抗ACTL7a和GAPDH-2抗体的检测方法、试剂盒及其用途与流程

文档序号:11824623阅读:441来源:国知局
本发明涉及检测受试者血清中抗ACTL7a和GAPDH-2抗体的方法和试剂盒。具体地,本发明涉及用ELISA方法检测血清中的抗ACTL7a和GAPDH-2抗体的水平以及试剂盒。另一方面,本发明涉及抗ACTL7a和GAPDH-2抗体的检测在诊断免疫性不孕症中的用途。
背景技术
:精子表面存在一些独特的、细胞特异的蛋白质,其可产生免疫原性。一些分子刺激机体的免疫反应产生抗体后可能会导致阻断精子穿透卵膜和受精,并可能导致免疫性不孕。抗精子蛋白抗体既在男性,也在女性体内发现,并且在不孕夫妇中的发现率很高,高达9-12.8%。目前检测抗精子蛋白抗体的方法很多,临床上用于检测抗精子蛋白抗体的定性检测即精子凝集试验可以鉴定出血清中是否含有抗精子抗体,从而判断不孕者血清中是否含有抗精子抗体,进而帮助医生判断不孕的原因,一般临床上精子凝集实验的血清稀释度在1:8以上依然发生凝集时需要引起重视,采用必要的治疗手段。但此方法需要志愿者提供新鲜的活力正常的精子,很多医院不愿意采用此方法。对免疫性不孕的检测各家医院采取的方法不同,没有相对统一的检测指标,检测的结果对于医生没有很好的参考价值。有专家指出现有的检测手段多是以精子总蛋白或膜蛋白为靶目标进行检测,而总蛋白或是膜蛋白中有很多体细胞蛋白,没有很好的特异性。因此,需要选择特异性高的精子特异表达的蛋白进行靶目标进行检测。本发明人发现了两种精子特异表达的蛋白质ACTL7a和GAPDH-2,在发明人先前的研究中已证明其是精子特异表达的蛋白质。在本发明中,发明人令人惊奇地发现这两种蛋白质容易产生抗精子抗体,适于作为免疫性不孕的靶目标进行检测。技术实现要素:本发明人通过原核表达纯化获得了用于抗原包被的ACTL7a和GAPDH-2蛋白。并通过ELISA方法实现了高灵敏度、高特异性的抗ACTL7a和GAPDH-2抗体的检测。一方面,本发明涉及一种用于检测受试者血清中抗ACTL7a抗体水平的ELISA方法,所述方法包括以下步骤:a)从受试者获得待测血清样本;b)用纯化的ACTL7a抗原包被平板;c)将以1:1000稀释的步骤a)获得的血清样本加入步骤b)的平板中,过夜孵育;d)向步骤c)的每孔中加入辣根过氧化物酶标记的抗体,孵育;e)测定步骤b)的抗体浓度。根据本发明所述的方法,其中进一步包括制备标准拟合曲线的步骤。另一方面,本发明涉及一种用于检测受试者血清中抗GAPDH-2抗体水平的ELISA方法,所述方法包括以下步骤:a)从受试者获得待测血清样本;b)用纯化的GAPDH-2抗原包被平板;c)将以1:1000稀释的步骤a)获得的血清样本加入步骤b)的平板中,过夜孵育;d)向步骤c)的每孔中加入辣根过氧化物酶标记的抗体,孵育;e)测定步骤b)的抗体浓度。根据本发明所述的方法,其中进一步包括制备标准拟合曲线的步骤。另一方面,本发明涉及用于检测抗ACTL7a抗体水平的ELISA试剂盒,所述试剂盒包括纯化的ACTL7a抗原包被的平板。另一方面,本发明涉及用于检测抗GAPDH-2抗体水平的ELISA试剂盒,所述试剂盒包括纯化的GAPDH-2抗原包被的平板。另一方面,本发明涉及一种精子特异性抗原在制备用于诊断免疫性不孕症的试剂盒中的用途,所述精子特异性抗原选自ACTL7a和GAPDH-2。另一方面,本发明涉及一种用于诊断免疫性不孕症的试剂盒,所述试剂盒包含纯化的ACTL7a抗原包被的平板和/或纯化的GAPDH-2抗原包被的平板。附图说明图1显示ACTL7a的标准拟合曲线。图2显示GAPDH-2的标准拟合曲线。具体实施方式ELISA方法大致为抗原包被、一抗反应(血清中的抗体或标准曲线中的抗体)、酶标二抗反应、底物显色等几个主要步骤。具体步骤如下:1)抗原包被:用0.1M碳酸包被缓冲液将纯化的精子抗原ACTL7a或者GAPDH-2稀释至200ng/100μl(两种抗原分别包被)。所述精子抗原由细菌原核诱导表达的方法纯化;其中,ACTL7a的纯化方式同文献:人精子肌动蛋白样蛋白7a蛋白在大肠杆菌系统的表达纯化及多克隆抗体制备,细胞与分子免疫学杂志,2013,29(5),507-510);GAPDH-2的纯化方式同文献:主动免疫肌动蛋白样蛋白7a蛋白引起小鼠睾丸曲细精管的损伤,中国医学科学院学报,2013,35(6),595-600)中ACTL7a-his融合蛋白的诱导表达及纯化。在酶标板中每孔加入100μl,4℃过夜,或37℃4h,将平板中液体倾尽,用PBS-T(磷酸缓冲液,新鲜加入0.05%Tween-20)洗涤三次;2)封闭:每孔加入1%BSA200μl(PBS-T配),室温30分钟。用PBS-T洗涤三次;3)一抗反应:将待检血清用生理盐水(或PBS)以1:1000比例稀释;同时分别加入0,0.125,0.25,0.5,0.75,1,1.5,2,单位为*10-4g/L浓度的兔抗ACTL7a或者GAPDH-2抗体(加入的标准曲线的抗体与包被的抗原对应);100μl/孔,4℃过夜,PBS-T洗三次;4)二抗反应:每孔中加入100μl用PBS-T以1:500稀释的辣根过氧化物酶标记的抗体(IgG-HRP,抗体购自Thermoscientific,货号21230),37℃保温2h。PBS-T洗涤三次;5)显色反应与测定光密度:每孔中加入底物邻苯二胺100μl,室温孵育3-10min。加入50μl2MHCl终止反应。用酶标仪测波长490nm处光密度值并按照标准曲线计算血清样品中的抗体浓度。溶液组成:1、包被用抗原:ACTL7a和GAPDH-2浓度一般在1-10mg/ml浓度,每个批次浓度不同,依照浓度使用;2、PBS-T(pH7.4):NaCl8.0g,Na2HPO4·12H2O2.9g,KH2PO40.2g,Tween-200.5ml,加去离子水至1000ml;3、0.1M碳酸包被缓冲液(pH9.6):储备A液0.2M:21.2gNa2CO3加去离子水到1000ml,储备B液0.2M:16.8gNaHCO3加去离子水到1000ml,将80ml(A)+170ml(B)+250ml去离子水混合,即为所需溶液。4、底物用磷酸-柠檬酸缓冲液(pH5.0):A液:柠檬酸(无水)1.92g加去离子水到100ml,B液:Na2HPO4·12H2O7.16g加去离子水到100ml,取2.43ml(A)+2.57ml(B)+5ml去离子水混合即为所需溶液,新鲜配制:30%H2O215μl+邻苯二胺4mg+9.985ml磷酸-柠檬酸缓冲液。5、封闭液:用PBS-T配制的1%BSA。实施例1、ACTL7a的标准曲线的拟合如表1所示,在EXCEL第一行依次输入标准曲线测得的OD值,第二行对应输入标准曲线的浓度,如0,0.125,0.25,0.5,0.75,1,1.5,2。表1:OD值00.10980.28640.60330.79591.18411.65302.2497浓度00.1250.250.50.7511.52以散点图作图拟合曲线,得到y=ax+b的公式及R2值。一般R2接近于1,一般为0.97-0.99,最低不应低于0.95。拟合结果见图1,其中y=0.8881*x+0.0017,R2=0.9978。R2=0.9978说明曲线拟合成功,通过拟合公式可以计算待测血清中抗精子抗体的浓度。拟合公式结果是a=0.8881,b=0.0017。将血清测得的OD值,如1.9372代入公式,得到的结果是1.7221。标准曲线的单位是10-4g/L,因此检测血清的浓度为1.7221*10-4g/L。血清稀释比例为1:1000,最后得到的结果是血清中含有抗ACTL7a抗体浓度为1.7221*10-1g/L。实施例2、GAPDH-2的标准曲线的拟合在EXCEL第一行依次输入标准曲线测得的OD值,第二行对应输入标准曲线的浓度,如0,0.125,0.25,0.5,0.75,1,1.5,2。如表2所示,在EXCEL第一行依次输入标准曲线测得的OD值,第二行对应输入标准曲线的浓度,如0,0.125,0.25,0.5,0.75,1,1.5,2。表2:OD值00.09720.24300.57790.79110.95151.52032.0462浓度00.1250.250.50.7511.52以散点图作图拟合曲线,见图2,其中y=ax+b的公式及R2值,一般R2接近于1,一般为0.97-0.99,最低不应低于0.95。拟合结果是y=0.9797*x+0.003,R2=0.9969。R2=0.9969说明曲线拟合成功,通过拟合公式可以计算待测血清中抗精子抗体的浓度。拟合公式结果是a=0.9797,b=0.003,将血清测得的OD值,如1.3924代入公式,得到的结果是1.3672,标准曲线的单位是10-4g/L,因此检测血清的浓度为1.3672*10-4g/L。血清稀释比例为1:1000,最后得到的结果是血清中含有抗GAPDH-2抗体浓度为1.3672*10-1g/L。实施例3、免疫性不孕血清检测按照前面所叙述的方法,将收集的每例血清进行检测和计算。共收集可孕对照血清237份;免疫性不孕血清是经精子凝集实验检测阳性的血清,其中稀释比例小于等于1:8,图中标记为不孕(≤1:8)的共58份;稀释比例大于1:8的,图中标记为不孕(>1:8)的共117份。3.1、血清中抗ACTL7a抗体的检测三组检测结果得到的平均值(Mean)和标准误(SEM)分别如表3所示:表3:组名数量(n)平均值(*10-1g/L)SEM(*10-1g/L)可孕对照2370.22000.007242不孕(≤1:8)580.43180.02707不孕(>1:8)1171.5070.1304分别对三组间进行统计检验,发现可孕对照组分别与不孕(≤1:8)组和不孕(>1:8)组之间,以及不孕(≤1:8)组与不孕(>1:8)组之间的统计结果均为P<0.0001,一般标记为三个星号“***”,即有显著差异。统计结果说明ACTL7a可以很好的作为抗精子抗体检测的靶目标,并且随着抗精子抗体滴度的增加,抗ACTL7a的抗体浓度也明显增加。3.2、血清中抗GAPDH-2抗体的检测三组检测结果得到的平均值(Mean)和标准误(SEM)分别如表4所示:表4:组名数量(n)平均值(*10-1g/L)SEM(*10-1g/L)可孕对照2370.21470.005737不孕(≤1:8)580.40570.01460不孕(>1:8)1171.2560.1031分别对三组间进行统计检验,发现可孕对照组分别与不孕(≤1:8)组和不孕(>1:8)组之间,以及不孕(≤1:8)组与不孕(>1:8)组之间的统计结果均为P<0.0001,一般标记为三个星号“***”,即有显著差异。统计结果说明GAPDH-2可以很好的作为抗精子抗体检测的靶目标,并且随着抗精子抗体滴度的增加,抗GAPDH-2的抗体浓度也明显增加。3.3、根据ELISA法检测的抗ACTL7a抗体水平和抗GAPDH-2抗体水平确定不孕原因受试者工作特征曲线即ROC曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve)评价用于判断检测方法的敏感性和特异性。将可孕组与不孕组[不孕(≤8)组和不孕(>8)组合并]进行ROC分析,找到敏感性和特异性最佳的点对应的抗体浓度值,大于此值的设定为阳性即“+”;将两组不孕组不孕(≤8)组和不孕(>8)组进行ROC分析,找到敏感性和特异性最佳的点对应的抗体浓度值,大于此值的设定为强阳性“++”。通过分析得到的ACTL7a和GAPDH-2抗体浓度临界值即“+”和“++”列表如下表5:表5:分别对三组阳性结果进行统计,ACTL7a抗体在各组中阳性及强阳性病例的个数和比例如下表6:表6:GAPDH-2抗体在各组中阳性和强阳性病例的个数和比例如下表7:表7:三组样本ACTL7a抗体和GAPDH-2抗体单阳性(+/-或-/+)和双阳性(+/+)以及单强阳性(++/+或+/++)和双强阳性(++/++)病例的个数和比例如下表8:表8:由以上结果可见GAPDH-2抗体的敏感性相对高,在不孕人群中相对多的被检测出阳性病例;ACTL7a抗体检测的特异性相对强,ACTL7a抗体的阳性病例基本被包含于双阳性病例中。随着抗精子抗体浓度增加,ACTL7a抗体和GAPDH-2抗体双阳性的病例比例也明显增加[由可育组的6.33%,不孕(≤8)组的58.62%增加至不孕(>8)组的80.34%]。特别注意的是,ACTL7a抗体和GAPDH-2抗体双强阳性的病例仅存在于不孕(>8)组即抗精子抗体滴度较高组中。提示,结合两种抗精子抗体检测结果更有利于临床对不孕者病因的判断并选择合适的治疗手段。以上结果表明,本文中所述的ELISA方法可特异地且敏感地检测受试者血清中的抗ACTL7a抗体水平和抗GAPDH-2抗体水平,结合所检测的抗体水平,可以灵敏且特异地判断受试者的不孕原因。当前第1页1 2 3 
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