用于在固体或半固体介质上表征微生物的方法
【专利摘要】本发明涉及利用内荧光(IF)测量结果在固体介质或半固体介质上扫描、检测和监测微生物的方法和系统。该方法进一步涉及利用微生物特有的内荧光(IF)测量结果在固体或半固体介质上检测、表征和/或鉴定微生物。
【专利说明】用于在固体或半固体介质上表征微生物的方法
[0001] 本申请是申请日为2009年12月15日，申请号为200980156509. 2,发明名称为"用 于在固体或半固体介质上表征微生物的方法"的申请的分案申请。
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求2008年12月16日提交的标题为"Methods for Qiaracterization of Microorganisms on Solid or Semi-Solid Media(用于在固体或半固体介质上表征微 生物的方法）"、编号为61/122, 925的美国临时专利申请的权益，其被并入本文。 发明领域
[0004] 本发明设及用于在固体或半固体介质上检测、监测、表征、和/或鉴定微生物的方 法和系统。
[000引发明背景
[0006] 为了临床诊断目的而分离出来的微生物W及用W监测食品、医疗组织（medical tissues)或环境的污染而分离出来的那些微生物通常需要被表征，W确定适当的反应来 应对所发现的生物的存在。传统的自动化表型鉴定分析法，例如Vitek"'、Phoenix?、和 MicroscaiiK系统，或者例如API的人工表型试验，要求微生物处于适当的生长阶段且无干 扰介质和血液制品，W提供稳健的结果。该些系统使用在铺板的介质上生长16 - 24小时 的菌落，之后从所述菌落制备标准化悬浮液，随后实际的表征试验要求进一步解育4 - 24 小时来完成。
[0007] 光学光谱学方法例如内巧光（intrinsic fluorescence, IF)、红外光谱（FTIR) 或拉曼光谱具有允许非常快速地鉴定微生物的潜能，但是仅被证明对"洁净的"微生物悬 浮液起作用。出版物已经描述了用于微生物表征的IF法，其仅适用于有限的生物组，或 其要求另外的测量例如特异性结合事件W满足功能性表征。由于介质自身对分光镜图案 (pattern)的假定的大量影响，直接检查生长介质上的微生物被认为是存在问题的。
[000引本发明通过提供W下方法克服了现有技术中的问题，所述方法能够对在巧光的固 体和/或半固体生长介质、包括高巧光介质上直接进行分光镜探测（interrogate)的微生 物进行区分。
[0009] 发明概述
[0010] 本发明提供用于在固体和/或半固体介质上检测、监测、表征、和/或鉴定微生物 的方法。表征包括广泛的微生物的分类或分级，W及单一物种的实际鉴定。如本文所用，"鉴 定"是指测定先前未知的微生物属于哪一科、属、种、和/或菌株。例如，鉴定一个先前未知 的微生物到科、属、种、和/或菌株级别。本文公开的方法允许微生物的检测、表征和/或鉴 定比先前技术更快速，促成了更快速的诊断（例如，在感染或疑似感染的受试者中）和受污 染材料的鉴定（例如，食品和药品）。包括在本发明方法中的步骤可W在短时帖内执行，W 产生临床相关的可操作的信息。在某些实施方式中，快速生长的生物可W仅在数小时内检 测和鉴定。较慢生长的生物可W比先前技术更快速地检测和鉴定，在有用的时帖内提供结 果。单独的鉴定/表征步骤可w在几分钟或更少时间内执行。该方法也允许同时（例如， 在混合培养物中）检测、监测、表征、和/或鉴定多种类型的微生物（例如，不同的纲和/或 种）。有益地，在一些实施方式中，本发明的方法可W原位完成，而不用破坏菌落，由此保存 了所述菌落进行进一步的试验或使用。另外，本发明的方法可W部分或完全自动化，由此降 低了操作传染性材料的风险和/或污染样品的风险。
[0011] 本发明的第一方面设及在固体或半固体介质上表征和/或鉴定微生物的方法，包 括：
[0012] (a)在固体或半固体介质上探测一个或多个菌落W生成菌落中的微生物特有的内 巧光（I巧测量结果；和
[0013] 化）基于内巧光（I巧测量结果表征和/或鉴定菌落中的微生物。
[0014] 在一些实施方式中，其中所述菌落可W是具有小于50 ym的直径的微菌落。
[0015] 在一些实施方式中，其中，可W在探测步骤（a)之前，使已知含有或疑似含有微生 物的样品在所述固体或半固体介质上生长，W生成至少一个菌落。
[0016] 在一些实施方式中，其中所述探测步骤可W是非侵入性的。
[0017] 在一些实施方式中，其中所述微生物可被表征到一个或多个分类模型，所述分类 模型选自由革兰氏组、临床革兰氏组、治疗组、功能组、和天然内巧光组组成的组。
[0018] 在一些实施方式中，其中所述微生物可被鉴定到属级别、种级别、或菌株级别。
[0019] 在一些实施方式中，其中所述IF测量结果可通过光谱法产生，并且所述光谱法包 括测定激发一发射矩阵巧EM)。优选地，其中可将所述邸1与已知微生物的邸1的数据库相 比较。优选地，其中所述可包括至少2个不同的波长对。优选地，其中所述ffiM可使用 多变量分析进行比较。
[0020] 在一些实施方式中，所述方法还可包括添加鉴定剂到所述介质或样品中，并且其 中所述鉴定部分地基于所述鉴定剂在所述菌落或从所述菌落回收的微生物中的存在和/ 或数量。优选地，其中所述鉴定剂可W是亲和配体、抗体或其片段、核酸探针、抗生素、适体、 肤模拟物、瞻菌体来源的结合蛋白、凝集素、宿主防御肤、细菌素、瞻菌体、染料，或其任何组 厶 口 〇
[0021] 在一些实施方式中，其中所述固体或半固体介质可包括一种或多种对所述微生物 的生长有用的营养素W及一种或多种添加剂，其中所述一种或多种添加剂增强在所述固体 或半固体介质上的所述微生物菌落的所述内巧光测量结果。优选地，其中所述一种或多种 添加剂可选自由W下组成的组；蛋白质水解产物、氨基酸、肉类和蔬菜提取物、糖源、缓冲 剂、复苏剂、生长因子、酶辅因子、矿物盐、金属补充物、还原化合物、馨合剂、光敏化剂、巧灭 剂、还原剂、氧化剂、洗漆剂、表面活性剂、消毒剂、选择剂和代谢抑制剂。
[0022] 在一些实施方式中，其中探测菌落可包括测量落射巧光。
[0023] 在一些实施方式中，其中探测菌落可包括测量反射光。
[0024] 本发明的另一方面设及在固体或半固体介质上检测和鉴定微生物的方法，包括：
[0025] (a)扫描已知含有或可能含有一个或多个微生物菌落的介质W定位存在于介质上 的所述菌落；
[0026] 化）探测一个或多个步骤（a)中定位的菌落W生成所述菌落中的微生物特有的内 巧光（I巧测量结果；和
[0027] (c)基于所述内巧光（I巧测量结果检测、表征和/或鉴定菌落中的微生物。
[002引本发明的另一方面设及表征和/或鉴定样品中微生物的方法，包括：
[0029] (a)使样品中存在的微生物在固体或半固体介质上生长，W产生至少一个菌落；
[0030] 化）探测介质上一个或多个菌落，W生成微生物特有的内巧光（I巧测量结果；和
[0031] (C)基于生成的测量结果，表征和/或鉴定菌落中的微生物。
[0032] 本发明的另一方面设及检测样品中存在的微生物的方法，包括：
[0033] (a)获得已知含有或可能含有微生物的样品；
[0034] 化）使样品中存在的微生物在固体或半固体介质上生长；和
[0035] (C)通过进行所述固体或半固体介质的逐点扫描W生成内巧光（I巧测量结果，定 位存在于介质上的任一菌落；其中，如通过生成的测量结果定位的一个或多个菌落的存在 表明在样品中存在微生物。
[0036] 在一些实施方式中，其中所述IF测量结果可通过光谱法产生，并且所述光谱法包 括测定激发一发射矩阵巧EM)。优选地，其中所述ffiM可包括至少2个不同的波长对。
[0037] 在一个实施方式中，本发明设及用于在固体或半固体介质上检测、表征和/或鉴 定微生物的系统，该系统包括分光光度计和聚焦光学部件（focusing optics),例如透镜系 统或显微镜。在其他实施方式中，该系统还包括用于扫描介质表面的机械装置和/或用于 控制介质的环境（例如，解育介质的环境）的机械装置。
[003引在另一个实施方式中，可W探测菌落W产生测量结果，该测量结果可W用于检测、 表征和/或鉴定该菌落的微生物（例如，可W使用光谱法探测该菌落）。可W通过将所述菌 落的测量结果（例如，光谱）与源自已知微生物的相似测量结果（例如，一种或多种光谱） 进行比较，来表征和/或鉴定微生物。在另一个实施方式中，可W非侵入性地探测菌落（例 如，在密封平板中）。直接（例如，在密封平板中）表征和/或鉴定菌落中含有的微生物而 不用进一步处理的能力增强了微生物鉴定的安全性。
[0039] 在另一个实施方式中，分光镜的探测是基于微生物的内在特性（例如，内巧光）。 在另一个实施方式中，分光镜的探测部分上基于从附加试剂获得的信号，该试剂在本发明 方法过程中添加，并与特定的微生物或微生物组相互作用。
[0040] 在另一个实施方式中，所述方法进一步包括回收菌落、重悬浮菌落和执行进一步 鉴定和/或表征试验的步骤（例如，耐药性、毒力因子、抗菌谱）。
[0041] 本发明的另一方面设及一种在固体或半固体介质上检测和表征微生物的方法，该 方法包括：
[0042] (a)扫描已知含有或可能含有一个或多个微生物菌落的固体或半固体介质W定位 存在于所述介质上的任何菌落；
[0043] 化）探测在步骤（a)中定位的一个或多个菌落W生成所述菌落中微生物特有的内 巧光（I巧测量结果；和
[0044] (C)基于所述内巧光（I巧测量结果表征所述菌落中的微生物。
[0045] 在一些实施方式中，其中所述扫描可包括对所述固体或半固体介质的表面的逐点 扫描。
[0046] 在一些实施方式中，其中所述菌落可W是具有小于50 ym的直径的微菌落。
[0047] 在一些实施方式中，其中所述探测步骤可W是非侵入性的。优选地，其中所述微生 物可被表征到属级别或种级别。
[0048] 在一些实施方式中，其中所述微生物可被表征到一个或多个分类模型，所述分类 模型选自由革兰氏组、临床革兰氏组、治疗组、功能组、和天然内巧光组组成的组。
[0049] 在一些实施方式中，其中所述IF测量结果可通过光谱法产生，并且所述光谱法包 括测定激发一发射矩阵巧EM)。优选地，其中所述ffiM可包括至少2个不同的波长对。优选 地，其中可将所述与已知微生物的ffiM的数据库相比较。
[0化0] 在一些实施方式中，所述方法还可包括添加鉴定剂到所述介质或样品中，并且其 中所述鉴定部分地基于所述鉴定剂在所述菌落或从所述菌落回收的微生物中的存在和/ 或数量。优选地，其中所述鉴定剂可W是亲和配体、抗体或其片段、核酸探针、抗生素、适体、 肤模拟物、瞻菌体来源的结合蛋白、凝集素、宿主防御肤、细菌素、瞻菌体、染料，或其任何组 合。
[0051] 在一些实施方式中，其中所述固体或半固体介质可包括一种或多种对所述微生物 生长有用的营养素和一种或多种添加剂，其中所述一种或多种添加剂增强在所述固体或半 固体介质上的所述微生物菌落的所述内巧光测量结果。优选地，其中所述一种或多种添加 剂可选自由W下组成的组；蛋白质水解产物、氨基酸、肉类和蔬菜提取物、糖源、缓冲剂、复 苏剂、生长因子、酶辅因子、矿物盐、金属补充物、还原化合物、馨合剂、光敏化剂、巧灭剂、还 原剂、氧化剂、洗漆剂、表面活性剂、消毒剂、选择剂和代谢抑制剂。
[0化2] 在一些实施方式中，其中探测菌落可包括测量落射巧光。
[0化3] 在一些实施方式中，其中探测菌落可包括测量反射光。
[0054] 本发明在本文附图中做更详细的解释，并且给出说明如下。
[0化5] 附图简述
[0056] 图1A-1D显示了来自未接种的没有膜（A)的血琼脂平板炬AP)或具有置于介质表 面上的化11 Metricel Black网格聚離讽膜（Pall)炬）、Whatman黑色混合醋膜（WME) (C) 或Whatman径迹蚀刻聚碳酸醋黑色膜（WPC)值）的BAP的光谱。
[0057] 图2A-2C显示了获自EC3(A)和SA1炬）的BAP之上的WME膜上的菌落的光谱，W 及从SA1光谱减去EC3光谱的结果（C)。
[0化引 图3A-3D显示了获自EC1 (A)、SA1炬）、EF1似、和PA1值）的无膜BAP上的菌落的 光谱。
[0化9] 图4A-4F显示了运行F的逐点IF捜寻扫描的S维图，其中高度等于巧光强度。该 图显示了取自化(4)、她炬）、1011(〇、1化值）、1化巧）、和2化(。）的测量结果。
[0060] 图5A-5B显示了 2化后源自运行F的BAP的特写图像（A)，和显示相应菌落位点的 源自12h的捜寻扫描的巧光强度的等高曲线图炬）。
[0061] 发明详述
[0062] 本发明能够W不同形式具体实施，并且不应理解为被本文所述实施方式所限制。 另外，提供该些实施方式W使得本公开将是透彻和完整的，W及将完全地将本发明范围传 达给本领域技术人员。例如，就一个实施方式阐述的特征可W引入到其他实施方式中，且就 一个特定的实施方式阐述的特征可W从该实施方式中删除。另外，针对本文建议的实施方 式的多种变化和添加，从本公开文本的角度来说，将对本领域技术人员是明显的，并不背离 本发明。
[0063] 除非另外说明，本文所用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域技术 人员通常理解的相同含义。在此用于描述本发明的术语仅仅是用于描述特定的实施方式的 目的，而并非旨在限制本发明。
[0064] 定义
[0065] 如本文所用，"一"、"一个"或"该"可指一个或多于一个。例如，"一个"细胞可W 指一个单独的细胞或是多个细胞。
[0066] 另如本文所用，"和/或"是指并且涵盖所列相关事项中的一个或多个的任何和所 有可能的组合，W及当二选一说明时的不组合（"或"）。
[0067] 此外，如本文所用的术语"大约"当设及可测量的数值时，例如化合物或试剂的量、 剂量、时间、温度、等等，意在涵盖指定量的±20%、±10%、±5%、±1%、±0. 5%、或者甚 至±0. 1 %的变化。
[0068] 如本文所用，术语"微生物"旨在涵盖可W在实验室中繁殖和处理的通常是 单细胞的生物，包括但不限于，革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌、酵母、霉菌、寄生虫和 柔膜体。本发明的革兰氏阴性细菌的非限制性例子包括如下所示的属的细菌：假单 胞菌属（Pseudomonas)、埃希杆菌属巧scherichia)、沙口氏菌属（Salmonella)、志贺 氏菌属（Shigella)、肠杆菌属巧nterobacter)、克雷白氏杆菌属化lebsiel la)、沙雷 氏菌属（Serratia)、变形菌属（Proteus)、弯曲杆菌属（Camp}dobacte;r)、嗜血杆菌属 (Haemo地ilus)、摩根氏菌属（Morganella)、弧菌属（Vibrio)、耶尔森菌属（Yersinia)、 不动杆菌属（Acinetobacter)、募养单胞菌属（Stenotrophomonas)、短波单胞菌属 炬revundimonas)、劳尔氏菌属（Ralstonia)、无色杆菌属（Ac虹omobacter)、梭形杆菌 属（F'usobacterium)、普氏菌属（Prevotella)、布兰汉氏球菌属炬ranhamella)、奈瑟 菌属（Neisseria)、伯克霍尔德菌属炬urldiolderia)、巧樣酸杆菌属（Citrobacter)、 哈夫巧菌属（化化ia)、爱德华菌属巧dwardsiella)、气单胞菌属（Aeromonas)、莫 拉菌属（Moraxella)、布氏菌属炬rucella)、己斯德菌属（Pasteurella)、普罗威登 斯菌属（Providencia)、和军团杆菌属（Legionella)。本发明的革兰氏阳性细菌 的非限制性例子包括如下所示的属的细菌：肠球菌属巧nterococcus)、链球菌属 (Str巧tococ州S)、葡萄球菌属（Staphylococ州S)、芽抱杆菌属炬acillus)、类芽抱杆 菌属（Paenibacillus)、乳酸菌属（Lactobacillus)、李斯特菌属（Listeria)、消化链球 菌属（P巧tostreptococcus)、丙酸菌属（Propionibacterium)、梭菌属（Clostridium)、 拟杆菌属炬acteroides)、加德纳菌属（Gar化erella)、库克菌属化0州ria)、乳球菌 属（Xactococcus)、明串珠菌属（Xeuconostoc)、微球菌属（Micrococcus)、分枝杆菌 属（Mycobacteria)和椿状杆菌属（Corynebacteria)。本发明的酵母和霉菌的非限 制性例子包括如下所示的属的该些：念珠菌属（Candida)、隐球菌属（化yptococ州S)、 诺卡氏菌属（Nocardia)、青霉属（Penicillium)、链格抱属（Alternaria)、赤酿母属 巧hodotorula)、曲霉属（Aspergillus)、梭霉菌属（F'usarium)、酵母属（Saccharomyces) 和毛抱子菌属（Trichosporon)。本发明的寄生虫的非限制性例子包括如下所示的属的该 些；锥虫属（Trypanosoma)、己贝虫属炬油esia)、利什曼原虫属（Leishmania)、追原虫属 (Plasmodium)、吴策线虫属（Wucheria)、布鲁丝虫属炬rugia)、盘尾属（Onchocerca)、和耐 格里原虫属（化egleria)。本发明的柔膜体的非限制性例子包括如下所示的属的该些：支 原体属（Mycoplasma)和脈原体属（Ureaplasma)。
[0069] 如本文所用，术语"菌落"和"微菌落"指的是彼此紧密靠近的、位于一个表面上的 并且是单个祖先微生物通过原位复制产生的克隆后代的大量微生物或微生物的种群。通 常，"菌落"对于人类眼睛是可见的，并且通常直径大于约50 ym、60 ym、80 ym、或100 ym。 然而，如本文所用，除非另外说明，术语"菌落"意在包括具有50 ym或W上直径的菌落，W 及具有50 ym或W下直径的"微菌落"。在其他实施方式中，本发明设及扫描、检测、表征和 /或鉴定"微菌落"中的微生物。如本文所用，"微菌落"可W包括从约2 y m到50 y m或从 约10 ym到50 ym的范围。"微菌落"通常对于肉眼来说太小而看不到（例如，直径小于约 50 y m)。
[0070] 如本文所用，术语"扫描"或"进行扫描"指的是W系统的或预定的模式或随机地 捜索预先定义的区域，W定位目标物（例如，微生物菌落）。例如，可通过在一个表面上W系 统的或预定的模式或随机地移动集中的光束来"扫描"固体或半固体介质，W检测、定位、或 W其他方式侦测微生物菌落。在可替代的实施方式中，固体或半固体介质能够相对于光束 W系统的或预定的模式或随机地移动，W检测、定位、或W其他方式侦测微生物菌落。根据 该实施方式，光源典型地具有小于约0. 5mm、小于约0. 2mm或小于约0. 1mm的光束直径。在 另一个实施方式中，光束直径从约5 y m到约500 y m，从约10 y m到约100 y m或从约20 y m 到约80 y m。
[0071] 在一个实施方式中，"进行扫描"可能包括固体或半固体介质的逐点"扫描"。根据 该实施方式，光源（例如，激光束）可W移动到固体或半固体介质上的第一点，执行扫描或 探测步骤，W检测和/或表征任何可能存在的微生物菌落。可替代地，所述固体或半固体介 质可W相对于光源移动，使得对该固体或半固体介质进行逐点扫描。随后，可W移动该光源 (例如，激光束）或该固体或半固体介质，使得可W扫描和/或探测介质上的第二点。该种 逐点扫描过程可W-直持续，直到完成给定的捜索区域的逐点扫描。该捜索区域可W是该 固体或半固体介质（例如，介质平板）的整个表面或其一部分。
[0072] 在另一个实施方式中，逐点捜索可W沿着线性轨迹（例如，跨过介质的长直线）点 到点地执行。随后，光源或介质可W移动到第二线性行，并且沿着第二线性行的线性轨迹进 行逐点捜索。该种逐点和逐行捜索模式（或网格型扫描）可W-直持续，直到完成给定的 捜索区域。该捜索区域可W是固体或半固体介质（例如，介质平板）的整个表面或其一部 分。在另一个实施方式中，所述扫描是连续扫描（即，连续的逐点扫描）。
[0073] 本发明提供了用于在固体或半固体介质上检测、监测、表征和/或鉴定微生物的 方法。该快速方法允许微生物的检测、表征和/或鉴定比先前技术更快捷，形成更快速的诊 断（例如，在感染或疑似感染的受试者中），受污染材料（例如，食品、供水和药品）的表征 和/或鉴定。包括在本发明的方法中的步骤，从获得样品到微生物的表征/鉴定，可W在短 时帖内执行，W获得临床相关的可操作信息。在某些实施方式中，本发明方法可W在少于约 72小时内执行，例如，少于约18、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1小时。在某些实施方式中， 鉴定步骤可W在少于60分钟内执行，例如，少于约50、40、30、20、10、5、4、3、2或1分钟。该 方法可W用于表征和/或鉴定本文所述的任何微生物。在一个实施方式中，微生物为细菌。 在另一个实施方式中，微生物是酵母。在另一个实施方式中，微生物是霉菌。该方法可W用 于检测、监测、表征和/或鉴定多种类型的微生物，例如，不同种、属、科、目、纲、n和/或界 的微生物。在一个实施方式中，本发明的方法容许例如在混合培养物中表征和/或鉴定样 品中存在的某些类型的微生物或所有不同类型的微生物。在其他实施方式中，该方法可W 用于表征和/或鉴定两种或多种不同类型的细菌，两种或多种不同类型的酵母，两种或多 种不同类型的霉菌，或两种或多种不同类型的细菌、酵母、和/或霉菌的混合物。多种类型 微生物中的每一种的检测可W同时或几乎同时发生。另外，本发明的方法可W部分地或完 全地自动化，由此降低了操作传染性材料和/或污染样品的风险。
[0074] 本发明的第一方面设及在固体或半固体介质上表征和/或鉴定微生物的方法，包 括：
[0075] (a)在固体或半固体介质上探测一个或多个菌落，W生成菌落中微生物特有的内 巧光（I巧测量结果；和
[0076] 化）基于生成的测量结果，表征和/或鉴定菌落中的微生物。
[0077] 本发明的另一方面设及在固体或半固体介质上检测、表征和/或鉴定微生物的方 法，包括：
[007引 （a)扫描已知含有或可能含有一个或多个微生物菌落的介质W定位存在于介质上 的所述菌落；
[0079] 化）探测一个或多个步骤（a)中定位的菌落，W生成菌落中微生特有的内巧光 (I巧测量结果；和
[0080] (C)基于生成的测量结果，表征和/或鉴定菌落中的微生物。
[0081] 本发明的另一方面设及表征和/或鉴定样品中微生物的方法，包括：
[0082] (a)使样品中存在的微生物在固体或半固体介质上生长，产生至少一个菌落；
[0083] 化）探测介质上的一个或多个菌落，W生成微生物特有的内巧光（I巧测量结果； 和
[0084] (C)基于生成的测量结果，表征和/或鉴定菌落中的微生物。
[0085] 本发明的另一方面设及检测样品中微生物的存在的方法，包括：
[0086] (a)获得已知含有或可能含有微生物的样品；
[0087] 化）使样品中存在的微生物在固体或半固体介质上生长讯
[008引 （C)通过扫描介质生成内巧光（I巧测量结果，定位存在于介质上的任一菌落；
[0089] 其中，就像生成的测量结果所定位的，一个或多个菌落的存在表明在样品中存在 微生物。
[0090] 可W利用本发明方法试验的样品包括临床和非临床的样品，其中微生物的存在和 /或生长是已知的或可疑的，另外还包括接受常规的或临时的试验W确定微生物的存在的 材料样品。由于本方法的通用性和/或灵敏度，所用样品的量可W差别很大。样品制备可 W按照任何数目的本领域技术人员所知的技术来完成。
[0091] 可W用于试验的临床样品包括通常在临床实验室和/或研究实验里进行试验的 任一类型样品，包括但不限于，血液、血清、血浆、血液成分、关节液、尿液、精液、唾液、排泄 物、脑脊液、胃内容物、阴道分泌物、组织匀浆、骨髓抽吸物、骨匀浆、疲、抽吸物、拭子和拭子 冲洗物、其他体液、等等。
[0092] 本发明应用于研究中W及兽医和医疗应用。可W自其获得临床样品的合适的受试 者通常为哺乳动物受试者，但是可W是任何动物。如本文所用的术语"哺乳动物"包括但不 限于，人类、非人类的灵长类、牛、绵羊、山羊、猪、马、猫、狗、兔、晒齿类（例如，大鼠或小鼠） 等。人类受试者包括新生儿、婴儿、未成年人、成人和老龄受试者。可W自其获得样品的受 试者包括但不限于，哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、和鱼类。
[0093] 可W用于试验的非临床样品包括如下物质，其包括但不限于，食品、饮料、药品、化 妆品、水（例如，饮用水、非饮用水、和废水）、海水压载物（seawater ballasts)、空气、± 壤、污水、植物材料（例如，种子、叶、茎、根、花、果实）、血液制品（例如，血小板、血清、血浆、 白细胞成分，等等）、供体器官或组织样品、生物武器化iowarfare)样品等等。本方法还特 别适合实时试验，W监测污染水平、过程控制、质量控制、和工业环境中的其他类似情况。
[0094] 样品的体积应该足够大，W在介质上铺板时产生一个或多个菌落。适当的体积将 依赖于样品的来源和样品中微生物的预期水平。例如，来自感染伤口的临床拭子，应该比待 检测污染程度的饮用水样品具有单位体积更高水平的微生物，所W，与饮用水样品相比，将 需要较小体积的拭子材料。通常，样品大小可W为至少约50ml，例如，100ml、500ml、1000ml 或更多。在其他实施方式中，样品可W少于约50ml，例如，少于约40ml、30ml、20ml、15ml、 10ml、5ml、4ml、3ml、或2ml。在某些实施方式中，样品大小可W为约1ml或更少，例如，约 750 y 1、500 y 1、250 ]il、100iil、50iil、25iil、10iil、5iil、liil、0. 5]il、0. lyl、或更少。 对于样品大小较大的实施方式，样品可W使用本领域技术人员熟知的方法来过滤（例如， 经过过滤膜）和/或浓缩（例如，离屯、、蒸发，等）W减少体积和/或收集样品中的任何微 生物。在过滤膜上收集的微生物可W重悬和置于固体或半固体介质上，或者过滤膜可W直 接置于半固体介质上。
[0095] 待检测的样品被置于合适的介质上，并在有助于微生物生长的条件下解育。可W 基于已知存在于或疑似存在于样品中的微生物的类型来选择介质。对于本领域技术人员来 说，不同微生物的合适的生长介质是已知的。生长介质可W是提供合适营养素和限制微生 物运动（即，提供集中生长）的任何介质。在一些实施方式中，介质可W是半固体介质，例 如，琼脂、明胶、藻酸盐、角叉菜聚糖、或果胶。合适的介质包括具有本领域技术人员所熟知 的不同功能的介质，包括但不限于，通用介质、选择性介质、鉴别性介质、和/或产色介质。 可W选择和/或调整介质，W便可得到有意义的测量结果（例如，IF测量结果）。合适的半 固体介质的例子包括但不限于；AC琼脂，醋酸杆菌琼脂，町晚黄一头抱他晚琼脂，放线菌琼 月旨，放线菌分离琼脂，气单胞菌分离琼脂，厌氧琼脂，厌氧血琼脂，厌氧TVLS琼脂，APT琼脂， Ashby甘露醇琼脂，曲霉分化琼脂，ASS琼脂，金黄色葡萄球菌琼脂，叠氮血琼脂，B. T. B.乳 糖琼脂，杆菌琼脂，贝尔德-帕克琼脂，BiGGY琼脂，胆汁^;：叶巧琼脂，胆汁^;：叶巧叠氮琼脂， 胆盐亮绿淀粉琼脂，亚硫酸饿琼脂，血琼脂，血琼脂SLMB，B化琼脂，脑屯、浸液琼脂，布鲁尔 琼脂，亮绿琼脂，亮绿胆汁琼脂，酪红亮绿乳糖庶糖琼脂，BR0LACIN琼脂，BR0LACIN MUG琼 月旨，布氏琼脂，BSM琼脂，缓冲木炭酵母提取物琼脂，酪蛋白巧琼脂，弯曲杆菌选择性琼脂， 念珠菌IDENT琼脂，酪蛋白酵母儀琼脂，CAS0琼脂，CATC琼脂，蜡样芽抱杆菌选择性琼脂 (Cereus selective agar)，漠化十六烧基S甲锭琼脂，查-斯二氏琼脂，中国藍乳糖琼脂， 厚垣抱子琼脂，克氏巧樣酸盐琼脂，克氏尿素琼脂，巧樣酸盐琼脂，CL邸琼脂，梭菌琼脂，难 辨梭菌琼脂，大肠菌类琼脂，哥伦比亚琼脂，哥伦比亚血琼脂，玉米粉琼脂，蛋白腺酵母玉米 粉琼脂，CPC-琼脂，化amp琼脂，察氏琼脂，D. T. M.琼脂，戴维斯最小琼脂，DCLS琼脂，脱氧 胆酸盐巧樣酸盐琼脂，脱氧核糖核酸酶试验琼脂，DEV远藤琼脂，DEV明胶琼脂，DEV营养 琼脂，葡萄糖酪蛋白腺琼脂，葡萄糖淀粉琼脂，畑L琼脂，孟加拉红琼脂值ichloran rose bengal agar)，白喉毒性琼脂，含甲苯胺的DM酶试验琼脂，大肠杆菌琼脂，大肠杆菌0157 ; H7MUG琼脂，ECC琼脂，ECC选择性琼脂，ECD琼脂，ECD MUG琼脂，EMB琼脂，远藤琼脂，阪崎 肠杆菌琼脂，尿肠球菌琼脂，肠球菌选择性琼脂，走叶巧铁琼脂，艾格琼脂，真菌琼脂，真菌 生物琼脂（化ngobiotic agar),加斯纳琼脂，加斯纳乳糖琼脂，明胶铁培养基，明胶盐琼脂， 病菌计数琼脂，葡萄糖漠甲酪紫琼脂，GSP琼脂，Hektoen肠道琼脂，卡那霉素走叶巧叠氮琼 脂，Karmali弯曲杆菌琼脂，KF-链球菌琼脂，King琼脂，克雷白氏杆菌选择性琼脂，Kligler 琼脂，KRANEP琼脂，Kumlrat琼脂，保加利亚乳杆菌琼脂，乳糖TTC琼脂，LB琼脂，Leifson 琼脂，列文EMB琼脂，李斯特菌琼脂，李斯特菌单确证琼脂（Listeria mono confirmatcxry agar),李斯特菌单鉴别琼脂，李斯特菌选择性琼脂，石蕊乳糖琼脂，化琼脂，LPM琼脂，LS 鉴别琼脂，L - top琼脂，Luria琼脂，赖氨酸精氨酸铁琼脂，赖氨酸铁琼脂，M肠球菌琼脂， M-17琼脂，麦康凯琼脂，含有结晶紫、氯化钢和0. 15 %胆盐的麦康凯琼脂，麦康凯MUG琼脂， 麦康凯山梨醇琼脂，麦芽琼脂，麦芽提取物琼脂，甘露醇盐酪红琼脂，McBride琼脂，McClung To油e琼脂，M-CP琼脂，肉肝琼脂，膜过滤肠球菌选择性琼脂，膜乳糖葡糖巧酸琼脂，M-远 藤琼脂，M-远藤琼脂 LES，MeReSa 琼脂，M-FC 琼脂，Middlebrook 7H10 琼脂，Middlebrook 7化1琼脂，牛奶琼脂，轻型唾液链球菌琼脂曲^13 8311巾31'1118 3肖31〇，匪琼脂，改良缓冲 炭琼脂，M0X琼脂，MRS琼脂，MS. 0157琼脂，M-TEC琼脂，Mueller Hinton琼脂，MUG蛋白腺 大豆琼脂，支原体琼脂，诺布尔琼脂，营养琼脂，营养明胶，OF测试营养琼脂，0GY琼脂，0GYE 琼脂，枯汁琼脂〇3range serum agar),牛津琼脂，PALCAM李斯特菌选择性琼脂，五氯孟加拉 红酵母提取物琼脂（Pentachloro rose bengal yeast agar),蛋白腺酵母提取物琼脂，腺 化牛奶琼脂，产气英膜梭菌琼脂，酪红葡萄糖琼脂，酪红乳糖琼脂，酪红麦芽糖琼脂，酪红庶 糖琼脂，酪红酒石酸盐琼脂，酪献磯酸盐琼脂，苯丙氨酸琼脂，平板计数琼脂，平板计数MUG 琼脂，PLET琼脂，PM指示琼脂，马铃馨葡萄糖琼脂，马铃馨葡萄糖孟加拉红琼脂，马铃馨葡 萄糖庶糖琼脂，Pril?甘露醇琼脂，假单胞菌琼脂，R-2A琼脂，Raka-Ray琼脂，快速肠球菌 琼脂，强化梭菌琼脂，水稻提取物琼脂，Rogosa琼脂，Rogosa化琼脂，孟加拉红琼脂，孟加 拉红氯霉素琼脂，S.F.P.琼脂，萨氏2%葡萄糖琼脂，萨氏4%葡萄糖琼脂，萨氏葡萄糖琼 月旨，具有氯霉素的萨氏葡萄糖琼脂，沙口氏菌琼脂，根据0en6z的沙口氏菌琼脂，沙口氏菌 显色琼脂，SD琼脂，选择琼脂，致病真菌选择性琼脂，SFP琼脂，S -Ga广/LB琼脂，Shapton 琼脂，西蒙斯巧樣酸盐琼脂，脱脂牛奶琼脂，山梨酸琼脂，酒清藍琼脂，SPS琼脂，SS琼脂，1 号标准营养琼脂，葡萄球菌琼脂，链球菌选择性琼脂，嗜热链球菌隔离琼脂，硫酸API琼脂， 亚硫酸铁琼脂，TBX琼脂，TCBS琼脂，TCMG琼脂，Te巧it〇r" -7琼脂，塞耶马了琼脂，热酸 化琼脂（Thermoaci化rans agar), Tinsdale琼脂，番茄汁琼脂，S 了酸甘油醋琼脂，S糖铁 琼脂，膜蛋白酶大豆琼脂（tryptic soy agar),蛋白腺琼脂，蛋白腺葡萄糖提取物琼脂，蛋 白腺葡萄糖酵母提取物琼脂，蛋白腺大豆酵母提取物琼脂，蛋白腺酵母提取物琼脂，膜蛋白 腺琼脂（T巧ptose agar), TSC琼脂，TSN琼脂，通用啤酒琼脂，UTI琼脂，弧菌琼脂，副溶血 性弧菌庶糖琼脂，紫红胆盐琼脂，紫红胆盐葡萄糖琼脂，紫红胆盐乳糖琼脂，紫红胆盐乳糖 葡萄糖琼脂，维生素Bi2培养琼脂，沃格尔-约翰逊琼脂，VRB MUG琼脂，Wi化ins化algren 厌氧琼脂，威尔逊布莱尔琼脂，WL鉴别琼脂，WL营养琼脂，麦芽汁琼脂，XLD琼脂，化T4琼 月旨，酵母琼脂，酵母提取物琼脂，酵母麦芽琼脂，酵母甘露醇琼脂，耶尔森氏菌隔离琼脂，耶 尔森氏菌选择性琼脂，YGC琼脂，YPAD琼脂，YPDG琼脂，YPG琼脂，和YT琼脂。在一个实施 方式中，固体或半固体介质可W进一步包括一种或多种额外的添加剂，所述添加剂增强或 另外增大在固体或半固体介质上的微生物菌落的内巧光（I巧测量结果。可W用来增强内 巧光的适当的添加剂可W包括一种或多种蛋白质水解产物，氨基酸，肉类和蔬菜提取物， 糖源（carbohy化ate sources),缓冲剂，复苏剂，生长因子，酶辅因子，矿物盐，金属补充物 (metal supplements)，还原化合物，馨合剂，光敏化剂，巧灭剂，还原剂，氧化剂，洗漆剂，表 面活性剂，消毒剂，选择剂（selective agents),代谢抑制剂，或其组合。
[0096] 在其他实施方式中，所述介质可W是例如，置于半固体介质的顶部的过滤器（例 如，过滤膜或玻璃纤维过滤器）。在其他实施方式中，该过滤器置于材料（例如，吸收垫） 的上方，该材料暴露（例如，浸溃）于液体介质。在一些实施方式中，样品（例如，大体积样 品）可W穿过过滤器W收集样品中存在的任何微生物。过滤器随后可W置于生长介质的顶 部，并在适宜微生物生长的条件下解育。合适的过滤膜对于本领域技术人员是已知的，并且 包括适于收集微生物和/或能够支持微生物生长的任何膜。膜材料的例子包括但不限于， 纤维素、混合纤维素醋、硝化纤维素、聚氯己締、巧龙、聚四氣己締、聚讽、聚離讽、聚碳酸醋 黑和混合醋黑，包括它们的任何组合。过滤器可W具有适于过滤液体和/或收集微生物的 孔径，例如，对于酵母为约1 y m至约25 y m，W及对于细菌为约0. 05 y m至约2 y m，例如约 0. 2 y m 至约 1 y m。
[0097] 在某些实施方式中，介质可W存在于平板中，例如，标准的微生物琼脂平板。在一 些实施方式中，所述平板可W是多孔平板，每个平板具有，例如，2、4、6、8、12、24、32、48、64、 96、128、或更多的孔，W检测多个样品。该平板可W由任何适合微生物生长的材料制成，例 如，聚苯己締或玻璃。任选地，该平板可W有盖子。如果在盖子盖在平板上的时候进行菌落 的探测，那么盖子和/或平板可W含有可W透过至少部分紫外光、可见光、和/或近红外光 谱的至少一个区域，W容许透过所述盖子和/或平板进行探测。
[009引在本发明的方法中，词组"使样品中存在的微生物在固体或半固体介质上生长"和 "位于介质上的样品"包括W任何方式使得样品与介质相接触，W使样品中存在的微生物能 够生长并产生菌落。在某些实施方式中，样品位于固体或半固体介质的表面。在其他实施 方式中，样品可W与液态的介质相混合，随后使其固化（例如，倾注平板）使得任何生长的 菌落嵌入到介质中。在另一个实施方式中，样品可W与脱水介质混合，使得该介质复水化并 且随后使其固化。
[0099] 在一个实施方式中，固体或半固体介质位于容器的底部，该容器含有悬浮在所述 介质上面的液体中的微生物。随后，该容器可经过处理（例如，离屯、）使得微生物位于介质 上。之后，可W将液体移除，并解育介质使得菌落生长。例如，血液样品可W引入到血液培 养管，该培养管含有液态生长介质和位于底部的固体或半固体介质。该培养管随后经过离 屯、，使得微生物位于固体或半固体介质上（任选地，在红细胞溶解后），移除液体，培养微生 物，根据本发明方法检测、和/或鉴定。
[0100] 一旦样品被放置于介质上（例如，利用标准的微生物学技术在介质上涂布液体样 品，和/或通过在半固体介质上放置过滤膜），在适于样品中存在微生物的生长的条件下， 对该介质进行解育。所述适宜条件被本领域技术人员所熟知，并且依赖于具体的微生物和 介质。可W在约20°C到约50°C的温度下解育介质，例如约25°C到约45°C，例如约37°C。解 育时间要足W出现可检测到的菌落（通过视觉或分光镜），并且依赖于微生物、温度、介质、 营养素水平、和其他决定生长率的条件。在一些实施方式中，解育时间可W约为12小时或 更少，例如，约11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1小时或更少。在某些实施方式中，例如在缓慢 生长条件下或对于缓慢生长的微生物来说（例如，分枝杆菌），解育时间可W约为12小时或 更多，例如，大约18、24、36、48、或72小时或更多。在一些实施方式中，在培养箱中解育介 质，并且从培养箱中移除介质一次或多次，将介质置于一种装置中来检测和/或鉴定任何 在介质上生长的菌落。在其他实施方式中，可W直接在用来检测和/或鉴定菌落的装置中 解育介质，例如，在控温平板支持器（temperature-controlled plate holder)中。
[0101] 一方面，本发明设及在固体或半固体介质上探测微生物菌落，W生成鉴定构成该 菌落的微生物的IF测量结果。在一个实施方式中，可W通过巧光光谱来探测。探测过程 能够W非入侵的方式进行，即，当探测菌落时其可W完整地保留在介质上。在另一个实施 方式中，含有介质和菌落的平板在探测过程自始至终都保持密封（例如，不移动盖子）。根 据该个实施方式，所述平板，或其部分，可W由透光（例如，近红外光（NIR;700nm-14(K)nm) 光谱、紫外光扣V ;190nm-400nm)光谱和/或可见光（VIS ;400nm-700nm)光谱的至少一部 分）的材料组成。合适材料的例子包括但不限于，丙締酸、甲基丙締酸醋、石英、烙凝娃石、 藍宝石、环締姪共聚物（C0C)和/或环締姪聚合物（COP)(例如Zeonex⑩rZeoiiex⑩，San Diego, CA))。能够W非入侵方式检测和/或鉴定微生物，任选地加上在鉴定过程自始至终 保持平板密封，W及某些或全部操作自动化，该些都降低了处理具有或可能具有传染性和/ 或危害性的微生物所带来的风险，还降低了污染样品的风险。此外，能够通过直接探测来鉴 定微生物，而不用进一步处理片状物（pellet)(例如，悬浮和重铺板（replating)和/或其 他鉴定方法），大大增加了可作出鉴定的速度。在其他实施方式中，菌落可W悬浮于溶液中， 并且任选地在探测之前从介质中移除。在另一个实施方式中，在原位探测之后菌落悬浮于 溶液中，随后执行进一步探测。可应用于已分离的微生物而不是介质上的微生物的菌落的 技术，例如，乳胶凝集试验或自动化表型鉴定试验，可W在悬浮的微生物上执行。
[0102] 在一些实施方式中，光谱法可W用于分析微生物的内巧光特性，例如，在缺少额外 的剂时存在于微生物内的特性，该些额外的剂比如，着色剂（stain)、染料、结合剂，等等。 在其他实施方式中，除了分析IF，光谱法还可W用于分析微生物的一个或多个外在特性，例 如，仅仅在有额外的剂的帮助下才能检测的特性。分光镜的探测可W通过本领域技术人员 所知的可W有效检测和/或鉴定微生物的一种或多种内在或外在特性的任何技术来完成。 例如，前面巧光（化ont化ce fluorescence,其中激发光和发射光从同一光学表面进入和 离开，如果样品具有通常的光学厚度，那么激发光穿过非常短的距离进入到样品中（参见， 例如，Eisinger, J.,和 J.FloresZ'Rront-face fluorometry of liquid samples(液体样 品的前面巧光测定），"Anal.Biochem. 94:15(1983))可W用于片状物中微生物的鉴定。其 他形式的测量，例如，落射巧光（epifluorescence)、反射、吸收、和/或散射测量，也可W用 于本发明。
[0103] 在本发明的一个方面，光谱法通过使用聚焦光学部件例如镜头系统或显微镜装置 执行，W容许提供功能性连接到分光光度计（例如，使用纤维光学部件）的紫外、可见光和 红外范围的观测。在一个实施方式中，介质（例如，位于平板内）置于显微镜载物台上，在该 里可w通过激发源探测介质w及可视地观察（例如，通过显微镜）探测介质。在一个实施 方式中，可W通过移动平板本身或移动附着有平板的显微镜载物台手动操作平板来确定菌 落位置W便探测。在另一个实施方式中，显微镜载物台为自动控制的（例如，动力载物台）， W便扫描附着在载物台上的平板（例如，W设计用W覆盖待扫描的整个部分的设置模式）。 在另一个实施方式中，当集中光束例如激光扫描整个介质时，介质保持静止，发射光被成像 或非成像检测器检测。在另一个实施方式中，显微镜可W包括能控制温度（例如，水浴）的 平板培养箱，使得平板可W保持在显微镜下并且在介质解育过程中进行探测。
[0104] 在本发明的一方面，激发源直接对准单个菌落，W生成IF测量结果。探测时，菌落 可W是任何大小，只要足够大W便形成精确的测量结果。在一个实施方式中，当人眼无法 检测时，可W对菌落进行探测。例如，当菌落包括少于约10,000个微生物时，例如，少于约 5000、1000、500、400、300、200、或100个微生物，该菌落可W进行探测。在其他实施方式中， 当菌落直径小于约1000 y m或在其最长尺度上长度小于约1000 y m(如果该菌落不是圆形） 时，该菌落可W进行探测。例如，当菌落为约900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、 或25 ym或更少时，该菌落可W进行探测。在一个实施方式中，激发光束的直径小于待探 测的菌落，使得完整光束可W直接落在菌落上，并且介质基本不会干扰IF测量结果。在某 些实施方式中，激发光束的直径小于约1000 y m，例如，小于约900、800、700、600、500、400、 300、200、100、50、或25^111。激发光束的尺寸，^及发射光束的尺寸是可控的，例如，使用小 孔。在某些实施方式中，激发光束直接落在菌落中屯、。在其他实施方式中，激发光束直接落 在菌落的其他部位（例如，在边缘和/或边缘附近），该部位的微生物与位于菌落中屯、的微 生物相比，可能处于不同的生长和/或新陈代谢状态。在另外的实施方式中，激发光束可W 直接落在菌落内的某一特定深度，例如，使用共聚焦显微镜。
[0105] 菌落的照明源或激发源，可W选自为本领域技术人员所知的任何数量的合适光 源。可W使用能产生可用数据的电磁波谱的任何部分。可W使用能够发射紫外光谱、可见 光谱和/或近红外光谱的光源，W及电磁光谱的其他部分，该些为本领域技术人员所知。例 如，光源可W是连续能谱的灯，比如，生成紫外光的気或氣弧灯和生成可见/近红外激发的 鹤面素灯。如本【技术领域】所熟知，该些光源提供宽广的发射范围，并且针对特殊的激发波长 的光谱带宽可W使用光学干设过滤器、棱镜和/或光栅来减少。
[0106] 可替代的，多数窄带光源，例如发光二极管和/或激光，可W空间多路传输W提供 多波长的激发源。例如，发光二极管在190nm到超过900nm是可用的，该源具有20-40nm的 谱带宽度（半高全宽）。激光在从紫外到近红外的离散波长中是可用的，并可W用于本领域 技术人员熟知的多路方法。
[0107] 任何光源的光谱选择性可W通过利用光谱区分装置来改善，例如扫描单色器。也 可W使用其他的区分方法，如本领域技术人员所熟知的，例如声光可调滤波器、液晶可调滤 波器、光学干设滤波器阵、棱镜摄谱仪，等等，及其任何组合。选择光谱鉴别器要考虑的是 调节范围和选择性水平。举例说明，例如，鉴别器可W使用波长范围300-800nm和选择性 lOnm。该些参数通常决定达到调节范围和选择性而必需的最适宜技术。
[0108] 通常，光源引起样品激发，随后在预设时间点或连续测量从样品发射的巧光。类似 的，可W测量来自激发源和样品的相互作用的反射光，W提供检测和/或表征的有关数据。
[0109] 来自样品的发射可W通过任何合适的光谱区分装置测量，在某些实施方式中使用 分光计。该分光计可w是扫描单色器，其检测特定的发射波长，其中扫描单色器的输出由光 电倍增管检测，和/或该分光计可W被配置成摄谱仪，其中输出由图像检测器阵例如电荷 禪合器件（CCD)检测器阵检测。在一个实施方式中，鉴别器允许通过光电检测装置（例如 光电倍增管、雪崩光电二极管、CCD检测器阵、和/或电子倍增电荷禪合器件（EMCCD)检测 器阵）观察巧光和/或散射信号。
[0110] 分光镜技术用于获得如下测量结果：所述测量结果被优选提供为激发-发射矩阵 巧EM)测量结果。如本文所用，EEM被定义为巧光物质的发光光谱发射强度，是激发波长和 发射波长两者的函数，包括完整光谱或其子集，其中子集可W含有一个或多个激发/发射 对。另外，具有固定激发波长的邸1截面图可W用于显示特定激发波长的发射光谱，具有 固定发射波长的邸1截面图可W用于显示样品的激发光谱。在一个实施方式中，多个 在多于一个的特定激发-发射波长对处被测量，例如，至少在2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、 25、50,或更多特定激发-发射波长对。在某些实施方式中，测量的激发-发射波长对的数 量要足W确定精确的微生物的种，例如，约5至约30对，例如，约10至约20波长对。在其 他实施方式中，测量的激发-发射波长对的数量要足W至少部分地鉴定微生物，例如获得 足够有用的活动信息，例如，足W鉴定如下文所述的分类组的信息。例如，提供有用活动信 息（例如，分类组）的激发-发射波长对的适当数量可W为约2至约8对，例如约3至约5 对。
[0111] 根据本发明，将已知微生物菌落作为对照测量结果，因此允许使用本领域技术人 员所知的各种数学方法，将测量的试验数据与目标微生物的表征相联系。例如，可W使用本 领域技术人员所知的软件系统，将样品数据与基线或对照测量结果进行对比。更具体地， 数据可W通过多种多变量分析方法进行分析，例如，比如广义判别分析（GDA)、偏最小二乘 判别分析（PLSDA)、偏最小二乘回归（PLSR)、主成分分析（PCA)、平行因子分析（PARAFAC)、 神经网络分析（NNA)、和/或支持向量机（SVM)。在设计用于如前所述地监测、检测和/或 表征生物的系统中，该些方法可W用于将未知的目标微生物基于现有的命名法归类成有关 组，和/或基于生物的新陈代谢、病原性和/或毒力归类成天然存在组。
[0112] 在另一个实施方式中，来自检测系统的非分光镜的测量结果，例如检测时间和生 长率，可W用于辅助表征和/或鉴定来自菌落的微生物。另外，源自固体或半固体介质的摄 影图像的测量结果可W提供有价值的关于菌落中微生物表征和/或鉴定的信息，例如，菌 落大小，形状、颜色和密度。
[0113] 在本发明的一些实施方式中，菌落中微生物的表征和/或鉴定不需要包括精确的 种的鉴定。表征包括生物粒子的广泛的分类或分级，W及单一种的实际鉴定。来自菌落的 微生物的分类可W包括微生物表型和/或形态学特征的测定。例如，生物粒子的表征可W 基于可见的差别来完成，例如，组分、形状、大小、群集和/或新陈代谢。在一些实施方式中， 目标生物粒子的分类可W不要求对给定生物粒子的特征的先前了解，而是仅要求与经验的 测量结果相一致的相关性，因此使得该种方法与基于特定结合事件或新陈代谢反应的方法 相比，更加通用和容易适应。如本文所用的，"鉴定"是指确定先前未知的微生物属于哪一 科、属、种和/或菌株。例如，鉴定一种先前未知的微生物到科、属、种和/或菌株级别。
[0114] 在某些例子中，表征包括分类模型，其为将采取的行动提供足够有用的信息。如 本文所用，优选的分类模型包括分成如下一个或多个组；（1)革兰氏组；（2)临床革兰氏组； 做治疗组；（4)功能组郝妨天然内巧光组。
[0115] (1)垄兰反IL;在革兰氏组分类中，基于微生物的革兰氏染色反应及其总尺寸，可 W将微生物分为3个广泛的分类类别，所述组选自如下的一个或多个；(a)革兰氏阳性微生 物，其革兰氏染色呈深藍色；化）革兰氏阴性微生物，其革兰氏染色呈红色；和（C)酵母细 胞，其革兰氏染色呈深藍色，但酵母细胞是非常大的圆形细胞，通过其形态学特征和大小可 W和细菌区别开。
[0116] (2)临巧革兰氏组：革兰氏组可W讲一巧分成若干个代表形杰学特征差异的亚 类。该些亚类包括由具有经验的实验室技术人员报道的所有相关的临床信息，由此，与阳性 或阴性革兰氏反应相比，提供了更高水平的鉴定。该个特定的分类非常有帮助，因为其通过 使用自动系统提供等效的临床相关信息排除了关于依赖革兰氏染色的质量和/或技术人 员读取涂片的技术水平的许多忧虑。更特别的，基于该种分类模型的微生物亚类可W选自 如下的一种或多种；(a)球菌，其为小圆细胞；化）双球菌，其为两个彼此连接的小圆细胞； (C)杆状菌，其为矩形形状；和（d)杆菌，其为杆状。可W通过附加的形态学信息而确定的 该些亚类的例子包括；（i)革兰氏阳性球菌；（ii)革兰氏阳性链状球菌；（iii)革兰氏阳性 簇状球菌群集（即，"葡萄样"簇（cluster)) ; (iv)革兰氏阳性双球菌；(V)革兰氏阳性杆状 菌；(Vi)革兰氏阳性的具有内生抱子的杆状菌；(vii)革兰氏阴性杆状菌；(viii)革兰氏 阴性球杆菌；（ix)革兰氏阴性双球菌；(X)酵母；和（xi)丝状真菌。
[0117] (3)治疗组；治疗组包括多个微生物的种，当从特定样本类型中分离时，该些种 用相同类别的抗生素或抗生素混合物治疗（参考；"San化rd Guide to Antimicrobial 化erapy 2008 (桑福德抗微生物治疗指南2008)")。在许多情况下，临床医生不需要种级别 的身份来使得最初的经验疗法能够变为更有针对性的疗法，因为超过一个种可W用相同的 抗生素选择来治疗。该个分类等级正确地把该些"相同-治疗"微生物分到一个治疗类别 中。该种表征水平的例子包括，把高度耐药的肠杆菌科巧B)的种和敏感的邸的种（来自 大肠杆菌的肠杆菌属菌巧nterobacter spp.))区分，或把耐-氣康挫的念珠菌属的种（光 滑念珠菌杞gl油rata)和克鲁斯念珠菌杞kruzei))和敏感的念珠菌属的种（白色念珠 菌（C. a化icans)和近平滑念珠菌（C. parapsilosis))区分开，等等。
[011引 (4)功能组：巧据本发巧，微牛物还可W基于新陈代谢、毒力、和/或表巧特征的混 合而分成若干个组。非发酵微生物可W清楚地与发酵微生物区分。此外，产生溶血素的微 生物种可W与非溶血性的种分别分组。在某些情况下，该些组代表着比属级别更大的类别 (例如，大肠杆菌类，革兰氏阴性非发酵类杆状菌），处于属级别的某些类别（例如，肠球菌 属、念珠菌属），更接近种级别的区别的某些类别（例如，凝固酶阴性葡萄球菌、a-溶血性 链球菌、0 -溶血性链球菌、凝固酶阳性葡萄球菌即金黄色葡萄球菌）。
[0119] (5)天然内巧光（"IF")组；还可W基于微牛物聚成一组的自然趋執按照其固 有的和/或内在的巧光特征来对微生物进行分类。某些组可能为治疗组和功能组类别所 共有。该些分组可W包括具有特征性IF谱貌（signature)的单个的种，例如，粪肠球菌 巧.faecali)、化脈性链球菌（S. pyogenes)或铜绿假单胞菌化aeruginosa)，和/或可W含 有具有相对保守的IF谱貌的生物小组，例如大肠杆菌、产酸克雷白氏杆菌化oxytoca)或 产气肠杆菌化aerogenes)和弗氏巧樣酸杆菌（C.化eundii)组。
[0120] 除了为鉴定目的测量微生物内在特性（例如，内巧光）W外，本发明方法可W进一 步包括使用添加的鉴定剂（identifier agent)来辅助鉴定过程。结合特定微生物的试剂， 例如亲和配体，可W用于分离微生物，W鉴定微生物的类别或种（例如，通过结合到独特的 表面蛋白或受体），和/或鉴定微生物的特性（例如，抗生素耐药性）。有用的鉴定剂包括 但不限于，单克隆抗体和多克隆抗体及其片段（例如，鉴定金黄色葡萄球菌的抗-Eap)、核 酸探针、抗生素（例如，盘巧西林、万古霉素、多粘菌素B)、适体、肤模拟物、瞻菌体来源的结 合蛋白、凝集素、宿主先天免疫生物标志物（急性期蛋白、li^S结合蛋白、CD14、甘露糖结合 凝集素、Toll样受体）、宿主防御肤（例如，防御素、cathelicidin、proteogrin、爪赡抗菌 肤）、细菌素（例如，硫離抗生素（lantibiotic)比如，乳酸链球菌肤、mersacidin、表皮素、 gallidermin和植物乳杆菌素C和II类肤）、瞻菌体化及核酸、脂质、碳水化合物、多糖、英 膜/粘质或蛋白的选择性巧光染料，包括其任何组合。如果试剂本身没有可检测信号，那么 试剂可W被标记W提供可检测信号，例如通过将试剂辆合到标记物上（例如，可见的或巧 光的标记物）。标记物包括但不限于，巧光的、发光的、发磯光的、放射性的、和/或比色的化 合物。所述试剂可W在本发明方法的任何步骤加入到微生物中，例如，当样品位于介质上时 和/或当菌落被检测完后。在某些实施方式中，所述试剂在菌落中的存在和/或数量可W 在探测菌落过程中来测定。其他有用的鉴定剂包括，微生物酶的底物、馨合剂、洗漆剂、表面 活性剂、消毒剂（例如，酒精、漂白剂、过氧化氨）和有毒化合物（例如，叠氮化钢、氯化钟） 和代谢抑制剂例如环己酷胺、等等。类似地，许多用于测量微生物细胞活力、新陈代谢和/ 或膜电位的巧光化合物，可W用作本发明的鉴定剂。
[0121] 在在本发明的一个方面，该方法进一步包括从菌落中回收微生物W及执行附加试 验的步骤。回收的微生物可W悬浮于适当的介质中，例如，盐水。一旦悬浮，微生物可W进 行任何需要的进一步试验，如本领域技术人员所知和上文所述的。特别的，任何要求洁净 微生物样品的试验可W用悬浮的微生物执行。在某些实施方式中，可W执行附加的鉴定和 /或表征试验。鉴定试验的例子包括Vitek 2,扩增的和非扩增的核酸试验（NAT)，产色和 乳胶凝集测定，免疫测定（例如，使用标记的一抗或二抗和/或其他配体），质谱法（例如， MLDI-T0F质谱法）和/或其他光学技术，例如红外光谱（FTIR)或拉曼光谱。也可W执行 附加的表征试验，例如耐药性、抗菌谱、和/或毒力因子。附加的表征可W是在本方法起始 鉴定步骤中启动的试验的一部分。例如，耐受甲氧西林的金黄色葡萄球菌的检测可W通过 在菌落生长之前向样品中添加巧光标记的盘巧西林来启动。结合的盘巧西林的存在和/或 数量可W随后测定，例如，在菌落中或在从菌落回收的微生物中。在某些实施方式中，一个 或多个附加试验可W在与进行鉴定步骤相同的系统中执行，例如，在相同的装置中。在一个 实施方式中，特定的附加试验可W基于所作的鉴定选自许多可用的试验。
[0122] 在本发明的一个方面，某些或全部的方法步骤可W实现自动化。如本文所用，术语 "自动化"是指计算机控制。在一个实施方式中，不同的巧光发射检测和相关步骤是自动化 的，并且由该方法获得的结果信息自动化地用于填充数据库。在进一步的实施方式中，该方 法的其他步骤，例如菌落的检测和/或探测，也可W自动化。实现该方法步骤的自动化不仅 允许更多样品进行更快速的试验，而且减低了处理可能含有有害的和/或有传染性的微生 物的样品时人为误差所带来的风险W及减低了污染样品和/或将操作者暴露于样品的机 会。在一个实施方式中，本发明设及用于在固体或半固体介质上检测和/或鉴定微生物的 系统，该系统包括分光光度计和聚焦光学部件，例如镜头系统或显微镜。在其他实施方式 中，该系统进一步包括用于扫描介质表面的机械装置，和/或用于控制介质的环境（例如， 解育介质的环境）的机械装置。
[0123] 本发明的一方面设及在固体或半固体介质上检测菌落。任选地，检测之后是鉴定 /表征菌落中的微生物。在一个实施方式中，对放置样品的介质进行手动扫描W确定菌落 的存在。在一个实施方式中，可W用肉眼对菌落进行视觉上的检测。在其他实施方式中，可 W使用显微镜对菌落进行检测。例如，可W在显微镜下观察介质，同时在显微镜物镜下用手 移动位于显微镜载物台上的介质W扫描介质部分，来确定菌落的存在。介质的移动可W通 过操作介质本身（例如，移动含有介质的平板）或者移动载有介质的显微镜载物台来实现。 在其他实施方式中，自动进行扫描。在一个实施方式中，动力显微镜载物台可W按照程序在 物镜下W跨介质表面的捜索模式移动介质，W至介质的各个部分可W依次被观察到。在另 一个实施方式中，当集中光束例如激光扫描介质并且发射出的光被成像或非成像检测器检 测时，介质保持静止。在一个实施方式中，介质可W分割为对应激发光束的尺度的相等的部 分（例如，约100、250、500、或1000 ^1112或更多），显微镜载物台可^被逐步推进，使得每个 部分位于物镜下W便探测。在另一个实施方式中，可W在大范围菌落内观察介质（例如，整 个平板或其大部分（例如，一半、=分之一、四分之一、十分之一或更小））。在任一个实施方 式中，基于从介质扫描创建的地图，可W对菌落的位置进行测定。在一个实施方式中，显微 镜载物台可W程控为依次移动到每个检测的菌落上，获得每个菌落的IF光谱。在一个实施 方式中，手动或自动的扫描可W按照固定的间隔进行重复（例如，每0. 5、1、2、3、4、5、6、8、 10或12小时或更多）W监测菌落的出现和/或生长。在本发明的一个实施方式中，可W使 用可见光扫描介质来监测菌落，例如，尺寸大到足W在显微镜下可看见的菌落。在另一个实 施方式中，照射介质W使得检测菌落的内在特性（例如，I巧。超过介质本底水平的IF峰表 明了菌落的存在。例如，介质的巧光地图可W通过比如使用扫描激发光束（例如激光）和 单一的、非成像检测器来构建。在另一个实施方式中，使用图像捕获/采集装置（例如，照 相机或扫描仪，比如CCD线阵扫描仪、CCD线扫描照相机、CCD 2D列阵照相机、激光扫描照相 机或其他装置）的大面积成像可^如胖003/022999和美国专利号5,912，115、6，153,400、和 6, 251，624所描述的使用。
[0124] 在本发明的某些实施方式中，所述检测方法还可W用于检测样品中微生物的存 在，包括或不包括待检测微生物的鉴定。在某些实施方式中，检测方法可W用于监测样品的 微生物污染，例如，食品、药品、饮用水，等等。在一个实施方式中，该方法可W重复的方式执 行，W持续监测污染，例如，每月一次、每周一次、每天一次、每小时一次、或任何其他时间类 型。在另一个实施方式中，样品可W按照需要进行试验，例如，当怀疑污染或需要证实污染 不存在的时候。在进一步的实施方式中，检测方法可W用于寻找在临床样品中微生物的存 化例如，从伤口或血液培养物中。例如，样品可W在特定时间点从血液培养物中移出，并且 在样品上执行该检测方法，W确定是否血液培养物呈阳性。在一个实施方式中，可W在培 养物解育之后的规定的时间点采集样品，例如解育后24小时，W测定血液培养物是否呈阳 性。在另一个实施方式中，样品可W有规律地从血液培养物中采集，例如，每12、6、4、2、1或 0. 5小时，W在可检测阳性的短时间内鉴定阳性血液培养物。在检测方法的某些实施方式 中，检测步骤后面可W任选地跟随本文所述的鉴定/表征方法。在其他实施方式中，检测方 法部分地或全部地为自动化，特别是对于包括重复监测样品的实施方式。
[0125] 在某些实施方式中，本发明的方法可W对动物或植物细胞进行，而不是微生物。特 别的，可W使用本文公开的技术检测、监测、表征、和/或鉴定能够W集落、丛集（clump)或 其他=维结构生长或在=维基质上生长的动物细胞（例如，哺乳动物、鸟类、昆虫的细胞） 或植物细胞。W =维集落生长的适合的细胞的例子包括但不限于，干细胞、成纤维细胞、和 寶生细胞。
[01%] 本发明在下述实施例中进一步详述，该些实施例通过举例说明方式提供，而不是 用来W任何方式限制本发明。利用了本领域所熟知的标准技术或者W下具体描述的技术。 实施例
[0127] 实施例1.从平板和膜上的菌落获得光谱
[0128] 进行试验，W测定是否可W在具有或不具有黑膜的血琼脂平板炬AP ;具有5%绵 羊血的膜蛋白酶大豆琼脂）上直接获得菌落的有用的光谱（表1)。大肠杆菌巧0、金黄 色葡萄球菌（SA)、粪肠球菌巧巧、和铜绿假单胞菌（PA)的菌落如表2所示进行生长，通过 借助光纤适配器禪合到Fluorolog3光谱仪（Horiba Jobin Yvon，Edison NJ)和PMT检 测器的UV显微镜（10X物镜）进行采集光谱。通过W下采集ffiM;激发波长范围巧X)= 260-550皿，和发射波长范围（Em) = 280-600皿，每5皿具有狭缝宽度=5皿。在标明的 地方，通过在发射路径上放置1mm的小孔，使得探测区域变窄，该导致观察到的区域约为 0.1mm。没有该小孔时，投射在菌落上的激发圈和发射圈的直径等于约1mm。包含在每个试 验运行中的样品显示在表2中。
[0129] 表 1
[0130]
【权利要求】
1. 一种在固体或半固体生长介质上表征和/或鉴定微生物的方法，该方法包括： (a) 在固体或半固体生长介质上探测一个或多个菌落，以生成所述菌落中微生物特有 的内荧光（IF)测量结果；和 (b) 基于内荧光（IF)测量结果表征和/或鉴定所述菌落中的微生物。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述菌落是具有小于50 y m的直径的微菌落。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中，在探测步骤（a)之前，使已知含有或疑似含有微 生物的样品在所述固体或半固体生长介质上生长，以生成至少一个菌落。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述探测步骤是非侵入性的。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物被表征到一个或多个分类模型，所述 分类模型选自由革兰氏组、临床革兰氏组、治疗组、功能组、和天然内荧光组组成的组。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物被鉴定到属级别、种级别、或菌株级 别。
7. 根据权利要求1所述的方法，其中所述IF测量结果通过光谱法产生，并且所述光谱 法包括测定激发一发射矩阵（EEM)。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中将所述EHM与已知微生物的EHM的数据库相比较。
9. 根据权利要求7所述的方法，其中所述EEM包括至少2个不同的波长对。
10. 根据权利要求7所述的方法，其中所述EEM使用多变量分析进行比较。
11. 根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括添加鉴定剂到所述固体或半固体生 长介质或样品中，并且其中所述鉴定部分地基于所述鉴定剂在所述菌落或从所述菌落回收 的微生物中的存在和/或数量。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述鉴定剂是亲和配体、抗体或其片段、核酸探 针、抗生素、适体、肽模拟物、噬菌体来源的结合蛋白、凝集素、宿主防御肽、细菌素、噬菌体、 染料，或其任何组合。
13. 根据权利要求1所述的方法，其中所述固体或半固体生长介质包括一种或多种对 所述微生物的生长有用的营养素以及一种或多种添加剂，其中所述一种或多种添加剂增强 在所述固体或半固体生长介质上的所述微生物菌落的所述内荧光测量结果。
14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述一种或多种添加剂选自由以下组成的组： 蛋白质水解产物、氨基酸、肉类和蔬菜提取物、糖源、缓冲剂、复苏剂、生长因子、酶辅因子、 矿物盐、金属补充物、螯合剂、光敏化剂、猝灭剂、还原剂、氧化剂、洗涤剂、表面活性剂、消毒 剂、选择剂和代谢抑制剂。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述还原剂是还原化合物。
16. 根据权利要求1所述的方法，其中探测菌落包括测量落射荧光。
17. 根据权利要求1所述的方法，其中探测菌落包括测量反射光。
18. -种检测样品中微生物的存在的方法，该方法包括： (a) 获得已知含有或可能含有微生物的样品； (b) 使样品中存在的任何微生物在固体或半固体生长介质上生长；和 (c) 通过对所述固体或半固体生长介质进行逐点扫描以生成内荧光（IF)测量结果，定 位存在于所述固体或半固体生长介质上的任何菌落； 其中，按生成的测量结果所定位的一个或多个菌落的存在表明在样品中存在微生物。
19. 根据权利要求18所述的方法，其中所述IF测量结果通过光谱法产生，并且所述光 谱法包括测定激发一发射矩阵（EEM)。
20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述EEM包括至少2个不同的波长对。
【文档编号】G01N21/64GK104502317SQ201410809237
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2009年12月15日 优先权日:2008年12月16日
【发明者】约翰·沃尔什, 琼斯·海曼, 瑟曼·索普 申请人:生物梅里埃有限公司