本申请依据35U.S.C.§119(e)要求于2014年5月13日提交的美国临时专利申请序列号61/992,814和2015年3月13日提交的美国临时专利申请序列号62/132,989的优先权，通过引用将其每个的全部内容结合于本文中。
技术领域：
本发明涉及生物分子组成(biologicalmoleculecomposition)的分析，以及特别涉及利用固态纳米孔的生物分子组成的选择性检测和量化。
背景技术：
：免疫沉淀和拉下试验是生物化学中的主要方法。通过区分非均匀混合物中的具体基质的能力，它们在包括蛋白质组学、表观基因组学和转录组学的广泛领域中起到重要作用。然而，尽管它们的实用性广泛，但是这些得到确定的策略具有局限性。除了要求大样本尺寸之外，它们是劳动密集型的且不能固有地量化，一般要求随后的PCR或提纯用于下游分析。出于这些原因，利用单分子灵敏度的量化技术可提供重要的优势。技术实现要素：一方面，本文描述了用于生物分子组成的选择性检测和量化分析的方法。本文所描述的方法包括提供包含与易位试剂(translocatingagent)络合的生物分子和非络合的生物分子的混合物。使混合物与包括至少一个纳米孔的膜接触，并穿过纳米孔施加电场以通过至少一个纳米孔易位与易位试剂络合的生物分子，其中，选择性检测络合的生物分子的易位。在一些实施方式中，本文所描述的方法进一步包括在络合的生物分子的一个或多个易位事件期间测量通过纳米孔的电流的变化。此外，该方法可以进一步包括测量络合的生物分子的易位事件的频率(速率，rate)和由易位事件的频率确定络合的生物分子的浓度。重要地，可以从溶液中回收易位的络合的生物分子，从而将其从初始混合物的非络合的生物分子中分离出来。适用于根据本文所描述的方法的分析的生物分子包括核酸和蛋白质。在一些实施方式中，例如，生物分子包括单链和双链脱氧核糖核酸(DNA)以及核糖核酸(RNA)和具有链内双螺旋的RNA。在以下详细描述中更加详细地描述了这些和其它实施方式。附图说明图1示出了根据本文所描述的一个实施方式的生物分子组成分析的方法。图2示出了根据本文所描述的一些实施方式在相同的化学计量范围内与电泳迁移试验相比的在各种电场电压下络合的生物分子易位事件频率(translocationeventrate)。图3示出了根据本文所描述的一个实施方式的最高达1:1摩尔比的易位试剂和络合的生物分子的络合的生物分子事件频率。图4示出了根据本文所描述的一个实施方式相对于易位事件频率的络合的生物分子浓度的量化。图5示出了根据本文所描述的一个实施方式的易位事件频率与络合的易位试剂和非络合的易位试剂的施加电压的关系。图6示出了根据本文所描述的一个实施方式的易位事件频率与络合的易位试剂、非络合的易位和未络合的单链核酸的施加电压的关系。图7示出了根据本文所描述的一个实施方式的易位事件频率与络合的ds-DNA和非络合的ds-DNA的施加电压的关系。图8示出了根据本文所描述的一个实施方式相对于络合的生物分子浓度的易位事件频率。图9示出了根据本文所描述的一个实施方式相对于ds-DNA长度的易位事件频率。具体实施方式通过参考以下详细描述和实施例和它们的以上和以下描述可以更容易地理解本文所描述的实施方式。然而，本文所描述的元件、设备和方法并不限于在详细描述和实施例中提供的具体实施方式。应当认识到，这些实施方式仅仅说明了本发明的原理。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，对于本领域的技术人员许多修改和调整将是显而易见的。一方面，本文描述了用于生物分子组成的选择性检测和量化分析的方法。本文所描述的方法包括提供包含与易位试剂络合的生物分子和非络合的生物分子的混合物。使混合物与包括至少一个纳米孔的膜接触，并穿过纳米孔施加电场以通过至少一个纳米孔易位与易位试剂络合的生物分子，其中，选择性检测络合的生物分子的易位。在一些实施方式中，本文所描述的方法进一步包括在络合的生物分子的一个或多个易位事件期间测量通过纳米孔的电流的变化。此外，该方法可以进一步包括测量络合的生物分子的易位事件的频率和由易位事件的频率确定络合的生物分子的浓度。重要地，可以从溶液中回收易位的络合的生物分子，从而将其从初始混合物的非络合的生物分子中分离出来。现在转向具体步骤，本文所描述的方法包括提供包含与易位试剂络合的生物分子和非络合的生物分子的混合物。根据本文所描述的方法可以选择性检测和量化与本发明的目的不相矛盾的任何生物分子。适用于根据本文所描述的方法的分析的生物分子包括核酸。在一些实施方式中，例如，生物分子包括ss-DNA、ds-DNA以及RNA和具有链内双螺旋的RNA。RNA可以包括mRNA、miRNA、rRNA、tRNA、tmRNA、aRNA或它们的混合物。核酸可以具有与本发明的目的不相矛盾的任何期望数目的核苷酸。在一些实施方式中，例如，用于分析的核酸具有25至1000个核苷酸。另外，核酸可以具有选自表I的核苷酸数。表I-核酸长度核苷酸100-600200-500250-40050-300100-2001-500混合物中的核酸可以源自真核的、原核的和/或病毒来源。进一步地，生物分子可以包括核酸片段或寡核苷酸。根据本文所描述的方法可以选择性检测和量化不与本发明的目的相矛盾的任何长度的寡核苷酸。进一步地，用于分析的生物分子可以包括单个核苷酸和/或它们的衍生物。除核酸之外，适用于根据本文所描述的方法分析的生物分子包括蛋白质。在本文所描述的方法中可以采用不与本发明的目的相矛盾的任何蛋白质。如本文所描述的，混合物中的生物分子与易位试剂选择性络合。易位试剂是具有足够的电荷和/或结构以允许通过施加电压设定的施加电场选择性检测络合的生物分子的易位的化学物质。在一些实施方式中，例如，易位试剂是生物分子，包括蛋白质、核酸或核酸片段。生物分子可以处于天然存在的状态。可替换地，可以改性生物分子以表明特异性结合、合适的电荷和/或结构以允许选择性检测络合的生物分子易位。在一些实施方式中，易位试剂包括用亲和标记物改性的单链核酸，所述亲和标记物用于在络合的生物分子的易位之前结合一种或多种分子物质。例如，易位试剂可以包括已知具体序列的单链核酸，其中，单链核酸是用蛋白质标记物改性的。在与易位试剂络合的生物分子易位之前，蛋白质标记物可以结合生物分子的混合物中的合适的蛋白质。在一个实施方式中，生物素化单链核酸的易位试剂，用于在互补序列的靶核酸的易位之前结合链霉亲和素。在其他实施方式中，易位试剂是非生物的化学物质，如纳米颗粒。可以采用不与本发明的目的相矛盾的任何纳米颗粒。纳米颗粒例如可以包括有机纳米颗粒，包括碳纳米颗粒(碳纳米管、石墨烯、富勒烯等)。纳米颗粒也可以包括无机纳米颗粒如半导体纳米颗粒、陶瓷纳米颗粒和/或金属纳米颗粒。将易位试剂添加至生物分子混合物，且易位试剂选择性结合生物分子以提供络合的生物分子。不与易位试剂选择性结合的生物分子形成混合物中的非络合的生物分子。为了络合用于选择性易位检测的生物分子，易位试剂可以包含位点特异性结合区域。根据待络合的生物分子的身份，位点特异性结合区域可以是结合DNA或RNA的结构域。例如，在一些实施方式中，保证(warranting)使用结合核酸的结构域，易位试剂可以直接结合至核酸。单链核酸易位试剂可以选择性地与生物分子的混合物中的互补序列的靶单链核酸混合。易位之前的选择性混合可以允许量化混合物中的靶单链核酸。在一些实施方式中，可以使用不同序列的多种单链核酸易位试剂来识别混合物中的若干靶单链核酸的存在和/或将其量化。例如，可以在易位试剂中采用高度保守的序列，允许识别混合物中的具体物质，如各种细菌物质。还可以监测同源性，其中在分析结果中记录了一个或多个碱基对不匹配的地方。进一步地，通过采用单链核酸易位试剂可以阐明DNA熔融和/或退火特征。单链形式(未与易位试剂络合)和双链形式(与易位试剂络合)之间的转变可以暂时性地与易位事件有关。可替换地，位点特异性结合区域可以是结合蛋白质的结构域。在其他实施方式中，可以向核酸提供用于结合易位试剂的亲和标记物，从而保证结合蛋白质的结构域。易位试剂通过几种机制(取决于络合的生物分子的身份)可以允许选择性检测络合的生物分子易位。在一些实施方式中，例如，感兴趣的生物分子在选定的施加电场条件下和/或其他溶液条件下不具有足够的电荷来易位通过纳米孔。在这种实施方式中，易位试剂向感兴趣的生物分子提供足够的电荷以在选定的施加电场和/或其他溶液条件下经历易位。因此，可以选择性检测络合的生物分子的易位，因为混合物中非络合的生物分子不能在选定的条件下易位。可替换地，感兴趣的生物分子具有高电荷并在纳米孔分析中采用的传统电子设备不可检测的频率下经历易位。例如，蛋白质往往在传统电子设备不可检测的频率下易位，从而致使纳米孔装置不适用于蛋白质检测和量化。在这种实施方式中，易位试剂可以具有足够的相反电荷和/或尺寸以减缓蛋白质易位频率，用于通过传统的纳米孔体系和电子设备检测和量化。类似地，单链核酸往往在传统电子设备不可检测的频率下易位，从而致使纳米孔装置不适用于核酸检测和量化。在这种实施方式中，采用具有与生物分子的混合物中的单链核酸靶互补的序列的单链核酸易位试剂。单链核酸易位试剂表现出允许检测与靶单链核酸形成的络合物的结构。如本文所描述的，可以用亲和标记物如蛋白质标记物改性单链核酸易位试剂，用于在络合的靶单链核酸易位之前结合一种或多种分子物质。进一步地，易位试剂可以提供可以与混合物中的其他物质充分区分开的易位频率或纳米孔停留时间。如本文所描述的，使包含与易位试剂络合的生物分子和非络合的生物分子的混合物与包括至少一个纳米孔的膜接触。在一些实施方式中，膜包括一排(anarrayof)纳米孔。膜可以具有与本发明的目的不相矛盾的任何厚度并可以由任何材料形成。在一些实施方式中，膜是非金属的。非金属膜可以包含一种或多种电气绝缘材料，包括陶瓷材料。合适的陶瓷包括金属氧化物、金属氮化物、金属碳化物或金属碳氮化物或它们的组合。在一些实施方式中，适用作膜的陶瓷是氮化硅(SiN，Si3N4)。另外，膜陶瓷可以包含氧化硅、碳化硅、氧化铝或过渡金属氧化物。在一些实施方式中，陶瓷膜在本质上是多晶的。在一些实施方式中，陶瓷膜在本质上是单晶的。此外，陶瓷膜可以是多层的。多层膜的各层可以包含相同的材料或不同的材料。在一些实施方式中，陶瓷膜的各层可以独立地选自由过渡金属碳化物、过渡金属氮化物、过渡金属碳氮化物、过渡金属氧化物、氧化铝、二氧化硅和氮化硅组成的组。进一步地，膜可以包含一种或多种半导体材料。在一些实施方式中，合适的半导体材料包括II/VI半导体、第IV族半导体或III/V半导体。在一些实施方式中，半导体材料包括三元半导体或四元半导体。合适的半导体材料可以具有无定形结构、晶体结构或它们的混合物。晶体半导体材料可以是多晶或单晶的。在一些实施方式中，膜是金属的。在这种实施方式中，膜可以是金属或金属的各种合金。在一些实施方式中，例如，合适的金属是过渡金属，包括贵金属如金。可替换地，在一些实施方式中，膜不是金。可以用本文所描述的方法中使用的介电或电气绝缘材料涂覆金属膜。在一些实施方式中，膜包含有机材料。例如，膜可以包含一种或多种聚合物材料。合适的聚合物材料包括热塑性塑料、热固性塑料或弹性体。在一些实施方式中，聚合物材料包含聚乙烯、聚丙烯和聚碳酸酯中的一种或多种。适用于在本文所描述的方法中使用的膜可以具有任何期望的厚度。在一些实施方式中，膜具有适用于检测和/或进行一种或多种核酸片段(包括单链核酸片段)的分析的厚度。在一些实施方式中，膜具有小于约200nm或小于约100nm的平均厚度。在一些实施方式中，膜具有根据表II的平均厚度。表II-纳米孔膜厚度(nm)膜厚度(nm)<501-3010-2020-5050-100100-500250-750进一步地，膜可以具有原子标度上的厚度。在一些实施方式中，膜具有小于1nm的厚度，如0.1nm至0.9nm。在一些实施方式中，在根据本文所描述的方法形成纳米孔之前，测量膜的厚度。另外，本文所描述的膜的纳米孔可以具有与本发明的目的不相矛盾的任何尺寸和形状。在一些实施方式中，例如，至少一个纳米孔具有大于约1nm或大于约5nm的直径。本文所描述的膜的纳米孔可以具有根据表III的直径。表III-纳米孔直径(nm)纳米孔直径>101-201-101-55-1010-1510-201.5-4进一步地，纳米孔可以具有与膜的平均厚度相同的厚度。因此，在一些实施方式中，纳米孔可以具有选自本文的表II的厚度。可替换地，纳米孔具有小于膜的平均厚度的厚度。此外，可以基于本文所描述的测量如与易位事件相关的电流测量的期望信噪比(SNR)选择纳米孔的直径和/或厚度。在一些实施方式中，易位事件的SNR对于较大直径的纳米孔较高，以及对于较小直径的纳米孔较低。另外，在一些实施方式中，基于期望的纳米孔中的易位物质的停留时间或期望的易位事件的持续时间选择纳米孔的直径和/或厚度。在一些实施方式中，易位事件的停留时间和/或持续时间对于较厚的纳米孔比对于较薄的纳米孔长。在一些实施方式中，停留时间是从纳米孔中初始电导系数下降直到其回到基准值所经过的时间。可以以不与本发明的目的相矛盾的任何方式形成本文所描述的膜。在一些实施方式中，例如，根据专利合作条约(PCT)申请公开WO2012/170499中所描述的方法形成膜，通过引用将其全部内容结合于此。如本文所描述的，穿过纳米孔施加电场以使与易位试剂络合的生物分子易位通过至少一个纳米孔，其中，选择性检测易位事件。可以根据不与本发明的目的相矛盾的任何施加电压设定电场。合适的施加电压例如可以在1mV至5V的范围内。在一些实施方式中，施加电压在10mV至1V或50mV至500mV的范围内。在一些实施方式中，本文所描述的方法进一步包括在络合的生物分子的一个或多个易位事件期间测量通过纳米孔的电流的变化。此外，该方法可以进一步包括测量络合的生物分子的易位事件的频率和由易位事件的频率确定络合的生物分子的浓度。在一些实施方式中，例如，络合的生物分子的浓度重要地，可以从溶液中回收易位的络合的生物分子，从而将其从初始混合物的非络合的生物分子中分离出来。在以下非限制性实施例中进一步示出了这些和其他实施方式。实施例1-双链DNA的选择性检测和量化在该实施例中详述了通过用于结合单价链霉亲和素(MS)易位试剂的生物素改性的ds-DNA的选择性检测和量化。图1示出了在该实施例中采用的单生物素化的ds-DNA的SS-纳米孔区分。在图1a中，穿过浸渍在电解液中的具有单个纳米孔的薄膜片(thin-filmmembrane)施加电偏压。这有助于分子(或分子络合物)通过孔的动电学易位，其每个可以产生离子电流事件。该技术分别用于测量各自在8μM和1μM浓度下的MS(图1b，左)和单生物素化的90bpds-DNA(bio90，图1b，中)。在50-200mV的范围内，针对任一分子识别了很少的事件。然而，当在测量之前以8:1(MS:bio90)的摩尔比一起温育MS和bio90时，观察到每单位时间易位事件数的显著升高(图1b，右)。混合物的事件频率一致大于比任一单独的构成分子的数量级大的数量级；例如在200mV施加电压下，MS-bio90络合物产生23.3±0.9s-1的频率，而MS和bio90各自的事件频率分别是0.09±0.04s-1和1.1±0.2s-1。为了验证MS-bio90事件对应于实际的易位而不是络合物和纳米孔之间的偶然相互作用，在测量期间反向施加电压的极性并观察再捕获事件(recaptureevent)。为了进一步探究该体系，进行一系列SS-纳米孔测量，其中，针对恒量(1μM)的bio90滴定MS。在所有探究的电压内，测量的事件频率急剧升高达到1:1的摩尔比(图2a)。然而，从一达到8:1(MS:bio90)的摩尔比，另外的MS没有进一步升高事件频率。这是限制供应形成核蛋白质络合物所需的ds-DNA的结果；蛋白质具有极低的频率(～10-5s-1)以及各种寡核苷酸仅包含单个生物素部分，所以预期以等摩尔浓度或在等摩尔浓度以上结合溶液中的几乎所有的bio90。比较易位结果与在相同化学计量范围内通过MS和bio90进行的电泳迁移试验(EMSA)，观察到惊人类似的趋势(图2b)。这些数据支持对于混合物观察到的实际上所有的易位事件对应于MS-bio90络合物的结论。通过对照测量提供了该方法高度特异性的另外证据，在对照测量中，与MS温育的非生物素化的dsDNA产生可忽略的事件频率，等于单独的bio90。改性的寡核苷酸的选择性量化：在图3中，检查最高达1:1的摩尔比的事件频率并发现与施加电压的线性相关性。这意味着针对MS-bio90络合物的捕获过程由扩散而不是由与孔的相互作用支配，这与之前的研究一致。重要地，观察到的趋势提供了量化溶液中的MS-bio90络合物的途径，因为事件频率可以随分子浓度改变。因为在本体系中观察到的几乎所有的事件唯一归因于络合物的易位，所以图3中的线性拟合将溶液中的MS-bio90的浓度与给定电压下产生的具体的事件频率联系起来。迄今在限于蛋白质的方案中进行了所描述的测量(MS:bio90<1:1)，所以测量的事件频率有助于未结合的bio90的背景下的MS-bio90络合物的量化。然而，原则上也可将相同的方法用于量化与非生物素化的DNA的多相溶液中的生物素化的寡核苷酸。为了探究这种可能性，在由第三者制备的两个样品上执行盲试。这些样品中的每个包含混合至1μM的总浓度(等于以上所描述的测量的总浓度)的生物素化的和非生物素化的90bpds-DNA的不同混合物。为了确保所有bio90络合，温育两份溶液与4μM的浓度的MS。如在之前的部分中描述的，单独的MS产生可忽略的可测量事件数，所以过多的蛋白质没有干扰测量。如所预期的，对于两个样品，SS-纳米孔分析显示了施加电压和事件频率之间的线性关系。比较由两个盲样得到的事件频率与现有的测量数据(图4)得出每个中对于bio90浓度的值：样品1中的850±35nM和样品2中的520±20nM。显著地，这些实验确定的浓度分别与800±20和480±20nM的预留值(preparedvalue)相当一致。这些结果表明我们的SS-纳米孔方法独一无二地能够选择性量化具有单核苷酸生物素变体的DNA，甚至在混合样品中。方法SS-纳米孔设备制作和电气测量使用在WO2012/170499中别处所描述的技术制作纳米孔。简要地，将扫描氦离子显微镜(CarlZeissOrionPlus)的波束聚集在硅支撑片中悬挂的氮化硅薄膜片(厚度30nm)上。将校准的暴露时间用于研磨具有7.3-7.7nm范围内直径的纳米孔。然后将包括单孔的支撑片定位在其中流体通向膜的两侧的定制流动池中。在流动池的任一侧引入测量溶液(900mMNaCl和6mMPBS缓冲液)，并将Ag/AgCl电极浸渍在该溶液中。使用电气测量(Axopatch200B)来验证设备表现出低RMS噪音(一般<20pA)和匹配校准的纳米孔直径的线性电流-电压特征。通过用包含生物分子的测量溶液置换设备的一侧的溶液进行易位测量。记录200kHz带宽下的电导系数并用四极贝塞耳滤波器在100kHz下过滤。通过定制软件进行分析，通过该软件我们将另外的25kHz的低通滤波器应用于所有测量。将用于分析的事件阈值设定在4标准偏差处，并仅考虑12-2000μs持续时间的事件。生物分子购买(集成DNA技术,Coralville,IA)具有以下序列的Bio90寡核苷酸：TGTATACCATGGCCAGGATCCTGGGCCATCTGGTATBGTAATTCATAAAGAATTCTCATTCTGCAGGTGCACATGTTAACACTAGTCGTGA。TB表示单个内部生物素化的dT。相对链(形成dsDNA)不包含改性的核苷酸。用于混合物(盲测)的非生物素化的寡核苷酸具有相同的序列但是不具有生物素部分。采用的链霉亲和素变体(SAe1D3)包含一个活性生物素结合位点且是由Howarth实验室(牛津大学)供应的。该突变体蛋白质(54.5kDa)保持与野生型链霉亲和素类似的结合亲和力和稳定性，并包含用于分离的六谷氨酸标记物，该六谷氨酸标记物在可比较的pH条件下赋予-17.1e的负电荷。电泳迁移率变动分析在室温下以0:1至8:1(MS:bio90)范围内的摩尔比温育MS与bio90持续20分钟。然后将混合物负载到含有用于可视化的溴化乙锭的1.5％琼脂糖凝胶上。将电泳单元的缓冲液储存器浸没在冰浴中以使蛋白质-DNA络合物的分解最小化。实施例2-双链DNA的选择性检测和量化表明由于通过两类DNA分子赋予的阻力的改变区分生物素化形式的dsDNA和ssDNA的能力。通过在MS存在下通过纳米孔分析34碱基对(bp)单生物素化的寡核苷酸的两个单链(ss)和双链(ds)变型表明了该效果。如图5所示，针对dsDNA-MS观察到事件频率的显著升高，且针对ssDNA-MS没有观察到提高。基于该结果，可以将生物素化的ssDNA采用为可以结合至生物分子的混合物中的其互补靶序列的序列特异性易位试剂。在包含同源序列的单链核酸和四种非同源ss-DNA序列的背景的混合物上测试34bp生物素化的ssDNA的序列特异性易位能力。将MS引入至混合物中并进行热循环以促进退火。图6示出了观察到生物素化的dsDNA-MS的混合络合物的易位位置的结果。重要地，没有观察到未络合的ss-DNA和未络合的生物素化的ss-DNA-MS易位试剂的易位。实施例3-ds-DNA的易位特征进行一系列SS-纳米孔测量，其中针对纳米孔施加电压和150bpds-DNA链的浓度，测量具有用生物素酶法标记的单羟基甲基胞嘧啶以及随后结合至MS的150bpds-DNA链的易位事件频率。纳米孔结构和操作参数与实施例1中提供的那些一致，其中施加电压在50-600mV范围内。图7示出了ds-DNA-生物素-MS易位事件频率随电压升高而升高的测试结果。为了比较，测试没有采用生物素-MS易位试剂构造的150bpds-DNA链，且其不能导致易位响应。还探测了易位事件频率与ds-DNA-生物素-MS浓度的相关性。如图8所示，在200mV的恒定施加电压下，易位事件频率通常随ds-DNA-生物素-MS浓度线性改变。图8的阴影部分表示本底噪声。还探究了易位事件频率与ds-DNA长度的相关性。如图9所提供的，易位频率表现出与ds-DNA长度的基本线性的相关性。通过建立的这些关系，本文所描述的方法提供了用于表征和量化生物分子(包括核酸)的有利工具。为实现本发明的各种目的，对本发明的各种实施方式进行了描述。应当认识到，这些实施方式仅仅说明了本发明的原理。在不违背本发明的精神和范围的情况下，对本领域的那些技术人员，许多的修改和调整将是易于显而易见的。当前第1页1 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