一种T细胞斑点试验的预包被反应孔膜的制备方法与流程

本发明属于免疫诊断技术领域，具体涉及一种T细胞斑点试验的预包被反应孔膜的制备方法。

背景技术：

机体感染细菌病毒或者受到癌细胞刺激T淋巴细胞致敏，然后转化为记忆T淋巴细胞。当机体再次接触同一种抗原后，会迅速产生特异性免疫反应包括效应T淋巴细胞反应，并产生IFN-γ等细胞因子。目前的T细胞斑点检测技术就是首先将一种抗细胞因子的抗体包被于PVDF孔膜(例如96孔PVDF膜)，然后在孔膜中加入待检测人群的外周血淋巴细胞以及特异性的抗原，当细胞因子释放的时候，可以被包被好的抗体所捕获。所捕获的细胞因子可以被第二个识别该细胞因子的单克隆抗体识别，经过底物显色后，加有受感染人群的淋巴细胞的PVDF孔膜的孔底会出现数量不等的斑点，这些斑点代表受抗原刺激后产生了IFN-γ等细胞因子的T细胞。

T细胞斑点检测技术已经广泛用于筛选T细胞特异性表位等科研研究。此外该技术已经成功地用于结核的感染的诊断。该方法特异性、灵敏度高，对于结核感染，尤其是自然感染和卡介苗接种等潜伏感染的诊断也具有很强的特异性。代表产品是T-SPOT.TB试剂盒(Oxford Immunotec Limited,Abingdon,United Kingdom)，该试剂盒利用以结核特异性的早期分泌靶向抗原(ESAT-6)和10KD培养滤过蛋白(CFP-10)为抗原，通过检测外周血中是否有能被这些抗原刺激而释放γ干扰素的T淋巴细胞来诊断结核的感染。

截止目前为止，无论是科研还是诊断用的T细胞斑点试验，抗原都是在加 完外周血淋巴细胞后以液态形式加入到反应孔中的。抗原可以是蛋白质也可以是含有T细胞表位的多肽，但是两者液态状态下稳定性有限。尽管冻干的形式对于蛋白质和多肽抗原的保存时非常有利的。但是临床检验来说，把ELISPOT的抗原做成冻干形式增加了一个操作步骤，提高了诊断误差，也增加了生产成本。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种T细胞斑点试验的预包被反应孔膜的制备方法，抗原和抗体共包被后，制备出一种操作简单、保存时间长，且特异性、敏感性和液态抗原加入刺激效果一致的抗原抗体包被孔膜。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种T细胞斑点试验的预包被反应孔膜的制备方法，包括以下步骤：

(1)预包被抗体：将PVDF孔膜检测条安装到孔板框上，每孔加入乙醇，对PVDF孔膜活化后，除去乙醇，并用PBS溶液洗涤；

(2)用PBS溶液对抗体稀释，使每孔中含有抗体10μl，对抗体进行包被过夜，然后用PBS溶液洗涤；

(3)用含有血清的培养基封闭孔膜；

(4)预包被抗原：在预设的检测孔内加入抗原，在预设的阳性对照孔内加入植物凝集素，在预设的阴性对照孔内加入等体积的PBS缓冲液；

(5)将上述处理过的抗原抗体包被板进行真空干燥处理，密封保存。

优选的，步骤(1)中每孔加入体积含量为70％的乙醇，步骤(2)中于4℃条件下对抗体进行包被过夜，步骤(3)中用含有体积分数为10％小牛血清的R1640培养基封闭孔膜。

优选的，步骤(4)中在预设的抗原孔中加入的抗原为结核ESAT-6/CFP-10 重组串联肽，步骤(5)中真空干燥条件为25℃干燥10min。

采用上述技术方案后，本发明具有以下积极效果：

本发明的目的就是要改变传统的抗原加入方法，抗原和抗伽马干扰素抗体共包被后，制备出一种操作简单、保存时间长，且特异性、敏感性和液态抗原加入刺激效果一致的抗原抗体包被孔膜，用于结核诊断。由于使用该板减少了操作步骤，因此可以减少人为误差，实现操作的标准化，产品便于商品化和广泛推广应用。本方案实施后，可为生产单位创造出巨大的经济效益，如能被其他疾病的ELISPOT诊断所借鉴，将会对ELISPOT技术的发展及应用起到推动作用。

附图说明

图1为待检测病人的检测结果；

图2为液态抗原和真空干燥抗原放置不同时间后SDS-PAGE分析结果。

其中，1、阴性对照孔，2、检测孔一，3、检测孔二，4、阳性对照孔，Ⅰ、液态抗原，Ⅱ、干燥抗原。

具体实施方式

一、结核ESAT-6/CFP-10重组串联肽的制备

根据ESAT-6和CFP-10蛋白的氨基酸顺序设计重组串联肽。重组串联肽蛋白由一系列25-35个氨基酸多肽相连组成，相邻二个多肽有9-11个氨基酸是完全重叠相同，重叠肽之间由相同的组织酶切S偏爱序列位点(Leu-Arg-Met-Lys)连接。编码DNA由GeneArt公司在人工合成后，克隆到pET28载体中，并转化BL21(DE3)大肠杆菌后，在37℃条件下在LB培养基中培养到OD600＝1，加入0.2mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)并将培养温度调节到20℃诱导蛋白表达，诱导时间为16小时；在LB培养液中进行IPTG诱导表达。于4000rpm 离心，收集菌体，并在含有8M尿素的磷酸缓冲液中重悬。而后超声破菌，15000转/min高速离心后收取上清。上清以1ml/min的流速通过Ni-NTA柱，重组重叠肽蛋白结合到Ni-NTA柱，经过充分的洗涤去掉杂蛋白后，重组重叠肽被含有6M尿素以及250mM的咪唑洗脱缓冲液洗脱下来。洗脱的蛋白质首先用含有精氨酸的PBS(pH9.5)稀释8倍，除菌后，加入到15KDa的蛋白浓缩管(millipore)中，3500rpm离心浓缩到2mg/ml，待用。

二、T细胞斑点试验的预包被反应孔膜的制备

(1)预包被抗体：将PVDF孔膜检测条安装到96孔板框上，每孔加入体积含量为70％的乙醇，室温放置1分钟对PVDF孔膜活化后，除去乙醇，并用PBS溶液洗涤四次；

(2)用PBS溶液对抗体稀释，使每孔中含有抗体10μl，对抗体于4℃条件下进行包被过夜，然后用PBS溶液洗涤；

(3)用含有体积比为10％小牛血清的R1640培养基封闭孔膜；

(4)预包被抗原：在预设的检测孔一2、检测孔二3内加入抗原结核ESAT-6/CFP-10重组串联肽，检测孔一2中加入的量为12.5μg，检测孔二3中加入的量为25μg，在预设的阳性对照孔4内加入植物凝集素PHA，在预设的阴性对照孔1内加入等体积的PBS缓冲液；

(5)将上述处理过的抗原抗体包被板于25℃条件下进行真空干燥处理10min，4℃密封保存。

三、T细胞斑点试验的预包被反应孔膜的检测

1.检测方法

(1)外周血淋巴细胞的制备：在离心管中加入Ficoll-Hypaque(聚蔗糖-泛影葡胺)，将采集的待检测的血液加在Ficoll-Hypaque的上层，离心处理，吸出 位于界面处的淋巴细胞，用无血清RPMI1640培养基洗涤，所得淋巴细胞用含有10％小牛血清及50单位的青霉素、链霉素的RPMI1640培养基悬浮；

(2)将上述淋巴细胞加入到阴性对照孔1、阳性对照孔4和检测孔一2和检测孔二3中，每孔加入100μl；

(3)在孔膜中加入100μl含有0.5％的BSA(牛血清白蛋白)、1μg/μl的Biotin-检测抗体(生物素-检测抗体)，放置一段时间；

(4)用含有PBS缓冲液的吐温-20对Biotin-检测抗体洗涤，然后每孔中加入100μl链亲和素-ALP，放置一段时间后，用PBS-吐温-20洗涤；

(5)加入100μl显色液室温放置，直至阳性对照孔4中的斑点明显出现后，用清水冲洗终止反应，干燥后观察各孔中斑点情况。

2.结核感染阴阳性判断标准

a.若阳性对照孔4正常，空白对照孔1斑点为0-5个时，检测孔一2或检测孔二3的斑点数-空白对照孔4的斑点数≥6时，表示发生了结核感染，为阳性；

b.若空白对照孔1斑点数为6-10个，检测孔一2或检测孔二3的斑点数≥2x空白对照孔1斑点数，表示发生了结核感染，为阳性；

c.若阳性对照孔4结果正常，检测孔一2或检测孔二3均达不到阳性的判断标准，则表示未发生结核感染，为阴性。

3.检测结果

取一个待检测病人的外周血，分别用A、B、C三种抗原抗体检测，其中A列孔使用新鲜包被抗体以及新鲜的溶液态ESAT-6/CFP-10重组重叠肽抗原用于结核的检测；B列孔使用37℃放置72h的抗原抗体预先包被孔膜用于结核的检测；C列孔使用37℃放置10天的抗原抗体预先包被孔膜用于结核的检测。采用上述检测方法进行结核病检测，检测结果如图1所示。由此可知，A、B、C 均表示该病人感染过结核。

四、真空干燥抗原与液态抗原的稳定性比较

将10μl的结核ESAT-6/CFP-10重组串联肽抗原溶液加入到0.5ml的微量离心管中，放入真空干燥器内，常温抽真空10min。取出样品放入37℃恒温箱内，每隔一段时间取出一管，加入20μl水悬浮，离心后取10μl上清，SDS-PAGE电泳分析。同时将同等浓度的抗原溶液放在37℃恒温箱内，取出干燥抗原的同时间，取10μl抗原溶液，加入10μl水后，取10μl进行SDS-PAGE电泳分析。如图2显示，Ⅰ表示液态抗原，Ⅱ表示真空干燥抗原，干燥抗原Ⅱ于37℃放置24h、72h没有任何变化。而液态抗原Ⅰ于37℃放置24h大部分降解，72h候后抗原完全降解。表明抗原以液态形式保存的稳定性差，以真空干燥形式保存时间长，稳定性好。

对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明要求的保护范围之内。