中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
[0039] 图1为本发明实施例1中生物传感器的自组装过程示意图。
[0040] 图2为本发明实施例1的生物传感器检测Pb2+原理图。
[0041]图3为本发明实施例2的有序介孔碳的透射电镜图。
[0042]图4为本发明实施例2的有序介孔碳-金纳米粒子的透射电镜图。
[0043] 图5为本发明实施例3中Pb2+溶液浓度与交流阻抗谱的阻值差的线性回归曲线 图。
[0044] 图6为本发明实施例4中生物传感器检测的再现性图。
[0045] 图7为本发明实施例5中生物传感器检测Pb2+溶液浓度的重复性图。
[0046] 图8为本发明实施例7中生物传感器检测不同重金属离子的交流阻抗图谱阻值 图。
【具体实施方式】
[0047] 以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而 限制本发明的保护范围。
[0048] 以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
[0049] 实施例1:
[0050] 参照图1，一种用于检测铅的生物传感器，包括一在三电极系统中用作工作电极 的玻碳电极，玻碳电极的反应端表面修饰有L-赖氨酸，L-赖氨酸膜表面修饰有有序介孔 碳-金纳米粒子，再在有序介孔碳-金纳米粒子表面沉积一层纳米金膜，DNAzyme探针通过 共价键（Au-S)固定在纳米金膜/有序介孔碳-金纳米粒子/L-赖氨酸修饰的生物传感器 的反应端表面；然后与DNA探针互补配形成双链DNA。
[0051] DNAzyme序列具有SEQ ID NO. 1的核苷酸序列，具体为：
[0052] 5? - HS - (CH2) 6 - SS - (CH2) 6 - TTT - CATCTCTTC - TCCGAGCCGGTCGAAA - TAGTGAGT- 3'
[0053] DNA序列具有SEQ ID NO. 2的核苷酸序列，具体为：
[0054] 3' -GTAGAGAAGGrATATCACTCA-5'
[0055] 参见图2,生物传感器中DNA探针、DNAzyme探针互补配对形成的双链探针，当待 测的水体中存在铅离子时，在铅离子特异性的作用下，发生断裂，从而使铁氰溶液中的氧化 还原电子对发生改变，以改变交流阻抗谱，实现对铅离子的快速和特异性检测。从图2中可 知，实施例1的生物传感器可以检测待测溶液中是否存在铅离子，并根据电阻的大小判断 铅离子的浓度。
[0056] 实施例2
[0057] -种用于检测铅的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
[0058]S1、修饰L-赖氨酸：制作一玻碳电极，将玻碳电极放入I.OXl(T3m〇l/L的L-赖氨 酸水溶液中（L-赖氨酸水溶液用pH为8. 0的PBS溶液配制），用CV法扫描，-2.0?+2. OV 范围，30段，扫描速率为0. 05Vs'进行扫描，使玻碳电极表面形成一层L-赖氨酸薄，得到 L-赖氨酸修饰的玻碳电极。
[0059]S2、修饰有序介孔碳-金纳米粒子：将有序介孔碳-金纳米粒子配制成浓度为 0. 5mg/mL的悬浮液，滴加在L-赖氨酸修饰的玻碳电极的反应端表面得到有序介孔碳-金纳 米粒子/L-赖氨酸修饰的玻碳电极。有序介孔碳-金纳米粒子按照以下方法制备得到：
[0060] S2-1、合成硅基分子筛SBA-15 :将嵌段共聚物P123和正硅酸乙酯混合后在140? 150°C下油浴（硅油）、然后以550°C焙烧得到硅基分子筛SBA-15。
[0061]S2-2、合成有序介孔碳：将前述硅基分子筛SBA-15与水、蔗糖、浓硫酸按照质量比 为1 : 5 : 1.875 : 0.14进行混合得到混合物（硅基分子筛SBA-15与水、蔗糖、浓硫酸的 质量比为1 : 4?5 : 1.25?2.5 : 0.12?0.16,均可实施），将前述混合物置于鼓风干 燥箱中，以l〇〇°C温度下保持6h，然后将温度提高至160°C并保持6h，直至混合物变为黑色， 然后将黑色的混合物置于惰性气体保护下，以5°C/min的升温速率升温至900°C，在900°C 下进行高温热解4. 5h得到热解产物（高温热解时间为4h?5h均可实施），将前述热解产 物进行洗涤、80°C干燥步骤得到有序介孔碳（图3为按照前述方法制备得到的有序介孔碳 的透射电镜图）。
[0062] S2-3、在超声条件下，取有序介孔碳（OMC)以质量比为1 : 50加入到0.lwt%的氯 金酸中，超声12h。然后再加入ImL质量分数为1%柠檬酸钠，快速搅拌Imin后，加入ImL 质量分数为〇. 075 %的硼氢化钠，超声30min得到黑色溶液。将黑色溶液离心，洗涤，最后放 置80°C下干燥，得到有序介孔碳-金纳米粒子（图4为按照前述方法制备得到的有序介孔 碳-金纳米粒子的透射电镜图）。
[0063]S3、电沉积纳米金：将有序介孔碳-金纳米粒子/L-赖氨酸修饰的玻碳电极放入 0. 1%HAuCljK溶液中，采用循环伏安法将纳米金粒子电沉积在前述修饰玻碳电极的反应 端表面；循环伏安法中扫描电位为0?I. 6V，扫描速率为20mV/s，扫描圈数为6圈，得到纳 米金膜/有序介孔碳-金纳米粒子/L-赖氨酸修饰的玻碳电极。
[0064]S4、组装DNAzyme探针：在纳米金膜/有序介孔碳-金纳米粒子/L-赖氨酸修饰 的玻碳电极的反应端表面滴加10μL(体积为5?10μL均可实施）浓度为10μM(浓度为 5?10μM均可实施）的DNA探针，在4°C下反应12h，使DNAzyme探针通过金硫共价键固定 在纳米金膜/有序介孔碳-金纳米粒子/L-赖氨酸修饰的玻碳电极的反应端表面，得到组 装有DNAzyme探针的纳米金膜/有序介孔碳-金纳米粒子/L-赖氨酸修饰的玻碳电极。
[0065] 用Tris-HClO4W洗前述组装有DNAzyme探针的纳米金膜/有序介孔碳-金纳米 粒子/L-赖氨酸修饰的玻碳电极，然后再浸泡在ImM的6-巯基乙醇溶液（MCH)中培养2h， 然后用Tris-HClO4冲洗，干燥待用。MCH能够对复合膜修饰电极的表面进行封端，不仅使 DNAzyme探针可以稳定的固定于修饰电极表面，还可以使DNAzyme与DNA能够更好的互补配 对形成双链DNA。
[0066] 将组装有DNAzyme探针的纳米金膜/有序介孔碳-金纳米粒子/L-赖氨酸修饰 的玻碳电极浸泡在浓度为7μM的DNA探针溶液（DNA探针溶液的浓度为5?10μM均可 实施）中于恒温水浴锅中培养lh，然后取出反应完成的玻碳电极，用Tris-HClOjl冲溶液 (PH8. 0)冲洗，干燥后待用，完成生物传感器的制备。
[0067] 实施例3
[0068] -种实施例1的生物传感器在检测铅中的应用，包括以下步骤：
[0069] (1)以生物传感器的玻碳电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂电极 作为对电极，将玻碳电极用1^ 8-!1(：104清洗干净后浸泡在铁氰（5.OmM)、亚铁氰（5.OmM)和 KCl(IOmM)的混合溶液中建立三电极系统，将前述三电极系统与电化学工作站连接，测试交 流阻抗谱；
[0070] (2)然后将玻碳电极浸泡在Pb2+浓度分别为5X10 _5M、5X10_6M、5X10_7M、 5X10_8M、5X10_9M和SXKTkiM的Pb2+缓冲溶液中2h，取出洗净、干燥后浸泡在铁氰 (5.OmM)、亚铁氰（5.OmM)和KCl(IOmM)的混合溶液中以相同的方式测试交流阻抗谱；
[0071] (3)根据铅离子浓度与阻值差的变化构建线性回归方程。
[0072] 图5是Pb2+溶液浓度与交流阻抗谱的阻值差的线性回归曲线图，从图5中可知，铅 离子浓度与阻值差的变化的线性回归方程为：
[0073] Y = ( -373. 7486±8· 6726)Χ+(3778· 9752±60· 8136) (1)
[0074] 式（1)中，Y为铅离子检测时交流阻抗图谱阻值的变化负值，即-ARct，单位为 Ω;X为待测溶液中铅离子浓度值自然对数负值，即-log[Pb2+]，铅离子浓度单位为μΜ;式 (1)的相关系数R= 0.9758,铅离子检测线性范围为SXKTkiM?5Χ10_5Μ，检测下限为 2X10^1(检测下限按照3倍空白样的标准偏差计算）。
[0075] 实施例4:对生物传感器的再现性进行检查。
[0076] 为了验证实例1的生物传感器及其检测方法的检测效果，按照实施例2的制备 方法制备5个生物传感器，将前述5个生物传感器用于检测同一浓度的铅离子（铅离子 5Χ1(Γ9Μ)，检测结果参见图6。从图6中可知，5个生物传感器检测同一浓度的铅离子，相 对标准偏差为4. 9%，表明按照实施例2的制备方法制备的生物传感器，有较好的再现性。
[0077] 实施例5 :对生物传感器的重复性进行检查。
[0078] 将实施例1的生物传感器，对铅离子浓度为5Χ1(Γ9Μ的水溶液进行检测，平行检 测三次，检测结果如图7所示：三次检测结果的相对标准偏差为4. 3%，表明实例1的生物 传感器具有较好的重复性。
[0079] 实验例6 :对生物传感器的检测精确度进行检查。
[0080] 配制4组不同铅离子浓度的待测溶液，用实施例1的生物传感器进行测定（测定 方法参照实施例3)，进行回收率实验。
[0081] 具体的实验步骤：取自长沙自来水公司的自来水，经过滤后测定自来水中不含可 检测到的铅离子。将河水平均分为四份，配制成浓度分别为5nM、50nM、500nM、5000nM的待 测溶液。将实施例1的生物传感器按照实施例3的检测方法检测待测溶液中的铅离子浓度， 结果列于表1中。
[0082] 表1 :五组待测溶液的回收率验证结果
[0083]
【权利要求】
1. 一种用于检测铅的生物传感器，包括一在三电极系统中用作工作电极的玻碳电极， 其特征在于，所述玻碳电极的反应端表面修饰有L-赖氨酸，所述L-赖氨酸表面修饰有有序 介孔碳-金纳米粒子，所述有序介孔碳-金纳米粒子表面修饰有纳米金膜，所述纳米金膜表 面组装有DNAzyme探针，DNA探针与所述DNAzyme探针通过互补配对连接。
2. 根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述DNAzyme探针为具有SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列的探针，所述DNA探针为具有SEQ ID NO. 2所述的核苷酸序列的探 针。
3. -种如权利要求1或2所述生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 51、 修饰L-赖氨酸：制作一玻碳电极，将L-赖氨酸电沉积于所述玻碳电极的反应端表 面得到L-赖氨酸修饰的玻碳电极； 52、 修饰有序介孔碳-金纳米粒子：在所述L-赖氨酸修饰的玻碳电极的反应端表面滴 加有序介孔碳-金纳米粒子得到有序介孔碳-金纳米粒子/L-赖氨酸修饰的玻碳电极； 53、 电沉积纳米金：在所述有序介孔碳-金纳米粒子/L-赖氨酸修饰的玻碳电极的反应 端表面电沉积纳米金膜，得到纳米金膜/有序介孔碳-金纳米粒子/L-赖氨酸修饰的玻碳 电极； 54、 组装DNAzyme探针：在所述纳米金膜/有序介孔碳-金纳米粒子/L-赖氨酸修饰的 玻碳电极的反应端表面滴加 DNAzyme探针，使DNAzyme探针固定在所述纳米金膜/有序介 孔碳-金纳米粒子/L-赖氨酸修饰的玻碳电极的反应端表面，得到组装有DNAzyme探针的 纳米金膜/有序介孔碳-金纳米粒子/L-赖氨酸修饰的玻碳电极； 55、 连接DNA探针：将所述组装有DNAzyme探针的纳米金膜/有序介孔碳-金纳米粒子 /L-赖氨酸修饰的玻碳电极浸泡在DNA探针溶液中培养，使所述DNAzyme探针与所述DNA探 针进行互补配对连接，完成生物传感器的制备。
4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中的有序介孔碳-金纳 米粒子是采用包括以下步骤的方法制得： S2-1、合成娃基分子筛SBA-15 :将嵌段共聚物P123和正娃酸乙醋混合后在140? 150°C下油浴、然后焙烧得到硅基分子筛SBA-15 ; S2-2、合成有序介孔碳：所述硅基分子筛SBA-15与水、蔗糖、浓硫酸混合得到混合物， 将所述混合物置于100?160°C温度下干燥直至混合物变为黑色；然后将黑色的混合物置 于惰性气体保护下进行高温热解得到热解产物，将所述热解产物进行洗涤、干燥步骤得到 所述有序介孔碳； S2-3、在超声条件下，将所述步骤S2-2制备得到的有序介孔碳与氯金酸按照质量比为 1 : 50进行超声混合；然后依次加入1%柠檬酸钠、0.075%硼氢化钠，再次超声得到黑色溶 液，将黑色溶液离心、洗涤、干燥，得到有序介孔碳-金纳米粒子。
5. 根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1具体为将玻碳电极 浸入L-赖氨酸的水溶液中，用CV法扫描-2. 0?+2. 0V范围，30段，使所述玻碳电极表面形 成一层L-赖氨酸膜，得到L-赖氨酸修饰的玻碳电极。
6. 根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，将所述有序介孔 碳-金纳米粒子/L-赖氨酸修饰的玻碳电极放入0. 1% HAuCljK溶液中，采用循环伏安法 制备得到所述纳米金膜/有序介孔碳-金纳米粒子/L-赖氨酸修饰的玻碳电极。
7. 根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S4具体为：将10? 20 y M的DNA探针滴加在所述纳米金膜/有序介孔碳-金纳米粒子/L-赖氨酸修饰的玻碳 电极的反应端表面，在4°C下反应至少12h，再转入ImM的6-巯基乙醇溶液中培养1?2h 得到所述组装有DNA探针的纳米金膜/有序介孔碳-金纳米粒子/L-赖氨酸修饰的玻碳电 极。
8. -种用权利要求1或2所述的生物传感器或采用权利要求3至7中任意一项所述制 备方法制得的生物传感器在检测铅中的应用，其特征在于，包括以下步骤： (1) 以生物传感器的玻碳电极作为工作电极浸泡在铁氰、亚铁氰和KC1的混合溶液中 建立三电极系统，将所述三电极系统与电化学工作站连接，测试交流阻抗谱； (2) 然后将玻碳电极浸泡在含铅离子的缓冲溶液中，使铅离子与DNAzyme探针结合，然 后取出洗净、干燥后浸泡在铁氰、亚铁氰和KC1的混合溶液中测试交流阻抗谱； (3) 根据铅离子浓度与阻值差的变化构建线性回归方程，即可测定待测溶液中的铅离 子。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述铅离子浓度与阻值差的变化的线性 回归方程为： Y = ( - 373. 7486±8. 6726)X+(3778. 9752±60. 8136) (1) 式（1)中，Y为铅离子检测时交流阻抗图谱阻值的变化负值，即-ARct，单位为Q ; X为待测溶液中铅离子浓度值自然对数负值，即-log[Pb2+]，铅离子浓度的单位为yM;式 (1)的相关系数R = 〇. 9758,铅离子检测线性范围为5 X 1(T ?5 X 1(T5M，检测下限为 2X10'M〇
10. 根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述铁氰、亚铁氰和KC1的混合溶液 中铁氰的浓度为5. OmM，亚铁氰的浓度为5. OmM，KC1的浓度为10mM，所述步骤（2)中所述玻 碳电极浸泡在含铅离子的缓冲溶液中的时间为30?60min。
【文档编号】G01N27/327GK104483366SQ201410735397
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月5日 优先权日:2014年12月5日
【发明者】张辰, 曾光明, 黄丹莲, 汤琳, 周耀渝, 赖萃, 许飘, 程敏 申请人:湖南大学