小球藻功能成分CPE的高通量筛选系统、筛选方法及其制备方法与流程

本发明属于小球藻功能成分CPE筛选、制备提取技术领域，特别涉及一种小球藻功能成分CPE的高通量筛选系统、筛选方法，以及基于高压破壁法制备小球藻功能成分CPE的方法。

背景技术：

微藻由于具有生长周期短、生物质产率高、二氧化碳固定能力强、单位土地生产效率高且不与粮争地等优势，正逐渐超越传统能源作物，成为第三代新一代生物能源。虽然目前微藻能源的产业化研究已经进入中试阶段，但仍困难重重，其中最主要的问题是成本高。

小球藻(Chlorella)，俗称绿藻，是国内外大力发展和培育的微藻能源与微藻固碳这一战略性新兴产业的主要藻种之一。小球藻本身是一种营养丰富又安全的食物，在免疫调节等许多方面具有功效。因此，若从提取油脂后的藻渣中能提取到具有免疫调节等多种功效的高附加值产品，则会大幅降低以小球藻为藻种的微藻能源的生产成本，进一步推动微藻能源产业化的进程。

小球藻中含有多种活性物质，如多糖、糖蛋白、氨基酸和多肽等，具有广泛的生物活性，如抗肿瘤、促进有益菌生长、增强免疫、解毒、降血压等。国内外关于小球藻热水提取物的应用研究较多，研究主要集中在免疫活性的研究及通过免疫活性介导的抗肿瘤活性。蛋白核小球藻热水提取物(Hot water extract of Chlorella pyrenoidosa，CPE)主要是水溶性物质的混合物，包括核酸、多糖、多肽、蛋白、水溶性维生素等。由于CPE在小球藻中含量丰富，对于开发免疫类保健品更有价值。

Hidaka发现CPE可以提高营养不良小鼠的免疫能力，建议把小球藻作为功能食品。Yamagishi等发现小球藻可以治疗糖代谢失调的疾病，具有治疗糖尿病等人类疾病的潜在价值。但在CPE的众多成分中究竟哪些成分具有促进动物生长和提高免疫力功能的研究方面至今仍然是一个空白，因此进一步研究确定CPE中的有效成分组成、结构和作用机理不仅具有基础研究意义，而且具有广泛的应用价值。

目前，小球藻与螺旋藻、盐藻等微藻的开发利用构成了我国食品领域的一个重要分支，具有广阔的前景。小球藻粉蛋白质含量很高，是优良的单细胞蛋白源，其中含有的小球藻糖蛋白大量存在于藻粉蛋白生产的废水之中，若采用适当的手段将其分离提取，将产生显 著的经济效益和社会效益。

目前CPE提取方法种类繁多，造成了产物活性差异大，难以确定主组分等情况。因此在开发小球藻高附加值产品前，必须对众多CPE提取方法进行比较，从中筛选出一种适于工业化生产的方法。例如，由于坚韧细胞壁的存在，从小球藻中提取有效成分存在着是否破壁的问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种小球藻功能成分CPE的高通量筛选系统、筛选方法及其制备方法。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

本发明的第一目的在于提供一种小球藻功能成分CPE的高通量筛选系统，包括：

1)抗氧化测试：采用Griess试剂进行测试，通过分光光度法检测样品的总抗氧化能力和对自由基的清除作用；

2)细胞免疫调节测试：

a.四噻唑蓝MTT法检测组分对小鼠巨噬细胞Ana-1存活率的影响；

b.中性红NR染色法检测组分对Ana-1吞噬功能的影响；

c.荧光探针法检测样品对Ana-1细胞内NO分泌的改变；

3)氧化还原金属离子螯合测试：

a.采用菲洛嗪作为Fe²⁺螯合试剂，通过分光光度法检测样品的Fe²⁺螯合能力；

b.采用邻苯二酚紫作为Cu²⁺螯合试剂，通过分光光度法检测样品的Cu²⁺螯合能力；

4)抑制糖基化终产物AGEs测试：

非酶糖基化反应体系：将10mg/mL的牛血清白蛋白BSA和0.5mol/L的葡萄糖溶解于0.02mol/L、pH 7.4的磷酸缓冲液PBS中，得非酶糖基化反应体系；

通过荧光光谱法，分析样品在美拉德反应的不同阶段对AGEs和pentosidine的影响。

本发明的小球藻功能成分CPE的高通量筛选系统，通过对现有的筛选平台的改进以及结合，提出了一种抗氧化、免疫调节以及糖尿病等生理功能的高通量筛选方法，活性谱范围广，功能活性高，便于CPE的分离提取以及小球藻功能产品的工业化生产。

本发明的第二目的在于提供一种小球藻功能成分CPE的高通量筛选方法，包括：

1)抗氧化测试：取浓度为0、100、200、500、1000μg/mL样品，加入Griess试剂，37℃反应1min后终止反应，以630nm为参考波长，测定反应物在550nm处的OD值， 根据如下公式计算样品的自由基清除能力，以样品对˙OH的百分清除率表示；

2)细胞免疫调节测试：

a.四噻唑蓝MTT法检测组分对小鼠巨噬细胞Ana-1存活率的影响；

具体操作如下：取对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化后，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基制成细胞悬液，以2×10⁴个/孔的密度均匀加入到96孔细胞培养板中，置37℃、饱和湿度、含5％CO₂的细胞培养箱内静置培养。待细胞贴壁并生长至适合密度(约24h)后，每孔加入不同浓度的CPE等药物。继续培养一定时间后，每孔加入20μL0.5mg/mL的MTT溶液，37℃孵育4h。孵育完成后，每孔加入100μL三联液(10％SDS，5％异丁醇，12mmol/L HCl)，37℃孵育过夜，以溶解细胞与MTT反应所形成的紫色formazan结晶。接着震荡混匀5min，以630nm波长为参考，检测各孔在492nm波长处的OD值，并根据公式计算细胞存活率。

b.中性红NR染色法检测组分对Ana-1吞噬功能的影响；

具体操作如下：Ana-1细胞经CPE等样品处理一定时间后，每孔加新鲜配制的0.1％NR悬浊液20μL，轻轻混匀后继续培养3h。之后小心吸弃含有NR的培养液，用生理PBS轻柔洗去未被吞噬的NR。每孔加150μL细胞裂解液(无水乙醇:乙酸＝1:1(v/v))，静置2h，使细胞溶解，震荡混匀后测定540nm处OD值。细胞对NR的吞噬率计算方式同上述公式c.荧光探针法检测样品对Ana-1细胞内NO分泌的改变；

具体操作如下：用DAF-FM DA稀释液将荧光探针DAF-FM DA稀释至终浓度5μmol/L。取足量对数生长期的细胞，消化并吹散，离心收集后用pH 7.4的生理PBS洗涤一次。以稀释好的DAF-FM DA工作液重悬细胞，调整细胞浓度至1×10⁶个/mL，37℃孵育20min。期间每隔3-5min将混合物颠倒混匀，使探针和细胞充分接触。PBS洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DAF-FM DA。将装载好的细胞均匀铺入96孔黑色细胞培养板中，并加入不同浓度的CPE样品。37℃温浴一定时间后，检测各孔在495/515nm激发/发射波长下的荧光值，并计算各样品作用下Ana-1细胞NO水平的改变。

3)氧化还原金属离子螯合测试：

a.Fe²⁺螯合测试

在pH 4.9的HAc-NaAc缓冲液中加入5mmol/L的相应金属离子溶液，使其终浓度为1.25mmol/L；

以浓度为2.5，5.0，和7.5mmol/L的EDTA溶液作为阳性对照，其余为不同浓度的CPE样品；

各反应管内用蒸馏水补足，使每个体系体积达到240μL，室温反应30min；

反应结束后，加入50mmol/L的菲洛嗪溶液显色30min，检测其在535nm或612nm处的OD值，根据下述公式计算样品对Fe²⁺的螯合率；

b.Cu²⁺螯合测试

在pH 6.0的HAc-NaAc缓冲液中加入5mmol/L的相应金属离子溶液，使其终浓度为1.25mmol/L；

以浓度为2.5，5.0，和7.5mmol/L的EDTA溶液作为阳性对照，其余为不同浓度的CPE样品；

各反应管内用蒸馏水补足，使每个体系体积达到240μL，室温反应30min；

反应结束后，加入20mmol/L的邻苯二酚紫溶液显色30min，检测其在535nm或612nm处的OD值，根据下述公式计算样品对Cu²⁺的螯合率；

4)抑制糖基化终产物AGEs测试：

将10mg/mL的牛血清白蛋白BSA和0.5mol/L的葡萄糖溶解于0.02mol/L、pH 7.4的磷酸缓冲液PBS中，非酶糖基化反应体系；

将样品加入到上述反应体系中孵育，使其终浓度分别为10，100，和1000μg/mL，同时以单独孵育在PBS中的10mg/mL BSA为空白对照；

所有样品经直径0.22μm的微孔滤膜抽滤灭菌，在37℃避光孵育1、3、7、14、28、42d后，将孵育产物稀释至1mg/mL，分别检测孵育产物在370/440nm和335/385nm处的荧光值；

以1mg/mL BSA的荧光值为一个荧光单位，根据下述公式计算CPE作用下孵育产物的荧光强度FI；

本发明的小球藻功能成分CPE的高通量筛选方法，通过对现有的筛选平台的改进以及结合，提出了一种抗氧化、免疫调节以及糖尿病等生理功能的高通量筛选方法，活性谱范围广，功能活性高，便于CPE的分离提取以及小球藻功能产品的工业化生产。

本发明的第三目的在于提供一种小球藻功能成分CPE的制备方法，包括：

1)将蛋白核小球藻藻粉加入蒸馏水中，于压强0.05-0.25MPa，温度110-130℃下，加热30-60min，进行萃取；

2)取出样品，室温下冷却后，10000rpm离心30min，上清液经减压抽滤后，4℃保存备用；

3)将步骤2)离心后的藻泥，加入与1)等体积蒸馏水重悬，于压强0.1MPa，温度110-130℃下，加热30-60min，再次萃取；

4)取出样品，室温下冷却后，10000rpm离心30min，取上清液，减压抽滤，合并两次滤液，冷冻干燥，制得小球藻CPE提取物粉末。

优选的，所述步骤1)中的压强为0.05-0.25MPa。

优选的，所述步骤1)中的温度为110-130℃。

优选的，所述步骤1)中的加热时间为30-60min。

所述步骤1)中的蛋白核小球藻藻粉均匀悬浮于蒸馏水中，蛋白核小球藻藻粉与蒸馏水的配比为1g:10ml。

优选的，所述步骤3)中的压强为0.05-0.25MPa。

优选的，所述步骤3)中的温度为110-130℃。

优选的，所述步骤3)中的加热时间为30-60min。

所述的萃取是用高压热水法进行萃取。

本发明的基于高压破壁法制备小球藻CPE的方法，该方法仅需水和常见设备高压釜，破壁和提取同步进行，破壁充分，操作步骤少，所需时间显著缩短，具有成本低、无污染又快速简便等多方面的优点。

与现有技术相比，本发明的积极效果如下：

本发明通过引入高压破壁技术，实现了小球藻CPE的高效制备。经本发明方法提取的小球藻CPE，得率高达251.67mg/g藻粉，且提取物中的核酸和蛋白质含量丰富，CPE活性高，非常适宜于工业化生产，为小球藻高附加值生物活性物质的研究和开发奠定基础，以 降低微藻能源的开发成本，提高微藻能源的综合利用度。

附图说明

图1为两种CPE对˙OH的清除率；

图2为两种CPE对Ana-1存活率的影响；

图3为CPE1对Ana-1存活率以及Ana-1对NR的细胞吞噬率的影响；

图4为CPE1对Fe²⁺的螯合作用；

图5为CPE1对Cu²⁺的螯合作用；

图6为CPE1对总AGEs和penosidine形成的影响；

图7不同提取方法所制备的CPE得率；

图8为四种CPE粗品对˙OH的清除率；

图9为四种CPE对巨噬细胞Ana-1存活率的影响；

图10为四种CPE粗提物对Fe²⁺和Cu²⁺的螯合率。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

小球藻功能成分CPE的高通量活性筛选系统

1)抗氧化测试：采用Griess试剂进行测试，通过分光光度法检测样品的总抗氧化能力和对自由基的清除作用；

2)细胞免疫调节测试：

a.四噻唑蓝MTT法检测组分对小鼠巨噬细胞Ana-1存活率的影响；

b.中性红NR染色法检测组分对Ana-1吞噬功能的影响；

c.荧光探针法检测样品对Ana-1细胞内NO分泌的改变；

3)氧化还原金属离子螯合测试：

a.采用菲洛嗪作为Fe²⁺螯合试剂，通过分光光度法检测样品的Fe²⁺螯合能力；

b.采用邻苯二酚紫作为Cu²⁺螯合试剂，通过分光光度法检测样品的Cu²⁺螯合能力；

4)抑制糖基化终产物AGEs测试：

非酶糖基化反应体系：将10mg/mL的牛血清白蛋白BSA和0.5mol/L的葡萄糖溶解于0.02mol/L、pH 7.4的磷酸缓冲液PBS中，得非酶糖基化反应体系；

通过荧光光谱法，分析样品在美拉德反应的不同阶段对AGEs和pentosidine的影响。

实施例2

本实施例中CPE1和CPE2选取的是通过超声酶解法制得，具体方法为：10g蛋白核小球藻粉均匀悬浮于100mL蒸馏水中。超声破壁30min后，于95℃水浴中提取30min。待提取液冷却后，加入纤维素酶(80mg/g藻粉)、果胶酶(10mg/g藻粉)。50℃水浴2h，对多糖进行降解。沸水浴30min使酶灭活，10000rpm离心30min。收集上清液，按4倍体积浓缩，并冷冻干燥，得到CPE超声酶解产物，其中CPE1酶解了4h，CPE2则酶解了16h。

小球藻功能成分CPE的高通量活性筛选方法

1)抗氧化能力测试，即清除羟自由基(˙OH)能力测试

测试方法：取0、100、200、500、1000μg/mL浓度样品，加入Griess试剂，37℃准确反应1min后终止反应，以630nm为参考波长，测定反应物在550nm处的OD值。

样品的自由基清除能力，根据公式进行计算，以样品对˙OH的百分清除率表示，公式如下：

结果分析：如图1所示(两种CPE对˙OH的清除率，n＝6；与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01)，两种CPE对体系中的˙OH均有一定的清除能力，且这种清除能力与浓度正相关，随着参试浓度的提高，清除率增加。尤其是在浓度达到1000μg/mL时，CPE1对˙OH的清除率达到29.46％(p<0.01)，而CPE2对˙OH具有更高的清除能力，其清除率达到34.05％(p<0.01)。

2)细胞免疫调节功能测试

a.Ana-1的细胞存活率测试

具体操作如下：取对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化后，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基制成细胞悬液，以2×10⁴个/孔的密度均匀加入到96孔细胞培养板中，置37℃、饱和湿度、含5％CO₂的细胞培养箱内静置培养。待细胞贴壁并生长至适合密度(约24h)后，每孔加入不同浓度的CPE等药物。继续培养一定时间后，每孔加入20μL0.5mg/mL的MTT溶液，37℃孵育4h。孵育完成后，每孔加入100μL三联液(10％SDS，5％异丁醇，12mmol/L HCl)，37℃孵育过夜，以溶解细胞与MTT反应所形成的紫色formazan结晶。接着震荡混匀5min，以630nm波长为参考，检测各孔在492nm波长处的OD值，并根据公式计算细胞存活率。

结果分析：如图2所示(两种CPE对Ana-1存活率的影响n＝5；与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01)，在0-500μg/mL的浓度范围内，两种CPE对Ana-1无明显细胞毒性作用，反而促进细胞增殖，但细胞的增殖率基本低于10％。

如图3所示(CPE1对Ana-1存活率的影响，n＝6；与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01)将CPE1的最高参试浓度提高到1000μg/mL后发现，CPE1虽在低浓度时对Ana-1细胞的生长无显著影响，但当其参试浓度高于600μg/mL时，可使巨噬细胞的存活率显著提高到对照组的120％左右。上述研究结果表明，CPE无明显细胞毒作用，反而有利于巨噬细胞的增殖。

b.Ana-1细胞吞噬功能测试

具体操作如下：Ana-1细胞经CPE等样品处理一定时间后，每孔加新鲜配制的0.1％NR悬浊液20μL，轻轻混匀后继续培养3h。之后小心吸弃含有NR的培养液，用生理PBS轻柔洗去未被吞噬的NR。每孔加150μL细胞裂解液(无水乙醇:乙酸＝1:1(v/v))，静置2h，使细胞溶解，震荡混匀后测定540nm处OD值。细胞对NR的吞噬率计算方式同上述公式。

结果分析：如图3所示(Ana-1对NR的细胞吞噬率的影响，n＝6；与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01)在CPE1作用下，细胞对NR的吞噬活性显著增强。在CPE1浓度为200μg/mL时，Ana-1对NR的细胞吞噬率增加到对照组的156.00％(p<0.05)；当CPE1浓度提高到600μg/mL时，细胞吞噬率可达到对照组的211.72％(图3，p<0.01)。与相同条件下的细胞存活率的递增相比，Ana-1的细胞吞噬率增加幅度明显高于前者。

3)氧化还原金属离子螯合测试

a.CPE的Fe²⁺螯合能力测试

在200μL pH 4.9的HAc-NaAc缓冲液中加入10μL 5mmol/L的FeSO₄(终浓度为1.25mmol/L)。以20μL浓度为2.5，5.0，和7.5mmol/L的EDTA溶液作为阳性对照，其余为不同浓度的CPE样品20μL。各反应管内用蒸馏水补足，使每个体系体积达到240μL。室温反应30min。反应结束后，加入20μL 50mmol/L的FZ(菲洛嗪)溶液，显色30min，检测其在535nm或612nm处的OD值，根据下述公式计算样品对Fe²⁺的螯合率：

结果分析：如图4所示(CPE1对Fe²⁺的螯合作用)，金属离子螯合阳性对照物EDTA，能够呈浓度依赖性地螯合体系内的Fe²⁺；当其浓度达到7.5mmol/L时，EDTA对Fe²⁺的螯合率达到99.72％。但CPE1对Fe²⁺基本没有螯合作用。

b.CPE的Cu²⁺螯合能力测试

在200μL pH 6.0的HAc-NaAc缓冲液中加入10μL 5mmol/L的CuSO₄(终浓度为1.25mmol/L)。以20μL浓度为2.5，5.0，和7.5mmol/L的EDTA溶液作为阳性对照，其余为不同浓度的CPE样品20μL。各反应管内用蒸馏水补足，使每个体系体积达到240μL。室温反应30min。反应结束后，加入5μL 20mmol/L的PV(邻苯二酚紫)溶液，显色30min，检测其在535nm或612nm处的OD值，根据下述公式计算样品对Cu²⁺的螯合率：

结果分析：如图5所示(CPE1对Cu²⁺的螯合作用)，阳性对照物EDTA在5mmol/L时，对Cu²⁺的螯合能力达到83.80％，且CPE1对Cu²⁺也有螯合作用，且随着CPE1浓度的增加，螯合作用增强。

4)抑制糖基化终产物(AGEs)能力测试

将10mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)和0.5mol/L的葡萄糖溶解于0.02mol/L的磷酸缓冲液(PBS，pH 7.4)中，成为蛋白质非酶糖基化的体外反应体系。将CPE加入到非酶糖基化孵育体系中，使其终浓度为10，100，和1000μg/mL，同时以单独孵育在PBS中的10mg/mL BSA为空白对照。所有样品经直径0.22μm的微孔滤膜抽滤灭菌，在37℃避光孵育1、3、7、14、28、42d后，将孵育产物稀释至1mg/mL，分别检测孵育产物在370/440nm和335/385nm 处的荧光值。以1mg/mL BSA的荧光值为一个荧光单位，根据下述公式计算CPE作用下孵育产物的荧光强度(FI)。

结果分析：335/385nm和370/440nm分别是AGEs组分之一的pentosidine和总AGEs的特征性的荧光激发和发射波长。通过定期检测335/385nm和370/440nm处FI的改变，研究CPE在美拉德反应的不同阶段对AGEs和pentosidine水平的影响。美拉德反应共持续进行了4周，CPE对AGEs形成的动态影响如图6所示(CPE1对总AGEs和penosidine形成的影响，n＝4；A为CPE1对总AGEs形成的影响，B为CPE1对AGEs前体物penosidine形成的影响；与AGEs组相比，#p<0.05，##p<0.01)，两种CPE在美拉德反应的前期，尤其是第1天和第3天，对总AGEs和penosidine的形成均具有促进作用，且参试物的浓度越高，其促进作用越大(p<0.05)；但随着孵育时间的不断延长，尤其是从第3周开始，CPE对AGEs形成的促进作用逐渐消失，并抑制总AGEs的形成，而penosidine水平的增加也得到缓解。

上述结果提示，CPE在防治糖尿病慢性并发症方面具有一定的潜力。

以下实施例说明了小球藻功能成分CPE的4种不同制备方法，并对提取产物采用上述筛选系统进行测试，具体说明如下：

实施例3

基于高压破壁法制备小球藻功能成分CPE的方法

取10g蛋白核小球藻藻粉，均匀悬浮于100mL蒸馏水。置于高压锅中，在0.15MPa，120℃下加热40min。取出样品，于室温下冷却。10000rpm离心30min，上清液经减压抽滤后，于4℃保存备用。离心后的藻泥，加入100mL蒸馏水重悬，置于高压锅中，在0.15MPa，120℃下加热40min，再次萃取。取出样品，于室温下冷却。10000rpm离心30min，取上清液，减压抽滤。合并两次滤液，冷冻干燥，得CPE提取物粉末，标记为CPE-a。

实施例4

基于高压破壁法制备小球藻CPE的方法

取10g蛋白核小球藻藻粉，均匀悬浮于100mL蒸馏水。置于高压锅中，在0.05MPa，110℃下加热60min。取出样品，于室温下冷却。10000rpm离心30min，上清液经减压 抽滤后，于4℃保存备用。离心后的藻泥，加入100mL蒸馏水重悬，置于高压锅中，在0.05MPa，110℃下加热60min，再次萃取。取出样品，于室温下冷却。10000rpm离心30min，取上清液，减压抽滤。合并两次滤液，冷冻干燥，得CPE提取物粉末。

实施例5

基于高压破壁法制备小球藻CPE的方法

取10g蛋白核小球藻藻粉，均匀悬浮于100mL蒸馏水。置于高压锅中，在0.25MPa，130℃下加热30min。取出样品，于室温下冷却。10000rpm离心30min，上清液经减压抽滤后，于4℃保存备用。离心后的藻泥，加入100mL蒸馏水重悬，置于高压锅中，在0.25MPa，130℃下加热30min，再次萃取。取出样品，于室温下冷却。10000rpm离心30min，取上清液，减压抽滤。合并两次滤液，冷冻干燥，得CPE提取物粉末。

对比实施例1

超声破壁法提取

10g蛋白核小球藻粉均匀悬浮于100mL蒸馏水中。超声破壁30min后，于95℃水浴中提取30min。待提取液冷却后，将悬液于10000rpm离心30min，上清液按4倍体积浓缩后4℃保存备用。藻泥重悬于等量蒸馏水，并再次超声提取和离心。合并两次上清液，按4倍体积浓缩，并冷冻干燥，得到CPE粗提物，标记为CPE-b。

对比实施例2

超声酶解法提取

10g蛋白核小球藻粉均匀悬浮于100mL蒸馏水中。超声破壁30min后，于95℃水浴中提取30min。待提取液冷却后，加入纤维素酶(80mg/g藻粉)、果胶酶(10mg/g藻粉)。50℃水浴2h，对多糖进行降解。沸水浴30min使酶灭活，10000rpm离心30min。收集上清液，按4倍体积浓缩，并冷冻干燥，得到CPE超声酶解产物，标记为CPE-c。

对比实施例3

酶解法提取

10g蛋白核小球藻藻粉均匀悬浮于100mL蒸馏水中。藻粉悬液置于70℃水浴中浸泡10h。浸泡后的小球藻粉悬浮液中，按80mg/g藻粉及10mg/g藻粉的比例，加入果胶酶及 纤维素酶，于50℃水浴酶解12h，形成破壁藻泥。果胶酶及纤维素酶酶解结束后，以100mg/L和30mg/L的浓度加入蛋白酶K和核糖核酸酶A(RNase A)，50℃水浴酶解2h。RNase等酶解结束后，小球藻酶解产物于100℃水浴灭酶活30min。10000rpm离心30min，取上清液。上清液按4倍体积浓缩后冷冻干燥，得CPE提取物粉末，标记为CPE-d。

提取物评价测试：

将上述各实施例的提取产物：高压破壁法(产物为CPE-a)、超声破壁法(产物为CPE-b)、超声破壁-酶解法(产物为CPE-c)，以及酶解法(产物为CPE-d)，分别进行得率、热水提取物指标值(OD₂₆₀)、蛋白质和糖含量，以及生物活性等评价测试。

1、得率及成分分析

从图1可以看出(CPE-e为经典温热法得到的CPE提取物)，本发明中，CPE-b的得率明显低于其他三种产物，表明超声破壁和常规热水提取的效率非常低。当超声破壁得到酶解破壁辅助后，产物得率显著提高，从CPE-b的148.36mg/g藻粉迅速上升至CPE-c的279.25mg/g藻粉。CPE-a，CPE-c，和CPE-d三种产物的得率均较高，分别为251.67，279.25，和258.85mg/g藻粉(图7)。

CPE-a的得率高，为251.67mg/g藻粉的产物。上述结果表明，在高压破壁提取法中，适当延长提取时间、增加提取次数有助于提取效率的提升。

由于酶本身价格昂贵，反应后难以彻底去除，且酶解反应操作步骤复杂，耗时过长，以酶解方法制备CPE并不可取。

而高压破壁法仅需水和常见设备高压釜，破壁和提取同步进行，操作步骤少，所需时间也较酶解法显著缩短，具有低成本、无污染又快速简便等多方面的优点。因此，从产物得率考虑，高压破壁法是制备CPE高效方法。

2、蛋白质和含糖量分析

通过对四种产物进行紫外吸收分析，结果显示四种产物均具有丰富的蛋白质和核酸，其中CPE-a是四种提取物中核酸和蛋白质含量最丰富的物质。

后期通过苯酚-硫酸法检测总糖含量、DNS法检测还原糖含量以及考马斯亮蓝法检测蛋白质含量，结果如表1所示。

表1 CPE产物的蛋白质和糖含量分析(n＝3)

注：OD1200、OD5000为市售“CGF”商品

与OD1200相比，**p<0.01；与OD5000相比，##p<0.01；

与CPE-a相比，+p<0.05，++p<0.01。n未检出

与紫外吸收比较结果相似，四种产物中CPE-a的蛋白质含量最高。采用考马斯亮蓝法，CPE-a的蛋白质含量均显著高于OD1200(p<0.01)，而CPE-c和CPE-d的蛋白质含量显著低于OD5000。

糖含量检测结果显示，四种CPE的总糖含量低于两种“CGF”对照(p<0.01)，但其中CPE-c和CPE-d的糖含量较CPE-a丰富(p<0.05)。此外，除了CPE-c，其余产物中检测不到还原糖的存在。

3、活性分析

1)四种CPE的˙OH清除能力

测试方法：取浓度为0、100、200、500、1000μg/mL的上述4种样品，加入Griess试剂，37℃准确反应1min后终止反应，以630nm为参考波长，测定反应物在550nm处的OD值。样品的自由基清除能力，根据公式进行计算，以样品对˙OH的百分清除率表示。

从图2分析四种CPE对˙OH的清除率比较(n＝6；与空白对照相比，*p<0.05，**p<0.01；与CPE-a相比，+p<0.05，++p<0.01)，上述四种CPE均具有清除˙OH的能力，且随着参试浓度的提高，清除率逐渐上升。在同一参试浓度对四种CPE的清除率进行比较，发现CPE-a对˙OH的清除效果最佳，在40-400μg/mL范围内，其余三种CPE的˙OH清除率均显著低于CPE-a(p<0.05)；当浓度提高到1000μg/mL时，CPE-a对˙OH的清 除率可达到74.31％。

2)四种CPE对巨噬细胞存活率的影响

从图3分析四种CPE对巨噬细胞Ana-1存活率的影响(n＝6；与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01；与CPE-a相比，+p<0.05，++p<0.01)，四种CPE能够显著促进巨噬细胞Ana-1增殖。在25-200μg/mL的浓度范围内，四种CPE均能以浓度依赖的方式促进Ana-1细胞增殖，其中以CPE-a的作用最佳，在100μg/mL时，CPE-a对Ana-1的促增殖率显著高于其他三种CPE(p<0.05)；200μg/mL时，CPE-a使Ana-1的存活率提高到162.98％，其他三种CPE的促增殖作用极显著低于CPE-a(p<0.01)。

3)四种CPE的金属离子螯合能力

测试方法：在200μL pH 4.9(Fe²⁺螯合测试)或pH 6.0(Cu²⁺螯合测试)的HAc-NaAc缓冲液中各加入10μL 5mmol/L的相应金属离子溶液(终浓度为1.25mmol/L)。以20μL浓度为2.5，5.0，和7.5mmol/L的EDTA溶液作为阳性对照，其余为不同浓度的CPE样品20μL。各反应管内用蒸馏水补足，使每个体系体积达到240μL。室温反应30min。反应结束后，分别加入20μL 50mmol/L的FZ(菲洛嗪)溶液(Fe²⁺螯合测试)或5μL 20mM的PV(邻苯二酚紫)溶液(Cu²⁺螯合测试)显色30min，检测其在535nm或612nm处的OD值，根据上述公式计算样品对Cu²⁺和Fe²⁺的螯合率。

从图4分析四种CPE粗提物对Fe²⁺和Cu²⁺的螯合率(n＝3；与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01；与CPE-a相比，+p<0.05)，在浓度低于1mg/mL时，四种CPE对Fe²⁺基本上没有螯合作用，但当浓度达到10mg/mL时，四种CPE均表现出一定的Fe²⁺螯合能力(p<0.01)。

四种CPE对Cu²⁺均有一定的螯合作用，且随着CPE参试浓度的提高，螯合率也相应增加。在1mg/mL时，各组对Cu²⁺的螯合率均低于10％(p<0.05)，且各组之间无显著差异；当浓度达到10mg/mL时，四种CPE对Cu²⁺的螯合能力相应提高。

4)四种CPE对AGEs形成的影响

测试方法：将10mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)和0.5mol/L的葡萄糖溶解于0.02mol/L的磷酸缓冲液(PBS，pH 7.4)中，成为蛋白质非酶糖基化的体外反应体系。将CPE加入到非酶糖基化孵育体系中，使其终浓度为10，100，和1000μg/mL，同时以单独孵育在PBS 中的10mg/mL BSA为空白对照。所有样品经直径0.22μm的微孔滤膜抽滤灭菌，在37℃避光孵育1、3、7、14、28、42d后，将孵育产物稀释至1mg/mL，分别检测孵育产物在370/440nm和335/385nm处的荧光值。以1mg/mL BSA的荧光值为一个荧光单位，根据上述公式计算CPE作用下孵育产物的荧光强度(FI)。

采用上述小球藻功能成分CPE的筛选系统及筛选方法，对4种不同制备方法得到的小球藻功能成分CPE进行筛选评价，结果发现通过高压破壁法制备的小球藻功能成分CPE综合评价最好，且该制备方法简单，成本低，非常适合工业化生产。

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