一种免疫球蛋白IgM免疫比浊法检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种免疫球蛋白IgM免疫比浊法检测试剂盒，属于临床体外检测试剂【技术领域】。本发明试剂盒包括试剂R1、试剂R2、校准品。通过在试剂R1中加入一定量的二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒和在试剂R2中加入一定量的牛血清白蛋白和Kathon-CG，有效的提高了试剂盒的稳定性和分析灵敏度，其线性范围也较好，试剂的准确度高，有利于在市场中进一步的推广使用。
【专利说明】一种免疫球蛋白IgM免疫比浊法检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及临床体外检测试剂【技术领域】，特别涉及一种免疫球蛋白IgM免疫比浊 法检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 免疫球蛋白由重链和轻链组成，根据重链（Heavy chain, H链）恒定区化学结 构的不同，相应的免疫球蛋白被划分为多种类型，分别为免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白 D (IgD)、免疫球蛋白A (IgA)、免疫球蛋白E(IgE)以及免疫球蛋白G (IgG)。
[0003] 人免疫球蛋白M (IgM)存在于人的血清中，占血清免疫球蛋白总量的5~10%，血清 浓度约lmg/ml,主要由脾脏中楽细胞合成,一个IgM分子由5个单体通过J链连接成五聚 体，有较高抗原结合价，也是五类免疫球蛋白（IgA、IgD、IgE、IgG、IgM)中分子量最大的， 其分子量为950k道尔顿，故又称为巨球蛋白。
[0004] IgM是一种最早期的免疫球蛋白，是初次接触抗原后首先合成的免疫球蛋白。在成 年人的血清中，占总免疫球蛋白的5%。IgM浓度下降发生在原发性及继发性免疫缺陷综合 症中。IgM值的减少常见于蛋白质流失性肠道疾病及烧伤。严重感染和自身免疫性疾病可 导致IgM浓度上升。多种巨球蛋白血症、细菌和寄生虫传染病、肝脏疾病、类风湿性关节炎 及胆囊纤维症可使IgM浓度增加。
[0005] 目前，实验室常用的IgM测定方法有HPLC及ELISA法。HPLC具有特异性强、灵敏 度高、重复性好等优点，现在公认其为测定血浆IgM浓度的首选方法，但因 HPLC需要的设备 复杂且昂贵，难以适应常规临床化学实验室应用，而ELISA法操作过程有些繁琐，反应需要 时间，不能一蹴而就。免疫球蛋白IgM免疫比浊法检测试剂盒基于IgM抗体与IgM抗原间 的反应，形成免疫复合物，在340nm波长处检测其浊度变化，其变化程度与样本中的IgM含 量成正比。该方法是一种无需预处理样本，技术和设备要求不高，而精密度和特异性更高的 分析方法。由于该方法不需要昂贵的设备，可以实现自动化，且可测定大量标本，因此受到 临床广泛推广。但是普通的免疫球蛋白IgM免疫比浊法检测试剂稳定性不好，准确度和灵 敏度也不高，因而限制了其在临床上的推广应用。
【发明内容】
[0006] 针对于现有技术存在的问题，本发明提供了一种免疫球蛋白IgM免疫比浊法检测 试剂盒，该试剂盒与常规的试剂盒相比，稳定性和线性范围比常规的检测试剂盒要好，分析 灵敏度高，有利于试剂在临床上的推广应用。
[0007] 本发明是通过以下措施实现的： 一种免疫球蛋白IgM免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于，它包含试剂R1、试剂R2和 校准品，其中试剂Rl组成为：18. 16mmol/L pH 7. 6 Tris缓冲液、123. 20mmol/L氯化钠、6% 聚乙二醇400、0. 1%-2%二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒；试剂R2组成为：18. 16mmol/L pH 7. 6Tris缓冲液、30ml/L羊抗人IgM抗体、20-40g/L牛血清白蛋白、0. 05% Kathon-CG。
[0008] 所述二氧化娃包覆的磁性纳米颗粒为Fe304/Si0 2复合纳米粒子，粒径为20_50nm。
[0009] 所述试剂Rl和试剂R2在使用时的比例为Rl :R2=250 :50。
[0010] 本发明所使用的二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒是采用以下方法制备的： 采用多元醇法制备Fe3O4纳米粒子。取一定的乙酰丙酮铁和三甘醇加入到回流加热反 应装置中，在磁力搅拌和Ar气保护的条件下，将装置缓慢加热至沸腾，并保持回流一段时 间。冷却后向反应溶液中加入乙酸乙酯使生成的四氧化三铁纳米粒子产生絮凝，磁性分离 黑色产物，清洗数次，分散到乙醇中，即得到稳定的Fe3O4纳米粒子乙醇胶体溶液。之后将所 得Fe3O4纳米粒子采用Stober水解法制得SiO2包覆的Fe 3O4纳米粒子。所得Fe304/Si02复 合纳米粒子的粒径为20_50nm。
[0011] 本发明所使用的校准品为久峰润达生物技术有限公司生产的IgM校准品。
[0012] 本发明的试剂盒在具有双试剂功能的自动生化分析仪上进行，其具体使用方法如 下： 加入生理盐水、样本或校准品2 yl，之后再加入Rl试剂250 ill预孵育5min后读取吸 光度A1，之后再加入50iU的试剂R2反应5min后，读取吸光度A2,并计算AA。
[0013] 本发明的有益效果： 本发明提供的免疫球蛋白IgM免疫比浊法检测试剂盒，通过在试剂Rl中加入二氧化 硅包覆的磁性纳米颗粒，该磁性纳米颗粒在静电吸附的作用下与羊抗人IgM抗体结合，从 而使抗体在磁性纳米颗粒上形成凝集，大大的提高了试剂的分析灵敏度。同时在试剂R2中 加入牛血清白蛋白，解决了抗体在稀溶液中不稳定这一难题，在试验中它能使抗体稳定，且 相对地中性，但不会影响抗体的性质，而Kathon-CG是一种新型高效环保型广谱杀菌剂、防 腐剂，在该试剂盒中使用Kathon-CG有效解决了 BSA长时间保存易发霉的缺点，因此BSA与 Kathon-CG共同作用有效地增强了试剂盒的稳定性，却不会对试剂的准确度产生影响，有利 于该试剂在市场中进一步的推广。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1实施例2准确度验证实验检测结果与对照组检测结果相关性； 图2实施例3准确度验证实验检测结果与对照组检测结果相关性； 图3实施例4准确度验证实验检测结果与对照组检测结果相关性。
【具体实施方式】
[0015] 为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步详细说明。
[0016] 实施例1 一种常规的免疫球蛋白IgM免疫比浊法检测试剂盒，它包括试剂R1、试剂R2、校准品。
[0017] 其中试剂Rl组成为： pH 7. 6 Tris 缓冲液 18. 16 mmol/L 氯化钠 123. 20 mmol/L 聚乙二醇400 6% 试剂R2组成为： Tris 缓冲液 pH 7. 6 18. 16 mmol/L 羊抗人IgM抗体 30ml/L 本实施例描述的试剂盒，在使用时，其测定方法是采用具有双试剂功能的东芝120自 动分析仪，操作如下： 加入生理盐水、样本或校准品2 yl，之后再加入Rl试剂250 ill预孵育5min后读取吸 光度A1，之后再加入50iU的试剂R2反应5min后，读取吸光度A2,并计算AA。
[0018] 本实施例所使用的校准品为久峰润达生物技术有限公司生产的IgM校准品。
[0019] 实施例2 一种免疫球蛋白IgM免疫比浊法检测试剂盒，它包括试剂R1、试剂R2、校准品。
[0020] 其中试剂Rl组成为： pH 7. 6 Tris 缓冲液 18. 16 mmol/L 氯化钠 123. 20 mmol/L 聚乙二醇400 6% 二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒 〇. 1% 试剂R2组成为： Tris 缓冲液 pH 7. 6 18. 16 mmol/L 羊抗人IgM抗体 30ml/L 牛血清白蛋白 20g/L Kathon-CG 0.05% 具体测定方法同实施例1。
[0021] 实施例3 一种免疫球蛋白IgM免疫比浊法检测试剂盒，它包括试剂R1、试剂R2、校准品。
[0022] 其中试剂Rl组成为： pH 7. 6 Tris 缓冲液 18. 16 mmol/L 氯化钠 123. 20 mmol/L 聚乙二醇400 6% 二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒 1% 试剂R2组成为： Tris 缓冲液 pH 7. 6 18. 16 mmol/L 羊抗人IgM抗体 30ml/L 牛血清白蛋白 30g/L Kathon-CG 0.05% 具体测定方法同实施例1。
[0023] 实施例4 一种免疫球蛋白IgM免疫比浊法检测试剂盒，它包括试剂R1、试剂R2、校准品。
[0024] 其中试剂Rl组成为： pH 7. 6 Tris 缓冲液 18. 16 mmol/L 氯化钠 123. 20 mmol/L 聚乙二醇400 6% 二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒 2% 试剂R2组成为： Tris 缓冲液 pH 7. 6 18. 16 mmol/L 羊抗人IgM抗体 30ml/L 牛血清白蛋白 40g/L Kathon-CG 0.05% 具体测定方法同实施例1。
[0025] 对上述实施例1-4中制得的试剂盒分析性能进行实验验证。
[0026] 准确度验证实验： 将实施例2、3、4的试剂盒作为实验组，市场上获得认可的一种准确度优异的免疫球蛋 白IgM试剂盒(长春某公司生产）作为对照组进行对比实验，对40个样本进行检测，检测的 结果如图1-图3。
[0027] 通过图1-图3的检测数据可知，实施例2、3、4检测试剂盒与对照检测试剂盒的检 测结果相关性分别为〇. 998、0. 999U0. 9981，相关性比较好，表明本发明的试剂盒与市场上 获得认可的具有优异准确度的免疫球蛋白IgM检测试剂盒有高度一致性，证明本发明试剂 盒添加的其他各种成分对其准确性不会造成影响，试剂盒依然保持较好的准确度。
[0028] 线性相关性验证实验： 找到免疫球蛋白IgM高值样本为500 mg/dL，用生理盐水进行系列稀释，配制6个不同 浓度的样本，依次为 37.00 mg/dL、27.75 mg/dL、18.50 mg/dL、9.25 mg/dL、0 mg/dL浓度的 样本，每个浓度水平各样本分别测定三次，分别取其平均值。分别利用实施例1、2、3、4的试 剂进行检测。检测结果如表1所示。
[0029] 表1实施例1-4线性相关验证实验检测结果
【权利要求】
1. 一种免疫球蛋白IgM免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于，它包含试剂R1、试剂R2 和校准品，其中试剂R1组成为：18. 16mmol/L pH 7. 6 Tris缓冲液、123. 20mmol/L氯化钠、 6%聚乙二醇400、0. 1%-2%二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒；试剂R2组成为：18. 16mmol/L pH 7. 6Tris缓冲液、30ml/L羊抗人IgM抗体、20-40g/L牛血清白蛋白、0. 05% Kathon-CG。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒为 Fe304/Si02复合纳米粒子,粒径为20_50nm。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和试剂R2在使用时的比例 为 R1 :R2=250 :50。
【文档编号】G01N33/543GK104407159SQ201410765259
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月15日 优先权日:2014年12月15日
【发明者】甘宜梧, 董雯, 谭柏清, 谢清华, 王绮, 李静, 包兴艳 申请人:山东博科生物产业有限公司