一种甘胆酸检测试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种甘胆酸检测试剂盒及其制备方法。本发明试剂盒盒体内包括试剂R1、试剂R2和校准品，所述试剂R1的组分包括：生物缓冲液1、保护剂1、反应增强剂1、表面活性剂1、防腐剂1、稳定剂1；试剂R2的组分包括：生物缓冲液2、抗甘胆酸抗体的胶乳颗粒、保护剂2、反应增强剂2、表面活性剂2、防腐剂2、稳定剂2；校准品的组分包括：缓冲液3、保护剂3、防腐剂3、甘胆酸标准品。本发明采用双试剂模式不仅可以有效避免非特异性反应的干扰，同时可以最大限度的减少来自样本本身浊度的干扰，保证了测定结果的准确可靠，具有重复性好、精确度高、稳定性好、检测灵敏度高、线性测试范围宽、抗干扰性强等优点。
【专利说明】一种甘胆酸检测试剂盒及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种甘胆酸检测试剂盒及其制备方法和用 途。
【背景技术】
[0002] 甘胆酸（CholyglyCine，CG)是胆酸与甘氨酸结合而成的结合型胆酸，在肝细胞 内，胆固醇经过及其复杂的酶促反应，转变成初级胆汁酸。其中有胆酸（CA)和鹅去氧胆酸 (CD-CA)。胆酸的类固醇核上有三个羟基化3、07工12)，侧链末端的羟基以肽键与甘氨酸结 合。
[0003] CG由肝细胞合成，正常代谢途径为肠肝循环，经毛细胆管、胆管排入胆囊，随同胆 汁进入十二指肠，帮助食物消化。95%胆酸在回肠末端重吸收，经门静脉再回肝脏，由肝细 胞摄取再利用。在血清中主要以蛋白结合形式存在，溢入体循环的总量小于1%。在正常情 况下，外周血中胆酸含量甚微，正常成人无论空腹或餐后，其血清CG浓度稳定在低水平。 当肝细胞受损时，肝细胞摄取CG能力下降，致使血中CG含量增高；胆汁郁滞时，肝脏排泄胆 酸发生障碍，而返流血液循环的CG含量增高，也使血CG含量增高。测定血清甘胆酸（CG) 是评价肝细胞功能及其肝胆系物质循环功能的敏感指标之一。
[0004] 临床上急性肝炎、慢性活动性肝炎、原发性肝癌、肝硬化、慢迁肝、梗阻性肝病、 肠一肝循环障碍、胆石症伴黄疸、胆管、胆囊排泄功能障碍患者血CG均明显高于正常人。 [0005] 甘胆酸同时也是妊娠晚期血清中最主要的胆汁酸组分。正常妊娠时孕妇血清CG 水平随孕周逐步增高，大量雌激素会引起肝细胞膜的改变，减少窦状膜浆的流动性，从而出 现胆汁分泌减少，返流入血，出现妊娠期内胆汁淤积现象，CG水平升高。胎盘绒毛静脉腔 内外均处于高浓度胆汁酸刺激之中，引起血管收缩，胎盘绒毛表面血管痉挛，氧合血流量减 少，导致胎儿缺氧，可出现各种并发症，如胎儿宫内窘迫、早产等。
[0006] 目前已知的甘胆酸检测方法有放射免疫法（RIA)、酶联免疫吸附法（ELISA)、化学 发光法（CL)等。但这些方法均存在较多缺陷，如放射免疫法同位素试剂具有放射性污染及 有效期较短和操作不方便等弊端，酶联免疫吸附法操作较为繁琐，耗时较长，不适宜临床上 使用。化学发光法尽管灵敏度较高，但需要专用的测定设备，费用较高不利于推广。而胶乳 增强免疫比浊法操作简便、可适用于全自动生化分析仪，检测时间不到10分钟适合临床推 广。但目前我国市场上的甘胆酸检测试剂盒准确度、灵敏度、重复性仍然较差。
【发明内容】
[0007] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种检测时间短，稳定性 好、重复性好、精确度高、检测灵敏度高、线性测试范围宽、抗干扰性强的甘胆酸检测试剂 盒，用于解决现有技术中的问题。
[0008] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明的第一方面提供一种甘胆酸检测试剂 盒，包括彼此独立的试剂R1、试剂R2和校准品，所述试剂R1的组分包括：生物缓冲液1、保 护剂1、反应增强剂1、表面活性剂1、防腐剂1、稳定剂1 ;试剂R2的组分包括：生物缓冲液 2、抗甘胆酸抗体的胶乳颗粒、保护剂2、反应增强剂2、表面活性剂2、防腐剂2、稳定剂2 ;校 准品的组分包括：生物缓冲液3、保护剂3、防腐剂3、甘胆酸标准品、稳定剂3。
[0009] 优选的，所述试剂R1中，所述生物缓冲液1选自氨基丁三醇缓冲液、磷酸盐缓冲 液、Tris-HCL缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的一种或 多种的组合；所述试剂R2中，所述生物缓冲液2选自氨基丁三醇缓冲液、磷酸盐缓冲液、 Tris-HCL缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的一种或多种 的组合；校准品中，所述生物缓冲液3选自氨基丁三醇缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCL缓 冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的一种或多种的组合。
[0010] 更优选的，所述试剂R1中，生物缓冲液1的浓度为20?200mmol/L，PH6. 5-7. 5 ; 所述试剂R2中，生物缓冲液2的浓度为20?200mmol/L，PH6. 5-7. 5 ;校准品中，生物缓冲 液 3 的浓度为 20 ?200mmol/L，PH6. 5-7. 5。
[0011] 本发明中，各生物缓冲液的主要作用是保证试剂中各组分PH值保持在一定范围 内，保证各组分性能稳定，最终保证整个试剂盒的性能稳定，测试结果稳定可靠。
[0012] 优选的，为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果，本发明对所述试剂R1中 的生物缓冲液1进行了改进，所述试剂R1中的生物缓冲液1包括下列组分：水苏糖、明矾、 果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠和甘氨酸，且水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠、甘氨酸 的总浓度为3. 5 - 7. 5g/L，生物缓冲液1的pH值为7. 2 - 7. 6。
[0013] 优选的，各组分在生物缓冲液1中的浓度为：
[0014]
【权利要求】
1. 一种甘胆酸检测试剂盒，包括彼此独立的试剂R1、试剂R2和校准品，所述试剂R1的 组分包括：生物缓冲液1、保护剂1、反应增强剂1、表面活性剂1、防腐剂1、稳定剂1 ;试剂 R2的组分包括：生物缓冲液2、抗甘胆酸抗体的胶乳颗粒、保护剂2、反应增强剂2、表面活性 剂2、防腐剂2、稳定剂2 ;校准品的组分包括：生物缓冲液3、保护剂3、防腐剂3、甘胆酸标准 品、稳定剂3。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中，所述生物缓冲液1选 自氨基丁三醇缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCL缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、三羟 甲基氨基甲烷缓冲液中的一种或多种的组合；所述试剂R2中，所述生物缓冲液2选自氨基 丁三醇缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCL缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、三羟甲基 氨基甲烷缓冲液中的一种或多种的组合；校准品中，所述生物缓冲液3选自氨基丁三醇缓 冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCL缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷 缓冲液中的一种或多种的组合；所述试剂R1中，生物缓冲液1的浓度为20?200mmol/L， PH6. 5-7. 5 ;所述试剂R2中，生物缓冲液2的浓度为20?200mmol/L，PH6. 5-7. 5 ;校准品 中，生物缓冲液3的浓度为20?200mmol/L，PH6. 5-7. 5。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中，所述表面活性剂1选 自椰子油脂肪酸二乙醇酰胺、Tween-20、Tween-30、Tween-80、Triton X-100中的一种或 多种的组合；所述试剂R2中，所述表面活性剂2选自椰子油脂肪酸二乙醇酰胺、Tween-20、 Tween-30、Tween-80、Triton X-100中的一种或多种的组合；所述试剂R1中，表面活性剂1 的浓度为3?50mmol/L ;所述试剂R2中，表面活性剂2的浓度为3?50mmol/L。
4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中，所述反应增强剂1选自 PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG20000中的一种或多种的组合；所述试剂R2中，所述反应 增强剂2选自PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG20000中的一种或多种的组合；所述试剂R1 中，反应增强剂1的浓度为〇. 1?5. Og/L ;所述试剂R2中，反应增强剂2的浓度为0. 1? 5. 0g/L〇
5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中，所述防腐剂1选自叠氮 钠、硫柳汞、ProClin200、ProClin300中的一种或多种的组合；所述试剂R2中，所述防腐剂 2选自叠氮钠、硫柳汞、Pix)Clin200、ProClin300中的一种或多种的组合；所述校准品中，所 述防腐剂3选自叠氮钠、硫柳萊、ProClin200、ProClin300中的一种或多种的组合；所述试 剂R1中，防腐剂1的浓度为〇. 3?3. 0g/L ;所述试剂R2中，防腐剂2的浓度为0. 3?3. 0g/ L ;校准品中，防腐剂3的浓度为0. 3?3. 0g/L。
6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中，所述保护剂1选自牛血 清白蛋白BSA、卵清蛋白OVA和明胶中的一种或多种的组合；所述试剂R2中，所述保护剂2 选自牛血清白蛋白BSA、卵清蛋白OVA和明胶中的一种或多种的组合；校准品中，所述保护 剂3选自牛血清白蛋白BSA、卵清蛋白OVA或明胶中的一种或多种的组合；所述试剂R1中， 保护剂1的浓度为1?l〇g/L ;所述试剂R2中，保护剂2的浓度为1?10g/L ;校准品中，保 护剂3的浓度为1?8g/L。
7. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中，所述稳定剂1选自无机 盐、金属络合物、抗氧化剂中的一种或多种的组合；所述试剂R2中，所述稳定剂2选自无机 盐、金属络合物、抗氧化剂中的一种或多种的组合；校准品中，所述稳定剂3选自无机盐、金 属络合物、抗氧化剂中的一种或多种的组合。
8. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述胶乳颗粒为致敏聚苯乙烯胶乳颗 粒，表面官能团为氨基、羧基、酰肼、醛基或环氧基。
9. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中，所述生物缓冲液1包括 下列组分：水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠和甘氨酸，且水苏糖、明矾、果糖二磷酸 钠、六偏磷酸钠、甘氨酸的总浓度为3. 5 - 7. 5g/L，生物缓冲液1的pH值为7. 2 - 7. 6。
10. 根据权利要求1?9任一权利要求所述的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在 于，具体包括如下步骤： (a) 按照比例分别配置试剂R1、试剂R2,按照需要的甘胆酸参考校准品浓度将相应的 甘胆酸标准品分别加入校准品中，制备得到含有不同浓度甘胆酸标准品的一组校准品，并 绘制标准曲线； (b) 将待测样本与试剂R1和R2按一定比例混合，使其充分反应； (c) 用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值。 (d) 根据校准曲线得到样本中甘胆酸的含量。
【文档编号】G01N33/546GK104459113SQ201410736234
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月5日 优先权日:2014年12月5日
【发明者】李元丽 申请人:重庆中元生物技术有限公司