一种提取和测定花生脂肪酸的简便方法
【专利摘要】本发明公开了一种提取和测定花生脂肪酸的简便方法，包括以下步骤：新鲜的样品经冷冻干燥获得干组织；称取干样品，放入研钵中，液氮研磨粉碎；或者将干样品放入钳口顶空瓶中，采用玻璃棒碾碎；加入试剂I和II，超声混匀，然后加入试剂III，或再加入内标物，进行水浴反应；反应完成冷却后，加入有机试剂和盐溶液，混匀，将溶液吸出转入离心管中，静置；离心分离，吸取上清液，用于上机测定；采用归一化法或内标法计算脂肪酸组分的含量。本发明简化了样品前处理过程，操作简便、快捷，极大的缩短了试验时间，成本低，需要的样品量少，具有很好的通用性，是一种实验室中简便、准确的花生脂肪酸提取和测定方法。
【专利说明】-种提取和测定花生脂肋酸的简便方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及提取和测定花生脂肪酸的简便方法，属于脂肪酸提取【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 花生是我国重要的油料作物、经济作物和出口创汇作物。花生巧粒油脂的品质是 由脂肪酸的组成决定的。花生脂肪酸主要由踪搁酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、花生酸、花生帰 酸、山俞酸和二十四碳焼酸等八种成分组成，其中油酸和亚油酸为主，约占80%，为人体健康 所必需，如油酸在人体脂类代谢中具有降低有害胆固醇，但保持有益胆固醇水平的功能，从 而减缓动脉粥样硬化，有效预防冠也病等也脑血管疾病的发生。另外，油酸含量高，抗氧化 能力强，产品不易氧化酸败，货架寿命较长，耐储能力也强。因此，对花生品种进行脂肪酸组 成及含量的分析是非常必要的。
[0003] 传统的脂肪酸分析方法主要分为H个部分：脂肪提取，脂肪酸的衍生化处理W及 脂肪酸的气相色谱上机分离鉴定。首先用索氏提取法或浸提法从样品中提取粗脂肪，提取 出的粗脂肪还要经过多个步骤的甲醋化处理，抽提分层后才能进行气相色谱分析，整个过 程需要进行几个小时。传统方法工序繁琐、用时长，并且样品用量大。
[0004] 脂肪酸甲醋化是气相色谱法测定脂肪酸必不可少的步骤之一，其方法较多，如酸 催化醋化、碱催化醋化、有机碱催化醋化等。酸催化醋化催化效果较好并具有普遍的适用 性，该方法适合所有的醋交换反应和游离脂肪酸的甲醋化。比较常使用的酸主要有BFs，肥1 和恥04的甲醇溶液，其中的BFs的甲醇溶液（12%-14%)应用最广泛是非常有效的试齐U。但是 H氣化测有毒，对人体毒害较大。酸催化醋化可W应用于无水和含水样品的甲醋化。但是， 所有酸催化醋化反应都需要进行加热（50-10(TC )，且甲醋化时间较长，一般需40-60min。
[0005] 在样品中没有相当量的游离脂肪酸存在的情况下，可W用碱催化醋化。油脂酸值 在碱催化反应过程中一定要尽可能的低(酸值<1)，否则游离脂肪酸易和催化剂中碱反应 导致生成较多脂肪酸轴和水而降低醋化率；反应原料(包括催化剂）都必须保证无水，水会 消耗催化剂而降低催化效率，还会使甘油H醋水解。经常使用的催化溶液有化0H、K0H和 化0邸3的甲醇溶液。
[0006] -些强的有机碱巧n各种轻基季馈、H甲基銃轻基化物和四甲基脈）也可使类脂醋 交换和游离脂肪酸成盐。有机碱的脂肪酸盐在GC的进样口处更易分解成脂肪酸甲醋，使得 醋化的和游离脂肪酸的分析一步完成。此外，重氮甲焼是一种高效、快速的醋交换催化剂， 也可用于游离脂肪酸和磯酸醋的醋化，但因操作条件苛刻、使用寿命短而不被广泛采用。
[0007] 最早的脂肪酸的甲醋化方法是先用碱性溶液皂化分离，然后再加BF3-CH3OH或者 酸化的醇等进行醋化。由于皂化反应速度慢，整个皂化-醋化消耗的时间长，所W后来发展 了直接醋交换法。直接醋交换反应速度比皂化反应快，水解和醋化反应一步进行，只需要一 种试剂，反应速度不仅快而且操作也简单。但是要获得精确的定量结果，必须要优化醋交换 条件。
[000引本发明通过对花生脂肪酸的提取和甲醋化过程进行条件优化，大大简化了样品前 处理过程。具有操作简便、快捷的优点，极大的缩短了试验时间，节约了大量的人力、物力， 使繁琐的工作变得简单；需要的样品量很少，可达到微量检测；改进后的方法还可用于大 样本的脂肪酸检测；具有很好的通用性，也可应用于酵母、藻类、其它植物等材料的脂肪酸 检测，同样取得了满意的结果。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供适合实验室操作的简便、准确的花生脂肪酸提取和测定的方 法。
[0010] 为达到上述目的，本发明采用W下步骤： 新鲜的样品经冷冻干燥获得干组织；称取干样品，放入研鉢中，液氮研磨粉碎；或者将 干样品放入谢口顶空瓶中，采用玻璃棒碼碎；加入试剂I和II，超声混匀，然后加入试剂 III，或再加入内标物，进行水浴反应；反应完成冷却后，加入有机试剂和盐溶液，混匀，将溶 液吸出转入离也管中，静置；离也分离，吸取上清液，用于上机测定；采用归一化法或内标 法计算脂肪酸组分的含量。
[0011] 具体来说，所述的方法如下： (1)新鲜的样品经冷冻干燥获得干组织。
[0012] (2)称取干样品，放入研鉢中，液氮研磨粉碎；或者将干样品放入谢口顶空瓶中，采 用玻璃棒碼碎。
[0013] (3)向谢口顶空瓶中加入试剂I和II浸泡样品，超声混匀。然后加入试剂III，或 再加入内标物，进行水浴反应。
[0014] (4)反应完成冷却后，加入有机试剂和盐溶液，混匀，将溶液吸出转入离也管中，静 置。
[0015] (5)离也，吸取上清液，用滤膜过滤后转入进样瓶中，用于GC-MS上机测定。
[0016] (6)采用归一化法或内标法计算脂肪酸组分的含量。
[0017] 优选地，步骤（1)所述的样品是新鲜的花生根、茎、叶、花或者种子。取新鲜的花生 根、茎、叶或花，用灭菌的蒸觸水清洗3次，经冷冻干燥后获得干组织。取新鲜的花生种子， 清洗后采用液氮反复研磨，然后再把研碎的种子冷冻干燥。
[0018] 优选地，步骤（2)中采用万用天平称取的干样品量为O.Olg (m)。所用的谢口顶空 瓶大小为5 ml。
[0019] 优选地，步骤（3)所述的试剂I为甲醇，加入体积为850W ;试剂II为盐酸，加入 体积为100W。超声波辅助提取的条件为超声波功率300W，超声波频率28曲Z，超声时间 为lOmin。试剂III为2, 2-二甲氧丙焼，加入体积为50M1。内标物为十九碳酸(购自阿拉 下)，浓度为Img/ml。用压盖器将顶空瓶用带聚四氣己帰垫的铅盖封好，水浴反应的温度为 85°C，反应时间为比。甲醋化过程中每隔lOmin振荡一次。
[0020] 优选地，步骤（4)所述的有机试剂为正己焼，加入体积为0. 5ml ;盐溶液为氯化轴 溶液，浓度为1%，加入体积为1ml。静置的时间为10 min。
[0021] 优选地，步骤（5)所述的离也条件为25°C，400化/min转速离也5min。如果得到的 样品浓度过低，采用氮吹仪吹干上清液，然后用200ul左右正己焼溶解定容，润旋2?3 S，用 0. 22 um滤膜过滤后转入进样瓶中，用于GC-MS上机测定。
[0022] 优选地，步骤（6)中，采用归一化法计算脂肪酸组分的相对含量，即对各组分色谱 峰面积积分，W各组分的峰面积总和为100%，脂肪酸组分的百分含量W占峰面积总和的百 分比表示。
[0023] 优选地，步骤（6)中，采用内标法计算脂肪酸组分的绝对含量。准确称取样品试 样，加入十九碳酸作为内标物，根据试样和内标物的质量比及相应的色谱峰面积之比，按下 式可求组分的质量分数；Wi=AiXM, / (A,XMXRRF)。i为待测定样品中组分，Wi为组分i 的质量分数，为内标使用量，M为样品质量，A i和A ,分别为组分i和内标物的峰面积，RRF 为相对影响因子。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1 在花生品种花育19种子发育的不同时期取样，从果针下地后（DAP) 25天开始，每隔7 天取一次样，共取6次样品。剥掉果壳，保留种子，采用液氮反复研磨，然后再把研碎的种子 冷冻干燥获得干组织。采用万用天平准确称取花生干组织0. Olg(m)，放入已经被酒精清洗 并烘干的5ml谢口顶空瓶中，加入850W的甲醇和100W的盐酸，超声（300w，28曲z)10min 混匀。然后向瓶中加入50W 2, 2-二甲氧丙焼。用压盖器将顶空瓶用带聚四氣己帰垫的铅 盖封好，85C水浴反应比。甲醋化过程中每隔lOmin振荡一次。反应结束后，取出冷却至室 温。用启盖器启盖后，向瓶中加入1ml 1%的化C1溶液和0. 5ml正己焼，混匀，将上层溶液 吸出转入10ml烘干的离也管中，静置10分钟。25C，40(K)r/min转速离也5分钟，吸取上清 液，用0.22 um滤膜过滤后转入进样瓶中。如果得到的样品浓度过低，采用氮吹仪吹干上清 液，然后用200ul左右正己焼溶解定容，润旋2?3 S，用0.22 um滤膜过滤后转入进样瓶中， 用于GC-MS上机测定。采用归一化法计算脂肪酸组分的相对含量，即对各组分色谱峰面积 积分，W各组分的峰面积总和为100%，脂肪酸组分的百分含量W占峰面积总和的百分比表 示。发现(表1 )，在花生种子发育过程中，果针下地39天之前，花育19踪搁酸和硬脂酸含量 变化不大，39天之后，硬脂酸含量逐渐升高，踪搁酸含量逐渐降低。油酸含量的变化规律与 亚油酸相反，说明油酸含量的增加可能由于生成亚油酸脂肪酸的减少。 表1花育1 9种子不同发育时期的脂肪酸组成
【权利要求】
1. 一种提取和测定花生脂肪酸的简便方法，包括以下步骤： (1)新鲜的样品经冷冻干燥获得干组织； (2 )称取干样品，放入研钵中，液氮研磨粉碎；或者将干样品放入钳口顶空瓶中，采用玻 璃棒碾碎； (3) 向钳口顶空瓶中加入试剂I和II浸泡样品，超声混匀； 然后加入试剂III，或再加入内标物，进行水浴反应； (4) 反应完成冷却后，加入有机试剂和盐溶液，混匀，将溶液吸出转入离心管中，静置； (5) 离心，吸取上清液，用滤膜过滤后转入进样瓶中，用于GC-MS上机测定； (6) 采用归一化法或内标法计算脂肪酸组分的含量。
2. 根据权利要求1所述的一种提取和测定花生脂肪酸的简便方法，其特征在于，步骤 (1) 所述的样品是新鲜的花生根、茎、叶、花或者种子； 取新鲜的花生根、茎、叶或花，用灭菌的蒸馏水清洗3次，经冷冻干燥后获得干组织； 取新鲜的花生种子，清洗后采用液氮反复研磨，然后再把研碎的种子冷冻干燥。
3. 根据权利要求1所述的一种提取和测定花生脂肪酸的简便方法，其特征在于，步骤 (2) 中采用万用天平称取的干样品量为0. Olg (m); 所用的钳口顶空瓶大小为5 ml。
4. 根据权利要求1所述的一种提取和测定花生脂肪酸的简便方法，其特征在于，步骤 (3) 所述的试剂I为甲醇，加入体积为850W ;试剂II为盐酸，加入体积为100W ; 超声波辅助提取的条件为超声波功率300w，超声波频率28kHz，超声时间为lOmin ; 试剂III为2, 2-二甲氧丙烷，加入体积为50W ; 内标物为十九碳酸(购自阿拉丁)，浓度为lmg/ml ; 用压盖器将顶空瓶用带聚四氟乙烯垫的铝盖封好，水浴反应的温度为85°C，反应时间 为lh ;甲酯化过程中每隔lOmin振荡一次。
5. 根据权利要求4所述的一种提取和测定花生脂肪酸的简便方法，其特征在于，所述 的内标物储备液配制方法为：称取10 mg内标物十九碳酸，精密称定，置于10 ml容量瓶 中，加入异戊醇至刻度，摇匀，转移至密封的螺口试管中，冷藏保存。
6. 根据权利要求1所述的一种提取和测定花生脂肪酸的简便方法，其特征在于，步骤 (4) 所述的有机试剂为正己烷，加入体积为0. 5ml ;盐溶液为氯化钠溶液，浓度为1%，加入体 积为lml ; 静置的时间为10 min。
7. 根据权利要求1所述的一种提取和测定花生脂肪酸的简便方法，其特征在于：步骤 (5) 所述的离心条件为25°C，4000r/min转速离心5min ; 如果得到的样品浓度过低，采用氮吹仪吹干上清液，然后用200ul左右正己烷溶解定 容，涡旋2~3 s，用0. 22 um滤膜过滤后转入进样瓶中，用于GC-MS上机测定。
【文档编号】G01N30/02GK104502475SQ201410761010
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月12日 优先权日:2014年12月12日
【发明者】迟晓元, 孙全喜, 潘丽娟, 陈娜, 陈明娜, 王通, 王冕, 禹山林, 杨珍 申请人:山东省花生研究所