技术领域本发明涉及一种药物筛选试剂盒及该试剂盒的使用方法，属于生物医药技术领域。
背景技术：
众所周知，RAS信号途径是与肿瘤发生有关的信号通路。在人类肿瘤中，RAS蛋白的功能异常是普遍存在的。据报道，约50％的肺癌和肠癌中、95％胰腺癌中存在ras突变基因。若RAS蛋白持续处于活化状态，可与下游的效应蛋白结合，将信号传递到下游信号元件，可能引起细胞的异常增殖，导致肿瘤的发生。因此，RAS蛋白的信号通路成为筛选抗肿瘤药物新的靶点。肿瘤细胞系、永生化细胞以及原代培养细胞是研究肿瘤病因学和发病机制的重要模型。然而，许多的药物候选物体内活性和体外活性相关性很差。因此，药物的体外筛选在方法学上存在技术缺陷。而药物的体内筛选能够避免此类技术缺陷。因此，目前人们普遍利用小鼠作为模式生物来筛选抗癌药物，但是该方法却存在周期长，成本高，工作量大缺陷，难以实现高通量筛选。多项研究表明，秀丽隐杆线虫可以作为筛选能抑制ras原癌基因活性的药物的模式生物。但是现阶段使用秀丽隐杆线虫仍然存在一定的困难，主要原因是对于一般人来讲，秀丽隐杆线虫的的造模、培养、检验等仍需要系统的技术培训与实践，才能完成药物筛选，因此，大家急需一种以秀丽隐杆线虫为模型的药物筛选试剂盒。本发明利用秀丽隐杆线虫为模式生物进一步完善了利用秀丽隐杆线虫作为模式生物，构建了秀丽隐杆线虫药物筛选试剂盒，该药物筛选试剂盒具有操作简单、快速、高效、准确、高通量的优点。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种药物筛选试剂盒，该试剂盒能够利用秀丽隐杆线虫实现抗肿瘤药物的体内筛选。本发明的另一个目的是提供上述药物筛选试剂盒的使用方法，本发明利用染料H2DCF-DA对突变体和野生型秀丽隐杆线虫不同的染色效果来达到操作简单、快速、高效、准确、高通量筛选出有效的抗肿瘤药物的目的，为广大抗肿瘤药物的研发人员节约时间和成本。本发明公开的药物筛选试剂盒包括如下材料：①秀丽隐杆线虫野生型N2；②秀丽隐杆线虫突变体MT2124；③秀丽隐杆线虫CB1275；④NGM培养基；⑤大肠杆菌OP50；⑥染料：2',7'-二氯二氢荧光素二乙酯。其中，所述的肿瘤是由ras原癌基因过表达引起的。由于ras信号通路从线虫到人高度保守，在秀丽隐杆线虫中let-60基因编码保守的RAS蛋白，它与人类的RAS蛋白相比具有83％的同源性。如果ras突变，在秀丽隐杆线虫中会引起线虫产生多阴门，在人类中则是引起细胞的恶性增殖，导致肿瘤的发生。因此，模式生物秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)Ras/MAPK信号通路过度激活型突变体被作为肿瘤模型广泛应用于筛选抑制ras原癌基因通路过度激活的抗肿瘤药物。所述的试剂盒所用的秀丽隐杆线虫为同步化后的线虫，线虫同步化的步骤为：①挑选成熟的秀丽隐杆线虫至装有1mlM9液的离心管中，4000rpm离心5分钟，去上清；②向离心管中加入500μL1M氢氧化钠，500μL6.4％(V/V)次氯酸钠，震荡裂解；③去掉上清，向沉淀中加入1.5μLM9液，摇匀，4000rpm离心5分钟，重复该步骤三次；④向洗净的卵中加入500μLM9液，18℃24小时孵化成L1期秀丽隐杆线虫。其中，所述的秀丽隐杆线虫的浓度为100条/20μl。本发明提供的上述的药物筛选试剂盒的使用方法，所述的试剂盒的使用方法为：(1)秀丽隐杆线虫的染色与检测将同步化后的L1期秀丽隐杆线虫MT2124混匀，计数单位液体体积中秀丽隐杆线虫的数目，备用；在96孔板上取2孔，每个孔中先加入140μL的S液，然后加入20μL大肠杆菌菌体溶液，每个孔中加入90条左右的秀丽隐杆线虫MT2124，第一个孔为阴性对照，加入20μL蒸馏水，另一个孔加入供试药物；最后使每个孔的液体体积都是200μL；然后将液体混匀，20℃振荡培养6天左右，待其发育为成虫，即产生假阴门后，用M液从平板上冲下，转移到离心管中，待秀丽隐杆线虫自然沉淀，除去上清液，留取秀丽隐杆线虫；加入含0.05％(V/V)的吐温20的M9液，待秀丽隐杆线虫自然沉淀，除去上清液，留取秀丽隐杆线虫；再用纯净的M9液洗涤至澄清，转移秀丽隐杆线虫到另外的新的96孔板上，加样位置与原来96板对应，每个孔做三个平行对照，加入染料，分别染色，染色后的秀丽隐杆线虫在荧光显微镜下观察，拍照；并且利用荧光酶标仪检测荧光值，激发光波长485nm，发射光波长535nm；(2)将实验数据进行处理，测量染色后的线虫荧光强度。其中，所述的秀丽隐杆线虫用染料染色时，染料终浓度为50μg/mL，染色时间为1.5小时，染色温度20℃。本发明的有益效果为：1.本发明是利用染料H2DCF-DA特异性对秀丽隐杆线虫假阴门染色，然后用荧光酶标仪检测秀丽隐杆线虫群体的荧光强度，能够实现高通量筛选，具有操作简单，数据客观准确的优点。2.由于许多的药物候选物体内活性和体外活性相关性很差，因此，药物的体外高通量筛选在方法学上存在技术缺陷。本发明采用秀丽隐杆线虫作为体内筛选药物的模式生物，解决了体外筛选药物的弊端，且相比于小鼠作为模式生物来筛选抗癌药物，周期短，成本低，操作简单，能高通量筛选出有效抗肿瘤药物，为广大抗肿瘤药物的研发人员节约时间和成本。附图说明图1为秀丽隐杆线虫突变体MT2124用染料染色1.5h的荧光照片；图2为秀丽隐杆线虫野生型N2用染料染色1.5h的荧光照片；图3为野生型比例不同的线虫群体染料染色的荧光值；图4为索拉菲尼验证药物筛选试剂盒的结果；图5为索拉菲尼对Ras/MAPK通路多阴门突变体的影响。具体实施方式以下提供具体实施例以实现本发明所述的药物筛选试剂盒，但不限于这些实施例。1.试剂(1)M9缓冲液(M9buffer)：每升缓冲液中含：12gNa2HPO4·12H2O(或6gNa2HPO4)，3gKH2PO4，5gNaCl，0.25gMgSO4·7H2O，宜现用现配。(2)S缓冲液(Sbuffer)：0.1mol/LNaC1，0.05mmol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH＝6.0)。(3)NGM(NematodeGrowthMedium)培养基：1.21gNaCl，6.8g磷酸二氢钾，0.923g磷酸氢二钾，1.08g蛋白胨，6.86g琼脂加水至400mL，灭菌后加入400μL的1mol/L硫酸镁溶液，400μL的1mol/L氯化钙溶液，400μL5mg/mL的胆固醇溶液，倒平板。(4)LB培养基：蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母浸膏5g，加水至1000mL，调pH至7.0。(5)染料染料：2',7'-二氯二氢荧光素二乙酯(dichlorofluoresceindiacetate，H2DCF-DA)，购自Sigma公司。(6)索拉菲尼，主要用于肾癌，原发性肝癌，结肠癌，另外对肺癌，胰腺癌等有一定作用。多靶点双重的抗肿瘤作用，索拉非尼可通过抑制Raf-1，野生型和V599E突变的BRAf的丝氨酸和苏氨酸激酶活性，阻断RAS/RAF/MEK/ERK信号通路，从而阻断细胞周期，诱导肿瘤细胞凋亡，直接抑制肿瘤细胞增殖。2.生物材料(1)秀丽隐杆线虫野生型N2，购自CGC(CaenorhabditisGeneticsCenter)，该株系线虫没有假阴门。(2)秀丽隐杆线虫突变体MT2124，购自CGC(CaenorhabditisGeneticsCenter)，该株系线虫有假阴门，并且会随着抗ras过度激活的药物药效的发挥而转为野生型，假阴门也会随之消失。Ras是一种小分子蛋白，参与调控动物发育过程中的很多重要环节。ras信号通路从线虫到人高度保守，在秀丽隐杆线虫中let-60基因编码保守的RAS蛋白，它与人类的RAS蛋白相比具有83％的同源性。如果ras突变，在秀丽隐杆线虫中会引起线虫产生多阴门，在人类中则是引起细胞的恶性增殖，导致肿瘤的发生。因此，秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)Ras/MAPK信号通路过度激活型突变体被作为肿瘤模型广泛应用于筛选抑制原癌基因ras通路过度激活的抗肿瘤药物。MT2124是let-60/ras过度激活的秀丽隐杆线虫，会产生多阴门的表型。将药物作用于秀丽隐杆线虫MT2124，如果能够抑制受试线虫群体多阴门产生个体的比例，而只有一个阴门的野生型线虫个体比例上升，则说明药物作用于ras通路，下调了该通路的过度激活，具有抗肿瘤活性。群体中野生型线虫的比例越高，则药物作用效果越显著。如以突变体比例表示则相反，其中，野生型比例(％)＝100％-突变体比例(％)(3)实验材料：秀丽隐杆线虫CB1275，基因型：lin-1(e1275)IV购自CGC(CaenorhabditisGeneticsCenter)。(4)大肠杆菌OP50(尿嘧啶渗漏突变株)，购自CGC(CaenorhabditisGeneticsCenter)，为秀丽隐杆线虫食物。实施例1秀丽隐杆线虫的染色效果验证性实验(1)秀丽隐杆线虫的同步化①挑选成熟的秀丽隐杆线虫至装有1mlM9液的2ml离心管中，4000rpm离心5分钟，去上清；②向离心管中加入500μL1M氢氧化钠，500μL6.4％(V/V)次氯酸钠，震荡裂解；③去掉上清，向沉淀中加入1.5μLM9液，摇匀，4000rpm离心5分钟，重复该步骤三次；④向洗净的卵中加入500μLM9液，18℃24小时孵化成L1期秀丽隐杆线虫。(2)秀丽隐杆线虫的染色与检测方法①秀丽隐杆线虫的染色与检测将上述同步化后的L1期秀丽隐杆线虫MT2124混匀，计数单位液体体积中秀丽隐杆线虫的数目，备用；在96孔板上取2孔，每个孔中先加入140μL的S液，然后加入20μL大肠杆菌菌体溶液，每个孔中加入90条左右的秀丽隐杆线虫MT2124，第一个孔为阴性对照，加入20μL蒸馏水，另一个孔加入供试药物；最后使每个孔的液体体积都是200μL；然后将液体混匀，20℃振荡培养6天左右，待其发育为成虫，即产生假阴门后，用M液从平板上冲下，转移到离心管中，待秀丽隐杆线虫自然沉淀，除去上清液，留取秀丽隐杆线虫；加入含0.05％(V/V)的吐温20的M9液，待秀丽隐杆线虫自然沉淀，除去上清液，留取秀丽隐杆线虫；再用纯净的M9液洗涤至澄清，转移秀丽隐杆线虫到另外的新的96孔板上，加样位置与原来96板对应，每个孔做三个平行对照，加入染料，分别染色，染色后的秀丽隐杆线虫在荧光显微镜下观察，拍照；并且利用荧光酶标仪检测荧光值，激发光波长485nm，发射光波长535nm；②将实验数据进行处理，测量染色后的线虫荧光强度。(3)秀丽隐杆线虫的染料染色效果按上述(1)、(2)的步骤处理线虫，从图1、图2秀丽隐杆线虫的染色效果图看以得知，利用适宜浓度的染料染色适宜时间(1.5小时)，可以使秀丽隐杆线虫突变体MT2124染色，并可以特异性的使秀丽隐杆线虫突变体MT2124的假阴门部位染色，而野生型秀丽隐杆线虫则无法着色。(4)野生型比例不同的线虫群体染料染色后荧光值检测按本实施例(1)所述方法将秀丽隐杆线虫野生型N2和秀丽隐杆线虫突变体MT2124分别同步化，然后将各自同步化的秀丽隐杆线虫混匀，分别在在含有大肠杆菌的NGM培养基平板上培养，温度为20℃，待其发育为成虫后，用M液从平板上冲下，转移到离心管中，待秀丽隐杆线虫自然沉淀，除去上清液，留取秀丽隐杆线虫；加入含0.05％(V/V)的吐温20的M9液，待秀丽隐杆线虫自然沉淀，除去上清液，留取秀丽隐杆线虫；再用纯净的M9液洗涤至澄清，各自计数单位液体体积中秀丽隐杆线虫的数目，备用。在96孔板上取11个孔，每孔加入不同突变体比例的秀丽隐杆线虫群体，每个孔中秀丽隐杆线虫C.elegans总数在70条，野生型比例依次为0％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，然后加入染料，使其终浓度为50μg/mL，20℃染色1.5h，测各孔荧光值。每个孔做三个平行对照。由图3可以看出在对不同的秀丽隐杆线虫群体进行染料染色时，染色相同时间时，秀丽隐杆线虫群体中的突变体秀丽隐杆线虫所占比例与检测到的荧光强度成正相关。利用染料可以对秀丽隐杆线虫进行染色，使突变体秀丽隐杆线虫假阴门特异性着色，由于秀丽隐杆线虫群体中突变体的比例与荧光酶标仪检测到的荧光强度成正相关，秀丽隐杆线虫群体的染色时间与荧光酶标仪检测到的荧光强度成正相关，因此通过荧光酶标仪检测秀丽隐杆线虫群体发出的荧光值的强度，据此可以判断秀丽隐杆线虫群体的野生型比例。进而判断药物的处理是否能够下调ras基因的过度激活。实施例2抗肿瘤候选药物对秀丽隐杆线虫CB1275(lin-1缺失突变)的作用lin-1是ras下游的一个基因，是可被MAPK磷酸化的核转录因子，是阴门发育的负调节因子，可以调节let-60下游的阴门发育的信号通路。lin-1与lin-31组成复合体，lin-1碥码ETS家族成员，而lin-31编码带翼螺旋转录因子，ras信号未激活时，lin-1与lin-31相互作用组成复合体，这个复合体与产卵器功能基因的起动部分结合而阻止它们的表达。lin-1缺失突变后，复合体就无法形成，复合体不能形成，无法与产卵器功能基因的起动部分结合，产卵器基因表达，进而产生假阴门发育形成多阴门表型。实施例1的结果如果表明药物抑制了线虫的多阴门表型，但这一结果仅提示药物显著下调let-60/ras过度激活的位点在于let-60或其下游，那么药物是否对let-60下游的lin-1失活突变多阴门表型具有抑制作用？因此本实施例中将能够抑制MT2124(let-60突变)的多阴门表型的药物同样处理秀丽隐杆线虫CB1275，如果不能抑制其多阴门表型，即测定后发现突变体的比例不变,说明药物作用位点在lin-1上游。此外，由于lin-1为核转录因子，与lin-31相互作用组成复合体，调节阴门细胞发育的过程。若药物对该基因失活突变的多阴门表型具显著的抑制作用，则说明药物可直接抑制阴门前体细胞的发育，阻止其形成多阴门。本实施例的结果如果是CB1275株系线虫的多阴门表型未受到抗肿瘤候选药物的影响，就表明药物作用于ras信号通路可抑制ras过度激活形成的假阴门，不能抑制lin-1缺失突变形成的假阴门表型，说明抗肿瘤候选药物作用于ras而不作用于lin-1，证明抗肿瘤候选药物下调了ras的过度激活而不是直接抑制了细胞的增殖分化起作用的，即抗肿瘤候选药物起作用是ras通路机制依赖地，而非广泛的细胞毒作用。实施例3药物筛选试剂盒的装配本发明所述的药物筛选试剂盒，该试剂盒包括以下试剂：①秀丽隐杆线虫野生型N2；②秀丽隐杆线虫突变体MT2124；③秀丽隐杆线虫CB1275；④NGM培养基；⑤大肠杆菌OP50；⑥染料：2',7'-二氯二氢荧光素二乙酯。其中，所述秀丽隐杆线虫的浓度为100条/20μl，大肠杆菌OP50的浓度为10mg/ml，染料的终浓度为50μg/mL。将以上试剂分装于合适的容器中，放置到外包试剂盒中，其中M9缓冲液、S缓冲液、LB培养基详细记载于使用说明书中。实施例4药物筛选试剂盒可靠性的验证按实施例1所述方法将线虫MT2124同步化，将同步化后孵化的秀丽隐杆线虫MT2124混匀，计数单位液体体积中秀丽隐杆线虫的数目，备用。在96孔板上取2孔，每个孔中先加入140μL的S液，然后加入20μL大肠杆菌菌体溶液，每个孔中加入90条左右的秀丽隐杆线虫MT2124，第一个孔为阴性对照，加入20μL蒸馏水，另一个孔加入20μL浓度为60μM的索拉菲尼。最后使每个孔的液体体积都是200μL。然后将液体混匀，20℃振荡培养6天左右，待其发育为成虫，即产生假阴门后，用M液从平板上冲下，转移到离心管中，待秀丽隐杆线虫自然沉淀，除去上清液，留取秀丽隐杆线虫；加入含0.05％的吐温20的M9液，待秀丽隐杆线虫自然沉淀，除去上清液，留取秀丽隐杆线虫；再用纯净的M9液洗涤至澄清，转移秀丽隐杆线虫到另外的新的96孔板上，位置与原来96板对应，然后加入染料，使其终浓度为50μg/mL，20℃染色1.5h，测各孔荧光值。每个孔做三个平行对照。按上述所述方法处理线虫CB1275，加入1μM、2μM、4μM、6μM不同浓度的索拉菲尼。(1)索拉菲尼验证药物筛选试剂盒验证效果由图4可以看出，空白组是不加入秀丽隐杆线虫，只加入溶液的组，空白组荧光强度极低，无秀丽隐杆线虫的组几乎不产生荧光。阴性对照是加入秀丽隐杆线虫而不加药物的组，与之相比，加入索拉菲尼的实验组，秀丽隐杆线虫群体发出的荧光强度明显降低，说明试剂盒效果良好，能够敏感的检测出受药物处理秀丽隐杆线虫群体的荧光强度差异。且由图5发现RAF靶向抑制剂索拉非尼能够剂量依赖地抑制ras过度激活的活性，对其下游的转录因子lin-1(lf)多阴门突变体却几乎没有影响。本实施例中我们使用临床上有良好效果的抑癌药物索拉菲尼，对本发明药物筛选试剂盒进行了验证，结果表明：加入阳性药物的对照组，秀丽隐杆线虫群体发出的荧光强度明显降低，显示药物筛选试剂盒可达到了预期的效果。总之，本发明利用染料对突变体和野生型秀丽隐杆线虫染色的不同效果来达到操作简单、快速、高效、准确、高通量筛选出有效的抗肿瘤药物的目的，为广大抗肿瘤药物的研发人员节约时间和成本。我们利用阳性药物索拉菲尼对药物筛选试剂盒进行了验证，证明它的效果良好，是一种快速，准确，可以用于高通量药物筛选试剂盒。