菁染料在检测凝血酶中的用途、凝血酶检测试剂盒及方法与流程

本发明涉及检测领域，具体的，本发明涉及菁染料在检测凝血酶中的用途、凝血酶检测试剂盒及方法，更具体的，本发明涉及菁染料和核酸适配体的组合在检测凝血酶中的用途、一种用于检测凝血酶的试剂盒和一种检测样本中凝血酶的方法。

背景技术：

凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，也是血液凝血级联反应中的主要效应蛋白酶，显现出促凝和抗凝的特性。凝血酶是由在凝血酶原复合物中的非活性凝血酶原在Xa因子(FXa)因子的作用下通过蛋白裂解的方式产生。

临床研究发现，心肌梗死、脑卒中等血栓病人体内凝血酶明显高于正常水平，日常监测凝血酶浓度可预防此类疾病；肾病、恶性肿瘤、糖尿病患者血浆凝血酶含量明显高于正常人，凝血酶浓度的检测对此类疾病的预防、确诊、治疗有指导意义；血友病等出血性疾病，患者体内的凝血酶浓度明显低于正常水平，凝血酶浓度的检测对制定治疗方案有直接的指导作用。

然而，检测凝血酶的方法仍有待进一步开发。

技术实现要素：

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明提出了一种更加灵敏的检测凝血酶的方法。

在本发明的第一方面，本发明提出了菁染料和核酸适配体的组合在检测凝血酶中的用途。根据本发明的实施例，菁染料和核酸适配体的组合能够更加灵敏地检测凝血酶，根据本发明的实施例，通过采用菁染料和核酸适配体的组合，对凝血酶的检测限达到了0.5pmol/L，而现有方法检测凝血酶的浓度通常为nM级别。

根据本发明的实施例，上述菁染料和核酸适配体的组合在检测凝血酶中的用途还可以进一步包括下列附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述检测通过圆二色谱法、紫外光谱法、荧光光谱法的至少之一进行的。根据本发明的实施例，凝血酶能够诱导核酸适配体形成G-四链体结构，G-四链体进一步诱导菁染料形成J-聚集体，产生J-聚集体信号，因此，通过圆二色谱法、紫外 光谱法或荧光光谱法检测J-聚集体信号，从而能够以更高地灵敏性和专属性检测出样本中的凝血酶。

根据本发发明的实施例，所述圆二色谱法的波长范围是200nm～700nm。发明人通过大量的研究实验发现，当采用述圆二色谱法检测凝血酶诱导产生的菁染料J-聚集体信号时，采用200nm～700nm的波长，可以以更高的灵敏性和专属性检测出样本中的凝血酶。

根据本发明的实施例，所述菁染料为式I所示的化合物，

其中：R₁为C_1～6烷基、任选被烷基取代的苯基，任选地，所述C_1～6烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基；R₂、R₃、R₄和R₅分别独立地选自H或C₁～₆的烷基，或者R₂和R₃与它们所连接的碳原子一起形成5元至7元的环结构，或者R₄和R₅与它们所连接的碳原子一起形成5元至7元的环结构，任选地，所述C₁-C₆的烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基；R₆和R₇分别独立地为任选被磺酸基取代的C₁～₆烷基，任选地，所述C_1～6烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基；Y为反离子，所述反离子是基于R₆和R₇所带电荷而选择的，当R₆和R₇为烷基时，Y为卤素阴离子；当R₆和R₇之一携带磺酸根，不含Y；当R₆和R₇均携带磺酸根时，Y为三乙胺阳离子；以及X₁和X₂分别独立地选自C、O、S、Se或Te。任选地，所述R₁选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基、异己基、苯基、甲基苯基或二甲基苯基；所述R₂、R₃、R₄和R₅独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基；所述5元至7元环结构为含有或不含有N或S原子的饱和或不饱和环结构；所述Y选自氟、氯、溴、碘阴离子或三乙胺阳离子。根据本发明的实施例，上述菁染料和核酸适配体的组合可更有效用于检测凝血酶，对凝血酶的检测更具有专属性，对凝血酶的检测灵敏度进一步提高。

根据本发明的实施例，所述菁染料为选自下列的式II、式III所示化合物的至少之一：

根据本发明的实施例，式II、式III所示化合物的菁染料和核酸适配体的组合可更有效用于检测凝血酶，对凝血酶的检测更具有专属性，对凝血酶的检测灵敏度也进一步提高。

根据本发明的实施例，所述菁染料与所述核酸适配体的摩尔比是1:(0.05～0.1)。发明人通过大量的研究实验发现，当菁染料与核酸适配体的摩尔比为1:(0.05～0.1)，菁染料与核酸适配体组合实现对样本中凝血酶的更高专属性和更高灵敏度检测。

根据本发明的实施例，所述核酸适配体具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

GGTTGGTGTGGTTGG(SEQ ID NO：1)。

根据本发明的实施例，凝血酶能够诱导核酸适配体形成G-四链体结构，G-四链体进一步诱导菁染料形成J-聚集体，产生J-聚集体信号，进而通过检测J-聚集体信号可更高灵敏度和更高专属性地检测样本中的凝血酶。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种用于检测凝血酶的试剂盒，其特征在于，包括：菁染料；以及核酸适配体。根据本发明的实施例，所述试剂盒能够用于凝血酶的检测，检测灵敏度高、专属性强。

根据本发明的实施例，上述试剂盒还可以进一步包括下列附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述菁染料为式I所示的化合物，

其中：R₁为C_1～6烷基、任选被烷基取代的苯基，任选地，所述C_1～6烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基；R₂、R₃、R₄和R₅分别独立地选自H或C₁～₆的烷基，或者R₂和R₃与它们所连接的碳原子一起形成5元至7元的环结构，或者R₄和R₅与它们所连接的碳原子一起形成5元至7元的环结构，任选地，所述C₁-C₆的烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基；R₆和R₇分别独立地为任选被磺酸基取代的C₁～₆烷基，任选地，所述C_1～6烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基；Y为反离子，所述反离子是基于R₆和R₇所带电荷而选择的，当R₆和R₇为烷基时，Y为卤素阴离子；当R₆和R₇之一携带磺酸根，不含Y；当R₆和R₇均携带磺酸根时，Y为三乙胺阳离子；以及X₁和X₂分别独立地选自C、O、S、Se或Te。任选地，所述R₁选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基、异己基、苯基、甲基苯基或二甲基苯基；所述R₂、R₃、R₄和R₅独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基；所述5元至7元环结构为含有或不含有N或S原子的饱和或不饱和环结构；所述Y选自氟、氯、溴、碘阴离子或三乙胺阳离子。根据本发明的实施例，包括具有上述结构的菁染料以及核酸适配体的试剂盒，更有效能够用于凝血酶的检测，检测灵敏度进一步提高、专属性进一步增强。

根据本发明的实施例，所述菁染料为选自下列的式II、式III所示化合物的至少之一：

根据本发明的实施例，所述试剂盒中的菁染料为式II或式III所示化合物，所述试剂盒可更有效用于凝血酶的检测，检测灵敏度更高、专属性进一步增强。

根据本发明的实施例，所述试剂盒进一步包括缓冲液，所述缓冲液含有钾离子，并且所述缓冲液的pH值为5.0～8.2。发明人惊奇的发现，含有钾离子的缓冲液，且缓冲液的pH值为5.0～8.2，可最大限度地保持凝血酶的稳定、保持核酸适配体的生物活性，从而，凝血酶可有效促进核酸适配体形成G-四链体结构，G-四链体进一步诱导菁染料形成J-聚集体，产生J-聚集体信号。因此，所述缓冲液使得所述试剂盒用于检测凝血酶，其专属性和灵敏度进一步提高。

根据本发明的实施例，所述缓冲液包括选自磷酸钾-磷酸氢钾、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾-氯化钾、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾-氯化钠、磷酸二氢钾-氢氧化钾、磷酸二氢钾-氢氧化钠、磷酸二氢钾-磷酸氢二钠-氯化钾、磷酸二氢钾-磷酸、硼酸-氯化钾-氢氧化钠、氢二钠-氯化钠缓冲液的至少之一，优选地，所述缓冲液是磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液。根据本发明的实施例，所述缓冲液使得所述试剂盒用于检测凝血酶，其专属性和灵敏度进一步提高。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种检测样本中凝血酶的方法，其特征在于，包括：(1)将所述样本与菁染料、核酸适配体混合；(2)将步骤(1)中所得到的混合物进行圆二色谱法、紫外光谱法、荧光光谱法的至少之一检测；(3)基于所述圆二色谱法、紫外光谱法、荧光光谱法的至少之一检测的结果，确定所述样本中是否存在凝血酶。根据本发明的实施例，本发明提出的检测样本中凝血酶的方法具有专属性强和灵敏度高的特点。

根据本发明的实施例，上述检测样本中凝血酶的方法还可以进一步包括下列附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述圆二色谱法的波长范围是200nm～700nm。根据本发明的实施例，当对步骤(1)中所得到的混合物进行圆二色谱法检测时，采用200nm～700nm的波长，可以实现对样品中凝血酶的更高专属性和更高灵敏性的检测。

根据本发明的实施例，在步骤(3)中，所述圆二色谱法检测结果中存在620nm峰和 642nm峰是所述样本中存在凝血酶的指示。发明人惊奇地发现，当凝血酶与菁染料、核酸适配体混合后，对所述混合物进行圆二色谱法检测，可在620nm和642nm处出现特异性峰，因此，待测样品在圆二色谱法检测结果中存在620nm峰和642nm峰是样本中存在凝血酶的指示。

根据本发明的实施例，检测样本中凝血酶的方法进一步包括：(4)基于所述620nm峰和642nm峰至少之一的面积，确定所述样本中凝血酶的量。根据本发明的实施例，本发明所提出的方法中，特异性峰620nm峰和642nm峰的至少之一的面积与样本中凝血酶的量对应。步骤(4)可进一步确定样品中凝血酶的量。

根据本发明的实施例，在步骤(4)中，通过将所述620nm峰和642nm峰至少之一的面积与标准曲线进行比较，确定所述样本中凝血酶的量。根据本发明的实施例，通过将所述620nm峰和642nm峰至少之一的面积与标准曲线进行比较，可更加准确确定所述样本中凝血酶的量

根据本发明的实施例，所述标准曲线是利用多个含有已知量凝血酶的样本进行平行实验确定的。平行实验是指在检测条件完全一致的情况下进行的实验。根据本发明的实施例，利用多个含有已知量凝血酶的样本进行平行实验，实验条件与本发明所述提出的检测凝血酶的方法条件完全一致，从而绘制峰面积-凝血酶酶浓度标准曲线，进而利用将所述620nm峰和642nm峰至少之一的面积与标准曲线进行比较，可更加准确确定所述样本中凝血酶的量。

根据本发明的实施例，所述样本的pH是5.0～8.2，样本中凝血酶的含量为至少0.5pM。根据本发明的实施例，所述样本中凝血酶的含量为至少0.5pM，0.5pM是本发明所提出方法的最低检测限；pH为5.0～8.2的含有金属钾离子的样本使得本发明所提出检测凝血酶的方法的灵敏度和专属性进一步提高。

根据本发明的实施例，所述菁染料为式I所示的化合物，

其中：R₁为C_1～6烷基、任选被烷基取代的苯基，任选地，所述C_1～6烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基；R₂、R₃、R₄和R₅分别独立地选自H或C₁～₆的烷基，或者R₂和R₃与它们所连接的碳原子一起形成5 元至7元的环结构，或者R₄和R₅与它们所连接的碳原子一起形成5元至7元的环结构，任选地，所述C₁-C₆的烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基；R₆和R₇分别独立地为任选被磺酸基取代的C₁～₆烷基，任选地，所述C_1～6烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基；Y为反离子，所述反离子是基于R₆和R₇所带电荷而选择的，当R₆和R₇为烷基时，Y为卤素阴离子；当R₆和R₇之一携带磺酸根，不含Y；当R₆和R₇均携带磺酸根时，Y为三乙胺阳离子；以及X₁和X₂分别独立地选自C、O、S、Se或Te。任选地，所述R₁选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基、异己基、苯基、甲基苯基或二甲基苯基；所述R₂、R₃、R₄和R₅独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、正己基或异己基；所述5元至7元环结构为含有或不含有N或S原子的饱和或不饱和环结构；所述Y选自氟、氯、溴、碘阴离子或三乙胺阳离子。根据本发明的实施例，将所述样本与式I所示化合物、核酸适配体混合后，继而对混合物进行圆二色谱法、紫外光谱法、荧光光谱法的至少之一检测；基于所述圆二色谱法、紫外光谱法、荧光光谱法的至少之一检测的结果，可确定所述样本中是否存在凝血酶。所述检测样品中凝血酶的方法的灵敏度和专属性进一步提高。

根据本发明的实施例，所述菁染料为选自下列的式II、式III所示化合物的至少之一：

根据本发明的实施例，所述检测样品中凝血酶的方法中菁染料选自式II、式III所示化 合物，所述检测样品中凝血酶的方法的灵敏度和专属性进一步提高。

根据本发明的实施例，所述菁染料与所述核酸适配体的摩尔比是1:(0.05～0.1)。根据本发明的实施例，当菁染料与核酸适配体的摩尔比为1:(0.05～0.1)，所得圆二色谱检测峰图在620nm和642nm处出现特征峰，如果菁染料与核酸适配体的摩尔比不在1:(0.05～0.1)范围内，则圆二色谱检测峰图不出现620nm和642nm的特征峰，因此当菁染料与所述核酸适配体的摩尔比是1:(0.05～0.1)时，本发明所提出的方法能够更高专属性和更高灵敏度地检测样品中的凝血酶。

根据本发明的实施例，所述核酸适配体具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。根据本发明的时施例，含有凝血酶的样品与菁染料、具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的核酸适配体混合后，凝血酶使核酸适配体形成G-四链体结构，G-四链体进一步诱导菁染料形成J-聚集体，产生J-聚集体信号，进而通过检测J-聚集体信号可以确定样品中的凝血酶。本发明所提出的检测方法专属性强、灵敏度高进一步提高。

根据本发明的实施例,所述菁染料的浓度是1～20微摩尔/升，优选地，所述菁染料的浓度是12微摩尔/升。根据本发明的实施例，发明人发现，当菁染料的浓度是1～20微摩尔/升，所得圆二色谱检测峰图在620nm和642nm处出现特征峰，当菁染料的浓度为12微摩尔/升时，圆二色谱检测峰图在620nm和642nm处的峰值最高，因此，在菁染料的浓度为1～20微摩尔/升，优选菁染料的浓度为12微摩尔/升时，可实现对样品中凝血酶的更高专属性和更高灵敏性的检测。

根据本发明的实施例，所述核酸适配体的浓度为0.5～2微摩尔/升，优选地，所述核酸适配体的浓度为1微摩尔/升。根据本发明的实施例，发明人发现，当核酸适配体的浓度是0.5～2微摩尔/升，所得圆二色谱检测峰图在620nm和642nm处出现特征峰，当核酸适配体的浓度为1微摩尔/升时，圆二色谱检测峰图在620nm和642nm处的峰值最高，因此，在核酸适配体的浓度为0.5～2微摩尔/升，优选核酸适配体的浓度为1微摩尔/升时，可实现对样品中凝血酶的更高专属性和更高灵敏性的检测。

需要说明的是，本专利中术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

附图说明

图1是根据本发明实施例1的专属性实验结果统计图；

图2是根据本发明实施例2的灵敏度实验圆二色谱检测图谱；

图3是根据本发明实施例2的灵敏度实验圆二色谱检测图谱；

图4是根据本发明实施例3的核酸适配体浓度筛选实验的圆二色谱检测图谱；

图5是根据本发明实施例4的菁染料浓度筛选实验的圆二色谱检测图谱；以及

图6是根据本发明实施例5的菁染料与核酸适配体的浓度比例范围筛选实验的圆二色谱检测图谱。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

在以下实施例中，为保证凝血酶的最佳活性，检测凝血酶的最佳检测温度为0摄氏度，最佳检测时间为现取现用。

实施例1专属性实验

在本实施例中所使用的菁染料具有式II所示的结构，核酸适配体具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，浓度均为1μM。

本实施例对5种不同蛋白(Thrombin、BSA、HSA、IgG、LA)进行专属性考察，

每种蛋白配制4个不同浓度的样本进行验证，各样本核酸适配体的浓度为浓度均为1微摩尔/升，菁染料的甲醇溶液浓度为12微摩尔/升。

实验步骤如下：

1)5mM的PBS-K⁺缓冲溶液溶解蛋白(Thrombin、BSA、HSA、IgG、LA)，得到浓度为100微摩尔/升的母液待用，每种蛋白的4个样品瓶中分别加入该蛋白母液0、10微升、50微升、100微升；

2)向上述4份待测样本中分别加入20微摩尔/升的核酸适配体溶液50微升；再依次向上述4份样本中加入166微摩尔/升的菁染料的甲醇溶液72微升；

3)分别补加PBS-K⁺缓冲溶878微升、868微升、828微升、778微升，制得总体积相同、核酸适配体和菁燃料浓度相同、该蛋白(Thrombin、BSA、HSA、IgG或LA)浓度不同的待测样本4份；

4)圆二色谱法检测待测溶液，波长选择200-700nm，圆二色谱仪对上述待测样品进行分析，一切操作都在0摄氏度下进行；

5)结果分析：以圆二色谱的吸收为纵坐标，以圆二色谱的波长为横坐标，制得图1。

结果如图1所示，其中thrombin为凝血酶、BSA为牛血清白蛋白、HSA为人血清白蛋 白、IgG为免疫球蛋白、LA为乳酸；BSA、HAS、IgG、LA四种血液蛋白浓度高达10微摩尔/升，检测体系中也没有出现J-聚集体特征峰信号(642nm)。

由图1可以看出，本发明提出的检测样品中凝血酶的方法可特异性检测凝血酶，具有很强的专属性。

实施例2灵敏度实验

本实施例中，发明人所用的菁染料具有式II或式III所示的结构。

核酸适配体具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本实施例对8个不同浓度的凝血酶(购自Sigma-Alodrich)样本进行验证，各样本凝血酶浓度为：0、0.5pM、1pM、2pM、3pM、5pM、10pM、20pM。

实验步骤如下：

1)5mM的PBS-K⁺缓冲溶液溶解凝血酶，得到浓度为0.1nM的凝血酶溶液待用，8个样品瓶中分别加入待用凝血酶溶液0、5微升、10微升、20微升、30微升、50微升、100微升、200微升；

2)向上述8份凝血酶待测样本中分别加入1微摩尔/升的核酸适配体5微升、166微摩尔/升的菁染料的甲醇溶液72微升；

3)分别补加PBS-K⁺缓冲溶923微升、918微升、913微升、903微升、893微升、873微升、823微升、723微升，制得总体积相同、核酸适配体和菁燃料浓度相同、凝血酶浓度不同的待测样本8份；

4)圆二色谱仪对上述待测样品进行分析，一切操作都在0摄氏度下进行。圆二色谱波长范围为200～700nm。

5)以圆二色谱的吸收为纵坐标，以圆二色谱的波长为横坐标，制得图2和图3。

其中，图2所用的菁染料具有式II所示的结构，图3所用的菁染料具有式III所示的结构。

由图2和图3可以得出，本发明提出的检测样品中凝血酶的方法对凝血酶的检测限可低至0.5pM，相比现有技术(检测限为nM级)灵敏度显著提高。

实施例3核酸适配体浓度筛选

在本实施例中所使用的菁染料具有式II所示的结构，核酸适配体具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，凝血酶浓度均为3pM；

本实施例对10个不同浓度的核酸适配体样本进行验证，各样本核酸适配体的浓度为：0、0.5微摩尔/升、0.6微摩尔/升、0.8微摩尔/升、1微摩尔/升、1.2微摩尔/升、1.4微摩尔/升、1.6微摩尔/升、1.8微摩尔/升、2微摩尔/升。

实验步骤如下：

1)5mM的PBS-K⁺缓冲溶液溶解凝血酶，得到浓度为0.1nM的凝血酶溶液待用，10个样品瓶中分别加入待用凝血酶溶液30微升；

2)向上述10份凝血酶待测样本中分别加入200微摩尔/升的核酸适配体溶液，体积分别为2.5微升、3微升、4微升、5微升、6微升、7微升、8微升、9微升、10微升；再依次向上述10份样本中加入12微摩尔/升的菁染料的甲醇溶液72微升；

3)分别补加PBS-K⁺缓冲溶878微升、875.5微升、875微升、874微升、873微升、873微升、871微升、870微升、869微升、868微升，制得总体积相同、凝血酶和菁燃料浓度相同、核酸适配体浓度不同的待测样本10份；

4)圆二色谱法检测待测溶液，波长选择200-700nm，圆二色谱仪对上述待测样品进行分析，一切操作都在0摄氏度下进行；

5)结果分析：以圆二色谱的吸收为纵坐标，以圆二色谱的波长为横坐标，制得图4。

由图4可以看出，核酸适配体浓度在0.5微摩尔/升～2微摩尔/升时，检测体系中出现J-聚集体特征峰信号(642nm)(620nm)，核酸适配体浓度为1微摩尔/升时，圆二色谱信号(CD)强度最强，以此确定最佳的核酸适配体浓度为1微摩尔/升。

实施例4菁染料浓度筛选

在本实施例中所使用的菁染料具有式II所示的结构，核酸适配体具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，凝血酶浓度均为3pM；

本实施例对8个不同浓度的菁燃料(甲醇溶液)样本进行验证，各样本菁染料的浓度为：0、1微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、12微摩尔/升、15微摩尔/升、18微摩尔/升、20微摩尔/升。

实验步骤如下：

1)5mM的PBS-K⁺缓冲溶液溶解凝血酶，得到浓度为0.1nM的凝血酶溶液待用，8个样品瓶中分别加入待用凝血酶溶液30微升；

2)向上述10份凝血酶待测样本中分别加入200微摩尔/升的核酸适配体溶液5微升；再依次向上述8份样本中加入166微摩尔/升的菁染料的甲醇溶液0、6微升、30微升、60微升、72微升、90微升、108微升、120微升；

3)分别补加PBS-K⁺缓冲溶965微升、959微升、935微升、905微升、893微升、875微升、857微升、845微升，制得总体积相同、核酸适配体和凝血酶浓度相同、菁燃料浓度不同的待测样本10份；

4)圆二色谱法检测待测溶液，波长选择200-700nm，园二色谱仪对上述待测样品进行分析，一切操作都在0摄氏度下进行；

5)结果分析：以圆二色谱的吸收为纵坐标，以圆二色谱的波长为横坐标，制得图5。

由图5可以看出，菁染料浓度在1微摩尔/升～20微摩尔/升时，检测体系中出现J-聚集体特征峰信号(642nm)(620nm)，菁染料浓度为12微摩尔/升时，圆二色谱(JASCO J-815)信号(CD)强度最强，以此确定最佳的菁染料浓度为12微摩尔/升。

实施例5菁染料与核酸适配体的浓度比例范围筛选

在本实施例中所使用的菁染料具有式II所示的结构，核酸适配体具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，凝血酶浓度均为3pM，菁燃料(甲醇溶液)的浓度均为12微摩尔/升。

本实施例对10个不同浓度比例的(菁燃料/核酸适配体)样本进行验证，各样本核酸适配体的浓度为：0、0.5微摩尔/升、0.6微摩尔/升、0.8微摩尔/升、1微摩尔/升、1.2微摩尔/升、1.4微摩尔/升、1.6微摩尔/升、1.8微摩尔/升、2.0微摩尔/升。

实验步骤如下：

1)5mM的PBS-K⁺缓冲溶液溶解凝血酶，得到浓度为0.1nM的凝血酶溶液待用，10个样品瓶中分别加入待用凝血酶溶液50微升；

2)向上述10份凝血酶待测样本中分别加入166微摩尔/升的菁染料的甲醇溶液72微升；再依次向上述10份样本中加入20微摩尔/升的核酸适配体溶液0、25微升、30微升、40微升、50微升、60微升、70微升、80微升、90微升、100微升；

3)分别补加PBS-K⁺缓冲溶878微升、853微升、848微升、843微升、838微升、835微升、828微升、825微升、818微升、815微升，制得总体积相同、菁燃料和凝血酶浓度相同、核酸适配体浓度不同的待测样本10份；

4)圆二色谱法检测待测溶液，波长选择200-700nm，园二色谱仪对上述待测样品进行分析，一切操作都在0摄氏度下进行；

5)结果分析：以圆二色谱的吸收为纵坐标，以圆二色谱的波长为横坐标，制得图6。

由图6可以看出，菁染料与核酸适配体的浓度比例范围为12μM:(0.6-1.2)μM(1:(0.05～0.1))，比例不在此范围，无J-聚集体信号。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例 进行变化、修改、替换和变型。