含乳饮料中γ‑氨基丁酸和16种蛋白水解氨基酸同时检测的专用高精度高效液相色谱方法与流程

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含乳饮料中γ‑氨基丁酸和16种蛋白水解氨基酸同时检测的专用高精度高效液相色谱方法与流程
含乳饮料中γ-氨基丁酸和16种蛋白水解氨基酸同时检测的专用高精度高效液相色谱方法技术领域本发明属于氨基酸检测技术领域,具体为含乳饮料中γ-氨基丁酸和16种蛋白水解氨基酸同时检测的高效液相色谱方法。

背景技术:
γ-氨基丁酸(GABA)是一种天然存在的非蛋白质氨基酸,是哺乳动物中枢神经系统的抑制性传递物质,是脑组织中最重要的神经递质之一。它能够结合抗焦虑的脑受体并使之激活,然后与另外一些物质协同作用,阻止与焦虑相关的信息抵达脑中枢,能够降低神经元活性,舒缓人们的不安、压力、疲倦、忧虑等状况。2009年卫生部批准GABA为新资源食品,以L-谷氨酸为原料经希氏乳杆菌发酵制成,可应用于饮料及糖果、膨化食品等中。乳品作为人们普遍食用的消费品之一,GABA与牛奶的结合,能够使人们很好地在补充日常营养所需的同时缓解压力、减少不安。针对γ-氨基丁酸,现行轻工行业标准QB/T4587-2013《γ-氨基丁酸》的规范性附录中提供了γ-氨基丁酸含量检测方法;张晖等(2003)采用OPA柱前自动衍生测定了米胚芽中的γ-氨基丁酸;涂云飞等(2012)采用柱前衍生高效液相色谱法测定茶叶中的γ-氨基丁酸;胡雪莲等(2015)采用高效液相色谱法测定了黑莓果汁及黑莓啤酒中的γ-氨基丁酸。针对氨基酸检测,现行国家标准GB/T5009.124-2003《食品中氨基酸的测定》,用于测定食品中16种氨基酸,但是采用全自动氨基酸分析仪。这些方法或是对米胚芽、茶叶、黑莓果汁和啤酒中的γ-氨基丁酸进行检测,或是对食品中16种氨基酸的检测,对含乳饮料中γ-氨基丁酸和16种蛋白水解氨基酸同时检测的快速准确的分析检测方法还鲜见报道。因此,开展含乳饮料中γ-氨基丁酸和16种蛋白水解氨基酸同时检测方法的研究工作,对提高产品品质、加强监督具有重要的意义。

技术实现要素:
本发明要解决的技术问题是提供一种含乳饮料中γ-氨基丁酸和16种蛋白水解氨基酸同时检测的专用高精度高效液相色谱方法,具有极高的灵敏度和优越的稳定性。为解决上述技术问题,本发明所采取的技术方案如下。含乳饮料中γ-氨基丁酸和16种蛋白水解氨基酸同时检测的专用高精度高效液相色谱方法,设定样品水解、衍生处理、上柱检测三个操作步骤,然后针对含乳饮料的特性设定上述三操作步骤所使用的处理试剂及试剂用量及处理参数,使得上述三操作步骤的工艺参数相互严密配合,实现对含乳饮料中γ-氨基丁酸和16种蛋白水解氨基酸的一步式高精度检测。作为本发明的一种优选技术方案,该检测方法包括如下步骤:A、制备含乳饮料水解样品:取含乳饮料置于水解管中,加入盐酸和苯酚后随即冷冻处理,然后充入惰性气体并拧紧水解管螺盖,再将水解管放入恒温干燥箱进行充分水解,然后将水解液取出过滤,取滤液干燥蒸干,再次用盐酸溶解并精滤到高效液相色谱的进样瓶中;B、水解样品的自动柱前衍生处理:在室温条件下,吸收步骤A所得样品并与和硼酸缓冲液、邻苯二甲醛混匀,再吸取9-芴基甲基氯甲酸酯混匀,准备上样;C、高效液相色谱检测γ-氨基丁酸和16种氨基酸的含量:高效液相色谱的分离条件为,色谱柱:通用的C18液相色谱柱;柱温:40℃;流动相A:纯水中加入结晶乙酸钠混匀,调pH调后加入四氢呋喃;流动相B:纯水中加入结晶乙酸钠混匀,调pH后加入乙腈和甲醇混匀;梯度洗脱条件设定如下:序号时间(min)流动相A%流动相B%流速(mL/min)10.00100-900-100.8-1.1227.535-4555-650.8-1.1331.501001.3-1.643201001.3-1.653401000.8-1.1635.5100-900-100.8-1.1检测条件设定如下:检测器采用二极管阵列或紫外检测器;0-25min,设定检测波长338nm;25-32min,设定检测波长262nm;32-35.5min,设定检测波长338nm。作为本发明的一种优选技术方案,该检测方法包括如下步骤,下述步骤中涉及的重量份均以克为单位计算,涉及的体积份均以毫升为单位计算:A、制备含乳饮料水解样品:取含乳饮料1重量份置于水解管中,加入浓盐酸1-3体积份或加入6mol/L盐酸10-15体积份,再加入新蒸馏的苯酚3-4滴,将水解管放入冷冻剂中,冷冻3min-5imn,充入高纯氮气并在充氮气状态下拧紧螺盖,将水解管放入109-111℃的恒温干燥箱中,水解20-30小时后取出冷却,打开水解管,将水解液全部过滤转移到容量瓶中,取滤液1-2体积份用真空干燥器在40℃-50℃干燥,蒸干,用0.5-2体积份0.1mol/L的盐酸溶解,然后采用0.2µm-0.8µm的滤膜过滤到高效液相色谱进样瓶中;B、水解样品的自动柱前衍生处理:在室温条件下,吸收步骤A所得样品0.5-2体积份,吸取硼酸缓冲液3-7体积份,吸取邻苯二甲醛0.5-2体积份,混匀,再吸取9-芴基甲基氯甲酸酯0.5-2体积份,混匀,准备上样;C、高效液相色谱检测γ-氨基丁酸和16种氨基酸的含量:高效液相色谱的分离条件为,色谱柱:通用的C18液相色谱柱;柱温:40℃;流动相A:1000体积份纯水中加入4-8重量份结晶乙酸钠,混匀,pH调为7.15-7.25,再加入3-5体积份四氢呋喃;流动相B:400体积份纯水中加入6-12重量份结晶乙酸钠,混匀,pH调为7.15-7.25,再加入600-1000体积份乙腈和600-1000体积份甲醇,混匀;梯度洗脱条件设定如下:序号时间(min)流动相A%流动相B%流速(mL/min)10.00100-900-100.8-1.1227.535-4555-650.8-1.1331.501001.3-1.643201001.3-1.653401000.8-1.1635.5100-900-100.8-1.1检测条件设定如下:检测器采用二极管阵列或紫外检测器;0-25min,设定检测波长338nm;25-32min,设定检测波长262nm;32-35.5min,设定检测波长338nm。作为本发明的一种优选技术方案,该检测方法包括如下步骤,下述步骤中涉及的重量份均以克为单位计算,涉及的体积份均以毫升为单位计算:A、制备含乳饮料水解样品:取含乳饮料1重量份置于水解管中,加入浓盐酸2体积份或加入6mol/L盐酸12体积份,再加入新蒸馏的苯酚3滴,将水解管放入冷冻剂中,冷冻4imn,充入高纯氮气并在充氮气状态下拧紧螺盖,将水解管放入110℃的恒温干燥箱中,水解24小时后取出冷却,打开水解管,将水解液全部过滤转移到25mL容量瓶中,取滤液1.5体积份用真空干燥器在45℃干燥,蒸干,用1体积份0.1mol/L的盐酸溶解,然后采用0.45µm的滤膜过滤到高效液相色谱进样瓶中;B、水解样品的自动柱前衍生处理:在室温条件下,吸收步骤A所得样品1体积份,吸取硼酸缓冲液5体积份,吸取邻苯二甲醛1体积份,混匀,再吸取9-芴基甲基氯甲酸酯1体积份,混匀,准备上样;C、高效液相色谱检测γ-氨基丁酸和16种氨基酸的含量:高效液相色谱的分离条件为,色谱柱:通用的C18液相色谱柱;柱温:40℃;流动相A:1000体积份纯水中加入6重量份结晶乙酸钠,混匀,pH调为7.15-7.25,再加入4体积份四氢呋喃;流动相B:400体积份纯水中加入9重量份结晶乙酸钠,混匀,pH调为7.15-7.25,再加入800体积份乙腈和800体积份甲醇,混匀;梯度洗脱条件设定如下:序号时间(min)流动相A%流动相B%流速(mL/min)10.00100-900-100.8-1.1227.535-4555-650.8-1.1331.501001.3-1.643201001.3-1.653401000.8-1.1635.5100-900-100.8-1.1检测条件设定如下:检测器采用二极管阵列或紫外检测器;0-25min,设定检测波长338nm;25-32min,设定检测波长262nm;32-35.5min,设定检测波长338nm。作为本发明的一种优选技术方案,步骤C中所述的C18液相色谱柱选用XBridgeC18色谱柱、HypersilODSC18色谱柱。本发明检测得到的γ-氨基丁酸和16种标准氨基酸衍生物色谱图,出峰顺序依次为:(1)Asp,天门冬氨酸;(2)Glu,谷氨酸;(3)Ser,丝氨酸;(4)His,组氨酸;(5)Gly,甘氨酸;(6)Thr,苏氨酸;(7)Arg,精氨酸;(8)Ala,丙氨酸;(9)GABA,γ-氨基丁酸;(10)Tyr,酪氨酸;(11)Val,缬氨酸;(12)Met,蛋氨酸;(13)Phe,苯丙氨酸;(14)Ile,异亮氨酸;(15)Leu,亮氨酸;(16)Lys,赖氨酸;(17)Pro,脯氨酸。采用上述技术方案所产生的有益效果在于:本发明针对含乳饮料的特性研制了专用的处理试剂及试剂用量及处理参数,使得检测步骤的工艺参数相互严密配合,实现了对含乳饮料中γ-氨基丁酸和16种蛋白水解氨基酸的一步式高灵敏度、高稳定性的检测,对提高乳制品产品品质和加强监督具有重要的实际意义。申请人针对本发明的检测方法进行了系列试验。参看附图1、2(图1是γ-氨基丁酸和16种标准氨基酸的分离谱图;图2是实施例1中含乳饮料中γ-氨基丁酸和16种蛋白水解氨基酸的分离谱图),可见本发明的检测方法能够实现对含乳饮料中γ-氨基丁酸和16种蛋白水解氨基酸的一步式同时检测,分离图谱十分清晰和可靠。同时,申请人的系列试验显示本检测方法稳定性极高。利用其检测含乳饮料中γ-氨基丁酸和16种蛋白水解氨基酸含量,检测限为1.10pmol/µL-3.86pmol/µL,RSD分别为3.62%-8.51%和2.56%...
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