用聚合物捕获膜进行的单细胞捕获的制作方法

发明领域

本发明提供用于用聚合物捕获膜捕获单细胞的方法、系统、组件和制品。在某些实施方案中，聚合物捕获膜包括具有顶部和底部开口的多个单独通道，其中所述通道的尺寸经设计，以便单细胞：i)在向所述底部开口提供负压时，在所述通道内被捕获，从而部分地或基本上封闭所述通道；或ii)在向所述底部开口提供负压时，由所述顶部开口捕获，但未进入所述通道。在一些实施方案中，所述聚合物捕获膜的通道与多阱芯片的阱对齐，以便细胞或单细胞的内容物可转移至对应的阱。

背景

遗传学家正在努力表征复杂的疾病，如癌症、自身免疫病症和神经病症，但是找到驱动这些疾病的基本机制一直是难以捉摸的。在细胞一生中积累的体细胞突变、自发性变体是驱动疾病发作和复发的主要因素。随着细胞积累新的突变，它们形成与正常细胞共存的多克隆细胞群体。对大细胞群体进行测序可掩蔽这些独特的罕见细胞类型的潜在异质性，致使难以将所述细胞类型与正常种系突变区分开来。显示这些差异以及可视化克隆构造的最佳方式是对群体中的单独细胞进行测序。虽然单细胞测序可帮助揭开复杂疾病的机制，但是传统方法是昂贵的、劳动密集的，并且需要大的样品输入。需要的是例如易于与多阱装置一起使用的分离单细胞的方法。

发明概述

本发明提供用于用聚合物捕获膜捕获单细胞的方法、系统、组件和制品。在某些实施方案中，聚合物捕获膜包括具有顶部和底部开口的多个单独通道，其中所述通道的尺寸经设计，以便单细胞：i)在向所述底部开口提供负压时，在所述通道内被捕获，从而部分地或基本上封闭所述通道；或ii)在向所述底部开口提供负压时，由所述顶部开口捕获，但未进入所述通道。在一些实施方案中，所述聚合物捕获膜的通道与多阱芯片的阱对齐，以便细胞或单细胞的内容物可转移至对应的阱。

在某些实施方案中，本发明提供用于通过聚合物膜上的单独通道或点捕获单细胞的方法、系统、组件和制品。在某些实施方案中，聚合物膜具有能够使用特定尺寸和负压捕获单细胞的多个单独通道(例如，在多阱匹配模式中)。在其他实施方案中，聚合物膜具有能够捕获单细胞的多个单独亲水性点(例如，在多阱匹配模式中)。在某些实施方案中，在多阱匹配模式中所述聚合物膜和捕获的单细胞一起与具有匹配阱开口模式的多阱板或多阱芯片配对，以便捕获的细胞可分配于其中，从而允许各阱接收单细胞(例如，然后可将所述单细胞裂解，并且对核酸进行测序)。在某些实施方案中，采用例如附着到(例如，通过双面PCR相容性粘合剂)多阱装置并且与多阱装置对齐的尺寸排阻聚合物膜。在一些实施方案中，多阱通过装置设置有细胞尺寸的顶部开口和较大的底部开口(例如，被配置来接收反应组分)。在其他实施方案中，多阱装置通过使PCR相容性膜附着到多阱通孔芯片底部来产生。在另外的实施方案中，本文提供具有细胞尺寸的凹坑或阱(例如，各自含有单细胞)的捕获芯片，其可与具有多个阱的多阱装置配对，所述多个阱含有将分离和/或裂解所述单细胞的试剂。可将捕获芯片和多阱装置配对，以便所述芯片的凹坑与所述装置的阱对齐，然后处理，以便试剂从多阱装置的阱流到所述细胞尺寸的凹坑中的细胞，然后再次处理，以便处理过的细胞流入所述多阱装置的阱中。

在一些实施方案中，本文提供包括聚合物膜的制品，其中所述聚合物膜包括顶面、底面和延伸穿过所述聚合物膜的多个单独通道(例如，布置于多阱装置模式中)，其中每个所述单独通道：a)在所述聚合物膜的顶面具有顶部开口，b)在所述聚合物膜的底面具有底部开口，并且c)尺寸经设计，以便来自细胞悬液的一个细胞且仅有所述一个细胞：i)在向所述底部开口提供负压时，在所述单独通道内被捕获，从而部分地或基本上封闭所述单独通道；或ii)在向所述底部开口提供负压时，由所述顶部开口捕获，但未进入所述单独通道。在特定实施方案中，所述多个单独通道的顶部开口与多阱装置(例如，多阱板或多阱芯片)中的阱开口一对一匹配并且对齐。

在特定实施方案中，本文提供包括以下的系统或组件：a)聚合物膜，其包括顶面、底面和延伸穿过所述聚合物膜的多个单独通道，其中每个所述单独通道：i)在所述聚合物膜的顶面具有顶部开口，ii)在所述聚合物膜的底面具有底部开口，并且iii)尺寸经设计，以便来自细胞悬液的一个细胞且仅有所述一个细胞：A)在向所述底部开口提供负压时，在所述单独通道内被捕获，从而部分地或基本上封闭所述单独通道；或B)在向所述底部开口提供负压时，由所述顶部开口捕获，但未进入所述单独通道；以及b)多孔层，其包含允许液体但不允许细胞从中穿过的多孔材料，其中所述多孔层的尺寸被设计成与所述聚合物膜的底面接触，以便所述多个单独通道中的每个的底部开口由所述多孔材料覆盖。多孔层，其包含允许液体但不允许细胞从中穿过的多孔材料，其中所述多孔层的尺寸被设计成与所述聚合物膜的底面接触，以便所述多个单独通道中的每个的底部开口由所述多孔材料覆盖。

在另外的实施方案中，本文提供分离单细胞的方法，其包括：a)使细胞悬液与细胞分离系统接触，其中所述细胞分离系统包括：i)聚合物膜，其包括顶面、底面和延伸穿过所述聚合物膜的多个单独通道，其中每个所述单独通道：A)在所述聚合物膜的顶面具有顶部开口，B)在所述聚合物膜的底面具有底部开口，并且C)尺寸经设计，以便来自所述细胞悬液的一个细胞且仅有所述一个细胞：1)在向所述底部开口提供负压时，在所述单独通道内被捕获，从而部分地或基本上封闭所述单独通道；或2)在向所述底部开口提供负压时，由所述顶部开口捕获，但未进入所述单独通道；ⅱ)气动装置，其提供所述负压，其中所述气动装置包括界面表面，以及iii)多孔层，其包含允许液体但不允许细胞从中穿过的多孔材料，其中所述多孔层与A)所述聚合物膜的底面接触以便所述多个单独通道中的每个的底部开口由所述多孔材料覆盖；并且与B)所述气动装置的界面表面接触；b)用所述细胞分离系统孵育所述细胞悬液，其中所述气动装置提供所述负压，以便所述聚合物膜中的每个所述单独通道捕获来自所述细胞悬液的一个且仅有所述一个细胞，以便每个单独通道具有一个捕获的细胞；以及c)洗涤所述聚合物膜以将来自所述细胞悬液的非捕获的细胞移除，以便产生捕获的细胞聚合物膜。

在一些实施方案中，所述方法还包括将所述捕获的细胞聚合物膜和多阱装置(例如，多阱板或多阱芯片)组合在一起以产生一个组件，其中所述多阱装置具有多个阱开口，并且其中所述捕获的细胞聚合物膜的多个单独通道的顶部开口与所述多阱装置中的所述多个阱开口一对一匹配并且对齐。在特定实施方案中，所述方法还包括处理组件的步骤，以便将每个所述单独通道的一个捕获的细胞或每个所述单独通道的一个捕获的细胞的部分内容物转移到对应的多阱装置(例如，多阱板或多阱芯片)的阱开口中。在某些实施方案中，离心所述组件以将细胞从聚合物中释放到多阱装置，或停止负压和/或采用正压以释放所述细胞。

在某些实施方案中，捕获的细胞在与多阱装置接触之前在仍然处于聚合物上时裂解。在其他实施方案中，所述方法还包括将试剂添加到多阱装置中的每个阱开口的步骤，以便修饰一个捕获的细胞或一个捕获的细胞的内容物。在另外的实施方案中，所述试剂选自由以下组成的组：缓冲液、裂解缓冲液、聚合酶、测序试剂、蛋白酶和核苷酸。在特定实施方案中，一旦单细胞处于多阱装置中的多个阱中的每个中，用户或自动化系统(例如，来自WAFERGEN)就分配切口酶和聚合酶(例如，Pyrophage 3137聚合酶)的混合物和裂解缓冲液。然后将所述阱在约37℃下处理，然后在95℃下处理以激活切口酶，并且通过使用聚合酶来进行等温扩增。在某些实施方案中，所述细胞可替代地以加热方式裂解。然后将蛋白酶(例如，蛋白酶K)分配到阱中，在55℃下孵育(以消化聚合酶，诸如pyrophage 3137)，并且进行95℃的孵育以使蛋白酶失活。然后，可在各阱中进行基因特异性反应。

在另外的实施方案中，所述多个单独通道的顶部开口与多阱装置中的阱开口一对一匹配并且对齐。在另外的实施方案中，所述多个单独通道包含至少50、至少500、至少5000或至少50,000个单独通道(例如，至少50…100…687…1000…5000…7500…13,000…33,000…或50,000个单独通道)。在某些实施方案中，所述多阱装置中的所述阱开口各自的直径为约50μm至900μm(例如，50…100…300…500…700…900um)。

在一些实施方案中，所述多阱装置中的所述多个阱包含至少50、至少500、至少5000或至少50,000个单独阱(例如，至少50…100…687…1000…5000…7500…13,000…33,000…或50,000个单独阱)。

在另外的实施方案中，所述聚合物膜由疏水性聚合物构成。在某些实施方案中，所述疏水性聚合物包括聚酰亚胺、聚酯、聚乙烯、聚氨酯、TEFLON和/或PTFE(例如，所述疏水性聚合物为约20-30μm厚，具有3-5μm孔)。在其他实施方案中，所述聚合物膜的顶面包括疏水性涂层。在特定实施方案中，所述疏水性涂层包括选自由以下组成的组的材料：聚丙烯酸酯(例如，聚(丙烯酸丁酯)和聚(丙烯酸甲酯)、丙烯腈聚合物和共聚物(例如，聚丙烯腈)、马来酸酐共聚物(例如，聚(苯乙烯-共聚-马来酸酐))、甲基丙烯酸酯聚合物(例如，聚(甲基丙烯酸苄酯)和聚(甲基丙烯酸丁酯))、酰胺和酰亚胺(例如，尼龙)、碳酸酯(例如，聚(双酚A碳酸酯))、二烯(例如，聚丁二烯)、酯(例如，聚(1,4-丁烯琥珀酸酯))、醚(例如，聚(丙二醇))、氟碳化合物(例如，聚(四氟乙烯))、氟硅烷、烯烃(例如，聚乙烯)、苯乙烯(例如，聚苯乙烯)、乙烯醇缩醛(例如，聚(乙烯醇缩丁醛-共聚-乙烯醇-共聚-乙酸乙烯酯))、氯乙烯和偏二氯乙烯(例如，聚(氯乙烯))、乙烯酯(例如聚(乙酸乙烯酯))、乙烯醚和乙烯酮(例如，聚(乙基乙烯醚))、乙烯吡啶和乙烯吡咯烷酮聚合物(例如，聚(4-乙烯吡啶))、来自Lotus Leaf的HYDROFOE涂层和ACULON疏水性涂层。

在某些实施方案中，所述多孔材料选自由以下组成的组：刚性多孔泡沫、超高分子量聚乙烯(UHMWPE)、高密度聚乙烯(HDPE)、低密度聚乙烯(LDPE)、极低密度聚乙烯(VLDPE)、聚丙烯(PP)、乙烯乙酸乙烯酯(EVA)、聚苯乙烯(PS)、环氧玻璃和苯酚玻璃。在其他实施方案中，所述多孔材料为来自以下的材料：GENPORE(Morgantown,RD)、POREX(Fairburn,GA)或PERMAPLAS Corp.(Fayetteville,GA)。

在另外的实施方案中，每个所述单独通道的顶部开口的直径为约5μm至约80μm(例如，5…15…25…45….65…或约80um)。在某些实施方案中，所述单独通道为激光形成的通道(例如，使用UV激光钻孔或者CO2或准分子激光钻孔)。在其他实施方案中，光刻或等离子体蚀刻用来在聚合物膜中产生通道。在某些实施方案中，所述聚合物膜为约1平方厘米至约16平方厘米(例如，1…5…10…13…或16平方厘米)。

在某些实施方案中，所述系统还包括多阱装置(例如，多阱板或多阱芯片)，其中所述多个单独通道的顶部开口与所述多阱装置中的所述阱开口一对一匹配并且对齐。在其他实施方案中，所述聚合物膜的厚度在25μm与2mm之间(例如，25μm…75μm…500μm…1mm…2mm)。在其他实施方案中，所述多个单独通道中的每个均近似为圆柱形。

在一些实施方案中，每个所述单独通道的所述一个细胞选自由以下组成的组：血小板(约2μm直径)、红细胞(约3至8μm直径)、嗜中性粒细胞(约8-10μm直径)、淋巴细胞(约6-12μm直径)、外分泌细胞(约10μm直径)、成纤维细胞(约10-15μm直径)、骨细胞(约10-20μm直径)、软骨细胞或肝细胞(约20μm直径)、杯状细胞或纤毛细胞(约50μm长和5-10μm宽)、巨噬细胞(约20-80μm直径)、造血干细胞(约30-40μm直径)、填充有储存脂质的脂肪细胞(约70-120μm直径)以及神经元(约4-120μm直径)。在某些实施方案中，所述细胞为原核的或真核的。在一些实施方案中，所述细胞为哺乳动物细胞(例如，人细胞)。

在一些实施方案中，所述系统还包括c)提供负压的气动装置，其中所述气动装置包括界面表面，并且其中所述多孔层的尺寸被设计成与所述气动装置的界面表面接触。在其他实施方案中，所述气动装置包括高精度计，所述高精度计允许确定是否所有或基本上所有的单独通道部分地或基本上被细胞封闭。在其他实施方案中，所述多孔层与所述聚合物膜的底面和所述气动装置的界面表面接触。在特定实施方案中，所述气动装置被进一步配置来提供足以将所述一个细胞从每个单独通道中移去的正压。在其他实施方案中，所述细胞悬液包含100个与1x 10¹³个之间的细胞(例如，100…1000…1x10⁶…1x 10⁹…1x 10¹²和1x 10¹³)。

在某些实施方案中，本文提供包括聚合物膜的制品，其中所述聚合物膜包括顶面，其中除了布置于多阱模式中的多个单独亲水性点之外，所述顶面大部分或完全是疏水的，其中每个所述单独亲水性点的尺寸经设计，以便来自细胞悬液的一个细胞且仅有所述一个细胞由每个所述单独亲水性点捕获，并且其中所述多阱模式与多阱装置(例如，多阱板或多阱芯片)中的所述多个阱开口一对一匹配并且对齐。在特定实施方案中，所述亲水性点由聚多巴胺或相似材料构成(参见，以引用方式并入本文的Kang和Choi,Bull.Korean,Soc.,2013,34(8):2525-2527)。在其他实施方案中，所述单独亲水性点的直径为5-30μm(例如，约5…15…25…或约30μm)。

在某些实施方案中，本文提供包括以下的系统：a)多阱装置(例如，多阱板或多阱芯片)，其中所述多阱装置包括多个阱开口，以及b)包括顶面的聚合物膜，其中除了布置于多阱模式中的多个单独亲水性点之外，所述顶面是疏水的，其中每个所述单独亲水性点的尺寸经设计，以便来自细胞悬液的一个细胞且仅有所述一个细胞由每个所述单独亲水性点捕获，并且其中所述多阱模式与所述多阱装置中的所述多个阱开口一对一匹配并且对齐。

在特定实施方案中，本文提供包括以下的方法：a)使细胞悬液与细胞分离聚合物膜接触，其中所述细胞分离聚合物膜包括顶面，其中除了布置于多阱模式中的多个单独亲水性点之外，所述顶面是疏水的，其中每个所述单独亲水性点的尺寸经设计，以便来自细胞悬液的一个细胞且仅有所述一个细胞由每个所述单独亲水性点捕获，并且其中所述多阱模式与多阱装置(例如，多阱板或多阱芯片)中的所述多个阱开口一对一匹配并且对齐；b)用所述细胞分离聚合物膜孵育所述细胞悬液，以便每个所述单独亲水性点捕获来自所述细胞悬液的一个且仅有所述一个细胞，以便每个所述单独点具有一个捕获的细胞；以及c)洗涤所述细胞分离聚合物膜以将来自所述细胞悬液的非捕获的细胞移除，以便产生捕获的细胞聚合物膜。

在另外的实施方案中，所述方法还包括将所述捕获的细胞聚合物膜和多阱装置(例如，多阱板或多阱芯片)组合在一起以产生一个组件，其中所述多阱装置具有多个阱开口，并且其中所述捕获的细胞聚合物膜的单独亲水性点(各自具有捕获的细胞)与所述多阱装置中的所述多个阱开口一对一匹配并且对齐。在其他实施方案中，所述方法还包括处理组件的步骤，以便将每个所述单独亲水性点的一个捕获的细胞或每个所述单独亲水性点的一个捕获的细胞的部分内容物转移到对应的多阱装置(例如，板或多阱芯片)的阱开口中。例如，在某些实施方案中，离心所述组件以转移细胞，或者改变缓冲条件以允许所述细胞从所述亲水性点中释放。在特定实施方案中，所述细胞与多阱装置接触之前在聚合物膜上裂解。在一些实施方案中，所述方法还包括将试剂添加到多阱装置中的每个阱开口的步骤，以便修饰一个捕获的细胞或一个捕获的细胞的内容物。在其他实施方案中，所述试剂选自由以下组成的组：缓冲液、裂解缓冲液、聚合酶、测序试剂、蛋白酶和核苷酸。

在一些实施方案中，本文提供包括以下的系统：a)多阱通孔芯片，其具有顶面和底面；以及b)PCR相容性膜，其附着到或可附着到所述多阱通孔芯片的所述底面以产生具有多个阱的多阱装置，其中所述PCR相容性膜形成所述多个阱中的每个的底部。在特定实施方案中，所述细胞还包括尺寸排阻聚合物膜，其中所述尺寸排阻聚合物膜附着到所述多阱通孔芯片的所述顶面。

在某些实施方案中，本文提供包括以下的系统：a)包括多个阱开口的多阱装置；以及b)包括顶面的聚合物膜；其中除了布置于多阱模式中的多个单独亲水性点之外，所述顶面是疏水的，其中每个所述单独亲水性点的尺寸经设计，以便来自细胞悬液的一个细胞且仅有所述一个细胞由每个所述单独亲水性点捕获，并且其中所述多阱模式与所述多阱装置中的所述多个阱开口一对一匹配并且对齐；以及c)双面PCR相容性粘合剂，其中所述双面PCR相容性粘合剂使所述聚合物膜粘结到所述多阱装置。

在特定实施方案中，所述多阱装置由与PCR相容性膜组合的多阱通孔芯片形成，其中所述PCR相容性膜附着到所述多阱通孔芯片的底部，从而产生具有多个阱的多阱装置，其中所述PCR相容性膜形成所述多个阱中的每个的底部。

在某些实施方案中，本文提供包括基底的多阱通过芯片，所述基底在其中具有多个通孔，其中每个通孔具有顶部开口和底部开口，其中所述顶部开口的尺寸被设计来仅接收单细胞，并且其中所述底部开口具有比所述顶部开口大的直径。

在一些实施方案中，所述底部开口的直径比所述顶部开口大至少10％(例如，10％…25％…75％…100％…300％…1000％或更多)。在另外的实施方案中，所述基底包括硅、石英、玻璃或其任何组合。在另外的实施方案中，所述顶部开口的直径为2和50um(例如，2…24…40um或2-10um、2-20um、4-10；10-25；以及25-50um)。在其他实施方案中，所述底部开口的直径为100至800um(例如，100…450…600…或800um)。在某些实施方案中，所述基底的厚度为0.5mm至3.0mm(例如，0.5…1.0…2.0…2.6…3.0mm)。在另外的实施方案中，所述基底包括粘结到玻璃晶片的硅晶片。在一些实施方案中，所述顶部开口处于所述硅晶片中，并且所述底部开口处于所述玻璃晶片中。在另外的实施方案中，所述单细胞选自由以下组成的组：骨细胞、软骨细胞、神经细胞、上皮细胞、肌肉细胞、分泌细胞、脂肪细胞、红细胞、白细胞、血小板和凝血细胞。

在一些实施方案中，本文提供包括以下的方法：a)使本文描述的多阱通过芯片与含有细胞的溶液接触，以便单细胞进入所述多个通孔中的至少一些的顶部开口；b)将盖施加到所述多个通孔中的所述至少一些的顶部开口以产生具有多个阱的多阱装置，所述多个阱各自含有单细胞，其中所述盖形成所述多个阱中的每个的底部。在另外的实施方案中，所述方法还包括：将试剂添加到所述多个阱中的至少一些中，其中所述试剂用于进行生化反应。在其他实施方案中，所述试剂包含选自以下的药剂：裂解缓冲液、PCR引物、聚合酶及其组合。在另外的实施方案中，所述盖包括PCR相容性膜。

在某些实施方案中，本文提供包括以下的系统：a)包括基底的捕获芯片，所述基底包括各自允许从细胞混合物中捕获单细胞的多个细胞尺寸的凹坑或阱；以及b)包括多个阱的多阱芯片装置，其中所述多个细胞尺寸的凹坑或阱与所述多阱芯片中的所述多个阱一对一匹配并且对齐。

在特定实施方案中，所述细胞尺寸的凹坑或阱中的一些或所有各自含有单细胞。在一些实施方案中，所述多阱芯片中所述多个阱中的一些或所有均含有分离和/或裂解细胞的试剂。在另外的实施方案中，所述细胞尺寸的凹坑或阱中的一些或所有各自含有单细胞。在另外的实施方案中，所述细胞尺寸的凹坑或阱通过光刻来蚀刻。

在某些实施方案中，本文提供包括以下的方法：a)提供：i)包括基底的捕获芯片，所述基底包括各自允许从细胞混合物中捕获单细胞的多个细胞尺寸的凹坑或阱，其中每个所述细胞尺寸的凹坑或阱均含有单细胞；以及ii)包括多个阱的多阱芯片装置，其中所述多个细胞尺寸的凹坑或阱与所述多阱芯片中的所述多个阱一对一匹配并且对齐，其中所述多个阱中的每个均含有分离和/或裂解细胞的试剂；b)将所述捕获芯片和所述多阱芯片组合在一起以形成配对装置，以便所述捕获芯片的所述细胞尺寸的凹坑或阱与所述多阱装置的所述阱对齐；c)搅拌所述配对装置，以便所述多阱装置的所述阱中的所述试剂行进到所述细胞尺寸的凹坑或阱中，从而接触所述单细胞以产生处理过的细胞；以及d)搅拌所述配对装置，以便每个所述细胞尺寸的凹坑或阱中的处理过的细胞行进到对应的所述多阱装置的阱中。在一些实施方案中，所述搅拌包括提供离心力。

在特定实施方案中，所述多阱装置中所述多个阱中的至少一些的容积在0.1纳升与500纳升之间(例如，约0.1nl…0.9nl…1.5nl…5.0nl…10nl…20nl…35nl…50nl…75nl…100nl…150nl…300nl…450nl…500nl)。在特定实施方案中，所述多个阱中的至少一些的容积在1.0纳升与250纳升之间(例如，1-250nl、10-200nl、25-150nl、40-100nl或50-100nl)。在一些实施方案中，所述多个阱包括至少3个开口阱(例如，3…10…100…350…500…750…1000…1500…3000…5000…7500…10,000…15,000…20,000…30,000…45,000个或更多开口阱)。

在另外的实施方案中，多阱装置(例如，芯片)的长度为10mm至200mm(例如，10mm…50mm…100mm…150mm…或200mm)，宽度为10mm至200mm(例如，10mm…50mm…100mm…150mm…或200mm)，并且厚度为0.1mm至10厘米(例如，0.1mm…1.0mm…10mm…10cm)。在其他实施方案中，用于所述多阱装置的基底包括选自由以下组成的组的材料：玻璃、陶瓷、准金属、硅、硅酸盐、氮化硅、二氧化硅、石英、砷化镓、塑料和有机聚合材料。在另外的实施方案中，多阱装置(例如，芯片)还包括单独受控加热元件，所述单独受控加热元件中的每个均可操作地连接到阱。

在一些实施方案中，本公开提供包括聚合物捕获膜的制品，其中所述聚合物捕获膜包括顶面、底面和延伸穿过所述聚合物捕获膜的多个单独通道，其中每个所述单独通道：a)在所述聚合物捕获膜的顶面具有顶部开口，b)在所述聚合物捕获膜的底面具有底部开口，并且c)尺寸经设计，以便来自细胞悬液的一个细胞(例如，且仅有所述一个细胞)：i)在向所述底部开口提供负压时，在所述单独通道内被捕获，从而部分地或基本上封闭所述单独通道；或ii)在向所述底部开口提供负压时，由所述顶部开口捕获，但未进入所述单独通道。

在某些实施方案中，聚合物捕获膜包含惰性和/或疏水性聚合物(例如，聚酰亚胺、聚酯、聚乙烯、聚氨酯、TEFLON和/或PTFE)。在另外的实施方案中，所述制品还包括附着到聚合物捕获膜或与聚合物捕获膜成一体的至少一个膜导向部件(例如，在其中具有导向孔的瓣片或其他突出物)，其中膜导向部件被配置来允许使所述聚合物捕获膜中的所述多个单独通道与多阱装置中的阱和/或聚合物膜支撑板中的孔一对一对齐。在其他实施方案中，所述多个单独通道的顶部开口与多阱装置(例如，来自Wafergen Biosystems的SMARTCHIP)中的阱开口一对一匹配并且对齐。在另外的实施方案中，所述多个单独通道包括至少10…250…500…1000…5000…或30,000个单独通道。在另外的实施方案中，每个所述单独通道的尺寸经设计，以便当向底部开口提供负压时，来自细胞悬液的一个细胞(例如，且仅有所述一个细胞)由所述顶部开口捕获，但未进入所述单独通道。在其他实施方案中，所述聚合物膜的厚度在10μm与50μm之间(例如，10…20…40…或50μm)，并且所述顶面的面积在1cm²与30cm²之间(例如，1…20..25…或30cm²)。在另外的实施方案中，每个所述单独通道的直径为约2-10μm(例如，2…4…6…8…10μm)。

在某些实施方案中，本公开提供包括以下的系统：a)聚合物捕获膜，其包括顶面、底面和延伸穿过所述聚合物捕获膜的多个单独通道，其中每个所述单独通道：i)在所述聚合物捕获膜的顶面具有顶部开口，ii)在所述聚合物捕获膜的底面具有底部开口，并且iii)尺寸经设计，以便来自细胞悬液的一个细胞(例如，且仅有所述一个细胞)：A)在向所述底部开口提供负压时，在所述单独通道内被捕获，从而部分地或基本上封闭所述单独通道；或B)在向所述底部开口提供负压时，由所述顶部开口捕获，但未进入所述单独通道；以及b)第一部件，其选自由以下组成的组：i)多孔层，其包含允许液体但不允许细胞从中穿过的多孔材料，其中所述多孔层的尺寸被设计成与所述聚合物捕获膜的底面接触，以便所述多个单独通道中的每个的底部开口由所述多孔材料覆盖；ii)膜支撑部件，其包括基底(例如，金属、陶瓷、硅、铝等)，所述基底具有穿过其的多个单独孔(例如，所述多个单独孔的直径比所述聚合物捕获膜中的通道大)，所述多个单独孔与所述聚合物捕获膜中的所述多个单独通道一对一对齐，其中所述膜支撑部件的尺寸被设计成与所述聚合物捕获膜的底面接触并且支撑所述聚合物捕获膜的底面；iii)多阱芯片，其包括多个单独阱(例如，微阱或纳米阱)，其中所述多阱芯片的尺寸被设计成与所述聚合物捕获膜的顶面接触，以便所述多个单独阱与所述聚合物捕获膜中的所述多个单独通道一对一对齐；以及iv)细胞(例如，活细胞)，所述细胞：A)在一个所述单独通道内捕获，或B)由一个所述单独通道的顶部开口捕获。

在某些实施方案中，所述系统还包括外壳基部，其中所述外壳基部被配置来容纳聚合物捕获膜(例如，提供用于聚合物捕获膜的底部支撑，并且通常围绕聚合物捕获膜)，并且包括选自由以下组成的组的至少一个基部特征：真空连接端口(例如，在所述外壳基部的底部中)、用于对齐聚合物捕获膜和膜支撑部件的至少两个导向销、膜支撑板凹部、液体储器、垫圈以及用于连接到外壳顶部的至少一个连接杆。

在特定实施方案中，所述系统还包括外壳顶部，其中外壳顶部被配置来连接到外壳基部以包围所述聚合物捕获膜，并且包括选自由以下组成的组的至少一个顶部特征：入口端口(以连接到样品递送部件，以便递送细胞悬液和洗涤液)、出口端口(例如，以连接到隔膜泵)、狭槽阵列(例如，具有多个狭槽以将液体引导至所述聚合物捕获膜的通道中)、导向销接收器以及连接杆接收器。

在某些实施方案中，所述聚合物捕获膜包含惰性和/或疏水性聚合物(例如，聚酰亚胺、聚酯、聚乙烯、聚氨酯、TEFLON、PTFE或所述聚合物中任何两种、任何三种、任何四种、任何五种或任何六种的组合)。在特定实施方案中，所述聚合物捕获膜为约20-30μm厚，具有3-5μm孔。在另外的实施方案中，所述聚合物捕获膜还包括附着到聚合物捕获膜或与聚合物捕获膜成一体的至少一个膜导向部件，其中膜导向部件被配置来允许使所述聚合物捕获膜中的所述多个单独通道与所述多阱装置中的所述阱和/或所述聚合物膜支撑板中的所述孔一对一对齐。在其他实施方案中，所述多个单独通道的顶部开口与所述多阱装置中的所述阱开口和/或所述聚合物膜支撑板中的所述孔一对一匹配并且对齐。在另外的实施方案中，所述聚合物捕获膜具有选自由以下组成的组的特性中的至少一种：i)所述多个单独通道包括至少5…100…500…30,000个单独通道，ii)每个所述单独通道的尺寸经设计，以便在向底部开口提供负压时，来自细胞悬液的一个细胞且仅有所述一个细胞由顶部开口捕获，但未进入所述单独通道，iii)厚度在10μm与50μm之间，iv)顶面的面积在1cm²与30cm²之间；以及iv)每个所述单独通道的直径为约2-120μm。

在一些实施方案中，所述细胞选自由以下组成的组：血小板(约2μm直径)、红细胞(约3至8μm直径)、嗜中性粒细胞(约8-10μm直径)、淋巴细胞(约6-12μm直径)、外分泌细胞(约10μm直径)、成纤维细胞(约10-15μm直径)、骨细胞(约10-20μm直径)、软骨细胞或肝细胞(约20μm直径)、杯状细胞或纤毛细胞(约50μm长和5-10μm宽)、巨噬细胞(约20-80μm直径)、造血干细胞(约30-40μm直径)、填充有储存脂质的脂肪细胞(约70-120μm直径)以及神经元(约4-120μm直径)。在其他实施方案中，所述系统还包括选自由以下组成的组的第二部件：提供负压的真空泵、被配置来使外壳基部旋转的离心机马达、隔膜泵、芯片对齐部件、附着到摆臂支撑杆的摆臂、样品递送部件、用户界面显示器和至少一个废物容器。

在一些实施方案中，本公开提供分离单细胞的方法，其包括：a)使细胞悬液与细胞分离系统接触，其中所述细胞分离系统包括：i)聚合物捕获膜，其包括顶面、底面和延伸穿过所述聚合物捕获膜的多个单独通道，其中每个所述单独通道：A)在所述聚合物捕获膜的顶面具有顶部开口，B)在所述聚合物捕获膜的底面具有底部开口，并且C)尺寸经设计，以便来自所述细胞悬液的一个细胞且仅有所述一个细胞：1)在向所述底部开口提供负压时，在所述单独通道内被捕获，从而部分地或基本上封闭所述单独通道；或2)在向所述底部开口提供负压时，由所述顶部开口捕获，但未进入所述单独通道；以及ⅱ)气动装置，其提供所述负压，以及b)用所述细胞分离系统孵育所述细胞悬液，其中所述气动装置提供所述负压，以便所述聚合物捕获膜中的至少一些所述单独通道捕获来自所述细胞悬液的一个细胞，以便所述多个单独通道中的至少一些具有一个捕获的细胞；以及c)洗涤所述聚合物捕获膜以将非捕获的细胞移除，以便产生捕获的细胞聚合物膜。

在其他实施方案中，所述方法还包括将所述捕获的细胞聚合物膜和多阱装置组合在一起以产生一个组件，其中所述多阱装置具有多个阱开口，并且其中所述捕获的细胞聚合物膜的多个单独通道的顶部开口与所述多阱装置中的所述多个阱开口一对一匹配并且对齐。在某些实施方案中，所述细胞分离系统还包括：i)多孔层，其包含允许液体但不允许细胞从中穿过的多孔材料，其中所述多孔层的尺寸被设计成与所述聚合物捕获膜的底面接触，以便所述多个单独通道中的每个的底部开口由所述多孔材料覆盖；或ii)膜支撑部件，其包括基底，所述基底具有穿过其的多个单独孔，所述多个单独孔与所述聚合物捕获膜中的所述多个单独通道一对一对齐，其中所述膜支撑部件的尺寸被设计成与所述聚合物捕获膜的底面接触并且支撑所述聚合物捕获膜的底面。

附图描述

图1A示出本发明的示例性系统或组件，包括具有顶面(12)和多个通道(一个通道用14标记)的聚合物膜(10)。聚合物膜(10)位于多孔层(20)上，多孔层(20)自身位于向通道(14)的底部提供负压(由向下箭头示出)的气动装置(30)上。示出了在内部具有细胞(40)的通道(14)，细胞(40)基本上封闭所述通道。

图1B示出可替代的示例性实施方案，并且总体上示出与图1A相同的部件，除了聚合物膜(10)中的通道(14)小于细胞(40)以便所述细胞在聚合物膜(10)的顶面(12)上捕获之外。

图2示出具有示例性附着的样品递送部件(190)的示例性外壳组件(45)。外壳组件(45)具有外壳基部(60)，外壳基部(60)具有内部顶面(120)，内部顶面(120)在其中具有两个导向销(100)。外壳基部(60)还具有液体储器(80)、膜支撑凹部(70)和对应的垫圈(85)，以及储器(80)的底部中的真空连接端口(90)。外壳基部(60)还具有将外壳基部(60)连接到外壳顶部(140)的一对连接杆(110)。外壳顶部(140)具有入口端口(150)和出口端口(160)。入口端口(150)与此图中作为注射器示出的样品递送部件(190)连接。外壳顶部(140)具有狭槽阵列(180)和一对连接杆接收器(170)，以连接到连接杆(110)。外壳顶部(140)还具有两个导向销接收器(105)。示例性外壳组件(45)还具有位于膜支撑部件(50)上的聚合物捕获膜(10)。聚合物捕获膜(10)具有一对膜导向部件(130)，膜导向部件(130)各自具有用于接收导向销(100)的膜导向销接收器(135)。膜支撑部件(50)被配置来位于膜支撑凹部(70)中，以便导向销(100)插入膜导向销接收器(135)中，从而使聚合物膜中的多个单独的细胞捕获通道与膜支撑部件(50)中的多个孔对齐。

图3A示出具有两个导向销(100)、聚合物捕获膜(10)和膜导向部件(130)的示例性外壳基部(60)。图3B示出具有外壳基部(60)和外壳顶部(140)的示例性外壳组件(45)。示出了具有入口端口(150)和出口端口(160)的外壳顶部(140)。

图4示出具有外壳组件(45)和摆臂(210)的示例性细胞捕获仪(200)，摆臂(210)具有被设计来与出口端口(160)啮合的排放端口(220)。所述细胞捕获仪还具有用户界面显示器(240)。

图5A示出具有摆臂(210)的示例性细胞捕获仪(200)，摆臂(210)具有摆臂样品递送槽和排放端口(220)。示例性细胞捕获仪(200)还具有真空泵(280)、第一废物收集容器(270)、隔膜泵(260)和第二废物收集容器(290)。

图5B示出具有终止于一对狭槽阵列端板(185)的多个狭槽的狭槽阵列(180)。

图5C示出具有终止于狭槽阵列端板(185)的多个端板(此图中示出的72个)的狭槽阵列(180)的特写透视图。

图6A示出在移除外壳顶部(140)、显示出聚合物捕获膜(10)的情况下的示例性细胞捕获仪(200)。

图6B示出含有膜支撑部件(50)上的聚合物捕获膜(10)的外壳基部(60)下方的离心机马达(250)。

图7A示出向下放置于导向销(100)上的芯片对齐部件(310)。示出了置于聚合物捕获膜(10)上的芯片对齐部件(310)之内的多阱芯片(320)。

图7B示出处于外壳基部(60)之上的芯片对齐部件(310)，以及聚合物捕获膜(10)上方的多阱芯片(320)。

图8示出图7B中的布置的侧视图。具体而言，示出了多阱芯片由通孔芯片(370)和在多阱芯片中形成底部并且产生阱(360)的第一密封膜(340)构成。示出了多阱芯片的顶面具有双面粘合剂膜(350)，双面粘合剂膜(350)允许多阱芯片附着到聚合物捕获膜(10)，以便单个捕获的细胞(40)与多阱芯片的阱(360)对齐。示出的具有捕获的细胞(40)的聚合物捕获膜(10)位于具有真空连接端口(90)的外壳基部(60)内的膜支撑部件(50)上。

图9A示出具有在多阱芯片(320)上向下提供力的摆臂(210)的细胞捕获仪(200)。

图9B示出通孔芯片(370)的多阱芯片(320)部件，通孔芯片(370)涂覆有第一密封膜(340)以形成所述芯片的底部。在顶部上具有聚合物捕获膜(10)的膜支撑部件(50)处于多阱芯片(370)下方。示出了位于膜支撑部件(50)下方的第二密封膜(380)。

详述

本发明提供用于用聚合物捕获膜捕获单细胞的方法、系统、组件和制品。在某些实施方案中，聚合物捕获膜包括多个具有顶部和底部开口的单独通道，其中所述通道的尺寸经设计，以便单细胞：i)当向所述底部开口提供负压时，在所述通道内被捕获，从而部分地或基本上封闭所述通道；或ii)当向所述底部开口提供负压时，由所述顶部开口捕获，但未进入所述通道。在一些实施方案中，所述聚合物捕获膜的通道与多阱芯片的阱对齐，以便细胞或单细胞的内容物可转移至对应的阱。

在某些实施方案中，本发明提供用于通过聚合物膜上的单独通道或点捕获单细胞的方法、系统、组件和制品。在某些实施方案中，聚合物膜具有能够使用特定尺寸和负压捕获单细胞的多个单独通道(例如，在多阱匹配模式中)。在其他实施方案中，聚合物膜具有能够捕获单细胞的多个单独亲水性点(例如，在多阱匹配模式中)。在某些实施方案中，在多阱匹配模式中所述聚合物膜和捕获的单细胞一起与具有匹配阱开口模式的多阱装置配对，以便捕获的细胞可分配于其中，从而允许各阱接收单细胞(例如，然后可将所述单细胞裂解，并且对核酸进行测序)。在某些实施方案中，采用例如附着到(例如，通过双面PCR相容性粘合剂)多阱装置并且与多阱装置对齐的尺寸排阻聚合物膜。在一些实施方案中，多阱通过装置设置有细胞尺寸的顶部开口和较大的底部开口(例如，被配置来接收反应组分)。在其他实施方案中，多阱装置通过使PCR相容性膜附着到多阱通孔芯片底部来产生。在另外的实施方案中，本文提供具有细胞尺寸的凹坑或阱(例如，各自含有单细胞)的捕获芯片，其可与具有多个阱的多阱装置配对，所述多个阱含有将分离和/或裂解所述单细胞的试剂。可将捕获芯片和多阱装置配对，以便所述芯片的凹坑与所述装置的阱对齐，然后处理，以便试剂从多阱装置的阱流到所述细胞尺寸的凹坑中的细胞，然后再次处理，以便处理过的细胞流入所述多阱装置的阱中。

在一些实施方案中，本公开中采用的多阱装置(例如，以下进一步详细描述的)可由多阱通孔芯片和PCR相容性膜构造。除了延伸穿过基底而形成孔而不是阱的“阱”的开口之外，多阱通孔芯片是例如与本文描述的多阱装置相同的，并且在本领域中是已知的(例如，纳米阱或微阱，具有成百上千个阱)。多阱装置可通过用PCR相容性膜(例如，PCR密封膜；VWR PCR密封膜；LABNET热密封膜；BRANDTECH SCIENTIFIC密封膜；AXYGEN SCIENTIFIC PCR-SP密封膜；等)覆盖多阱通孔芯片一侧上的至少一些或所有的孔来由多阱通孔芯片形成。

在特定实施方案中，本文提供的多阱装置(例如，包括由上述PCR相容性膜制成的那些多阱装置)附着到本文描述的尺寸排阻聚合物膜，以形成具有尺寸排阻和多阱装置特性的装置。在某些实施方案中，用双尺寸PCR相容性粘合剂(例如，3M 9965粘合带)将尺寸排阻聚合物膜附着到多阱装置的顶部。在某些实施方案中，一旦单细胞由膜捕获并转移到多阱装置的阱中，就将裂解缓冲液加入所述阱中(例如，以启动全基因组扩增或全转录组扩增测定方案)。

在某些实施方案中，提供了具有多个通孔的多阱通孔芯片，其中每个所述通孔在所述芯片的一侧上具有细胞尺寸的开口(例如，直径为2-10μm或更大，取决于待捕获的细胞的尺寸)，并且在另一侧上具有较大反应尺寸的开口(例如，直径为100-800μm或直径为400-500μm)。在一些实施方案中，芯片的厚度为至少0.5mm(例如，至少0.5..1.0…1.5…2.0mm或更多)。在特定实施方案中，所述芯片(例如，大部分地或完全地)由硅、石英、玻璃或所述材料的组合构成。在特定实施方案中，两种材料粘结在一起(例如，玻璃和硅)以形成具有通孔的芯片。在示例性实施方案中，玻璃晶片(例如，500um厚)(例如，FORTRAN玻璃晶片)粘结到硅晶片(例如，25um厚)以形成粘结的芯片(例如，所述粘结的芯片为约525um厚)。然后，在硅侧上对齐并模式化掩模，并且将细胞尺寸的孔(例如，4um)蚀刻到硅中直到下面的玻璃层。然后，在玻璃侧上对准第二掩模，并在玻璃中蚀刻较大反应尺寸的孔，从而产生多阱通孔芯片，其中孔在各自末端处的尺寸不同。

本文描述的在每侧具有不同尺寸开口的多阱通孔芯片首先用来在细胞尺寸的开口中捕获单细胞。通过将PCR相容膜应用到芯片来密封细胞大小的开口，从而产生多阱装置，其中单细胞在形成的阱的底部处捕获。然后，通过例如通过反应尺寸的孔加入裂解和扩增试剂来使用如本文所述的多阱装置。

在某些实施方案中，本文提供含有各自允许从细胞混合物中捕获单细胞的多个细胞尺寸的点或凹坑(例如，微型阱)。在一些实施方案中，将细胞尺寸的凹坑蚀刻到基底(例如，由玻璃、硅、石英、或其组合构成)中。在特定实施方案中，采用等离子体蚀刻。示例性方案如下。将基板掩模置于已经涂覆有光致抗蚀剂(例如，Shipley 1818)的基底上并且暴露以产生凹坑。光掩模由诸如Heidelberg仪器的直接激光写入器制造。一旦基底具有蚀刻的点/凹坑，就使细胞悬液在蚀刻的芯片上(例如，在流动池中)流动，并且在点/凹坑中捕获单细胞。然后洗掉过量的细胞，并使捕获芯片与如本文所述的多阱装置对齐，以便捕获芯片上的凹坑与多阱装置的阱对齐。多阱装置的阱可预填充有试剂，诸如裂解和/或扩增试剂。然后将配对装置离心(或以其他方式搅拌)，以便多阱装置中的试剂朝向凹坑中的细胞行进并且接触凹坑中的细胞(例如，裂解细胞或以其他方式将细胞从与凹坑的任何附着中释放)。然后将配对的装置离心(或以其他方式在相反方向上搅拌)，以便细胞(或裂解的细胞内容物)以相反方式行进到多阱装置的阱中。然后移除捕获芯片，并且在生物反应(例如，在PCR或类似反应中)处理具有各自含有单细胞(或单细胞内容物)的阱的多阱装置。

本发明的系统和方法的另一个示例性实施方案如下。本发明的系统可由疏水性或超疏水性(例如，氟硅烷涂覆的)聚合物膜构成，所述聚合物膜跨开放式框架拉伸并且通过激光或类似装置钻孔。选择所产生的通道的直径和膜的厚度，以便在每个通道中可容纳一个单细胞。通道或模式的间距将与多阱装置(诸如，可用来进行单细胞测定的WAFERGEN的5184SmartChip)上的孔的模式匹配。此聚合物膜由经选择具有小孔的刚性多孔泡沫支撑，所述小孔可为亲水性或疏水性，但是将仅允许细胞悬液缓冲液穿过，但阻滞细胞本身。将此多层结构组装成使用户能够引入细胞悬浮液同时在泡沫后面施加负压源的组件。此整个组件可定位在搅拌器或回转器上，以移动聚合物膜上的细胞悬液，以使单细胞能够由聚合物膜中的每个通道内的负压捕获。单细胞不能穿过泡沫，只有悬浮液将穿过。可使用高精度计来监测负压，以指示聚合物膜中的所有通道何时已被细胞封闭。因为聚合物膜是疏水的或涂覆有超疏水性涂层，诸如氟硅烷，所以悬浮细胞通常将不会自身单独地或以团块附着到表面。一旦认为已经捕获细胞，就可用无细胞缓冲液诸如PBS冲洗过量的细胞悬液以移除过量细胞，同时施加一定水平的负压以阻止捕获的细胞流走。在移除过量的细胞和细胞悬液缓冲液之后，在膜上将存在捕获的单细胞，然后将多阱装置(例如，SmartChip)面朝下放置在膜上，并且将组件置于离心机夹具中以将单细胞分别转移到多阱装置阱中。多装置阱可以具有预加载的细胞缓冲液以保持细胞存活，或者可以用细胞裂解缓冲液预加载。现在可以通过用于基因表达或测序的多样品纳米分配器，用各种测定试剂填充多阱装置。

本发明的系统和方法的另一个示例性实施方案如下。具体而言，可以在聚合物的表面上完成分离和捕获细胞的另一种方法，所述聚合物具有在与多阱装置(例如，Smartchip)相同的间距上钻出的通道，但是所述通道的尺寸经设计，以便单细胞可被捕获但不会通过。细胞的捕获可以通过在多孔泡沫后面施加的负压来完成。此方法将不需要具有相同厚度(如上)的聚合物膜，因为细胞将在膜的表面上而不是膜的通道内捕获。这种表面捕获的方法还将能够有效地冲走过量的细胞，而捕获的细胞将通过负压保持在通道上的适当位置中。

转移捕获的细胞的另一种方法可以通过以下方式完成：通过将负压反转至正压来从聚合物表面或膜中的通道推掉捕获的细胞，并且使用细胞悬液缓冲液来将来自所述表面或所述通道的细胞冲到多阱装置(例如，SmartChip)的阱中。

另一种可替代的示例性实施方案如下所述。可以使用将阻止细胞粘着的超疏水表面(例如，氟硅烷)来产生替代的分离方法。这种超疏水性表面可以具有聚多巴胺或其他亲水性材料的小岛，所述聚多巴胺或其他亲水性材料的小岛将允许细胞粘附到其上。因此，具有约为靶细胞大小的岛的超疏水表面可以是流动池的一部分，在所述流动池中悬浮于悬液缓冲液中的目标细胞将在这种表面上流动，并且单细胞将在聚多巴胺或其他亲水性材料的“岛”上捕获。岛(或“点”)的模式和尺寸可以是这样的，以便在已从诸如洗掉过量细胞后，多阱装置诸如Smartchip可以使用简单的销对齐方案来面朝下放置，以便每个捕获的单细胞的岛将处于多阱装置(例如，SMARTCHIP)的一个阱的中心。然后使用离心机，可将每个捕获的单细胞转移到多阱装置(例如，SMARTCHIP)的阱中。

希望分离的单细胞的尺寸将决定采用的聚合物上的通道或亲水性点的尺寸。聚合物中的通道需要至少略大于期望的细胞，以便在通道中捕获细胞。如果人们希望在具有通道的聚合物表面上捕获细胞，那么通道的直径应该至少略小于靶细胞。关于亲水性点，这些点应该为约靶细胞的尺寸。大多数人细胞的尺寸落在2-120微米的尺寸范围内。血小板为约2微米，红细胞为约3微米x约8微米，嗜中性粒细胞为约8-10微米，淋巴细胞的尺寸为约6-12微米，外分泌细胞为约10微米，成纤维细胞为10-15微米，骨细胞为约10-20微米(包括突起)，软骨细胞和肝细胞为约20微米，杯状细胞和纤毛细胞为约50微米长和5-10微米宽，巨噬细胞为约20-80微米，造血干细胞为约30-40微米，并且填充有储存脂质的脂肪细胞的直径通常为70-120微米(但在非常肥胖的人中可以高达六倍大)。神经元的尺寸和形状变化巨大，它们主体的直径的范围为4-120微米，轴突突起的直径在约0.1-20微米之间变化，并且长度的范围为几微米至约1米；肌肉细胞(所有组织细胞中的约30％)的直径也从10-100微米变化，并且长度可高达约50cm。本发明不受所采用的或聚合物上的通道和点被设计来配对的多阱装置(例如，板或芯片)的类型限制。通常，所述装置具有多个阱，所述多个阱容纳或所述多个阱的尺寸被设计来容纳液体(例如，在阱中捕获以致于重力不能单独使液体从阱中流出的液体)。一种示例性芯片为WAFERGEN的5184阱SMARTCHIP。在美国专利8,252,581；7,833,709；以及7,547,556中提供了其他示例性芯片，所有所述专利均以引用方式整体并入本文，包括例如对于芯片、阱、热循环条件和其中所用的相关试剂的教导)。其他示例性芯片包括用于QUANTSTUDIO实时PCR系统(Applied Biosystems)中的OPENARRAY板。另一种示例性多阱装置为96阱或384阱板。

多阱装置的总尺寸可以变化，并且其厚度的范围可为例如几微米至几厘米，并且宽度或长度的范围可为几毫米至50厘米。通常，整个装置的尺寸的宽度和/或长度的范围为约10mm至约200mm，并且厚度的范围为约1mm至约10mm。在一些实施方案中，所述芯片为约40mm宽度X 40mm长度X 3mm厚度。

多阱装置上的阱(例如，纳米阱)的总数可根据待采用主题芯片的具体应用而变化。芯片表面上的阱的密度可根据具体应用而变化。阱的密度以及阱的尺寸和容积可根据期望的应用和例如像待采用本发明方法的生物体的种类的此类因素而变化。

本发明不受多阱装置中阱的数目限制。大量的阱可并入装置中。在各种实施方案中，所述装置上阱的总数为约100至约200,000，或约5000至约10,000。在其他实施方案中，所述装置包括较小芯片，每个所述较小芯片均包括约5,000至约20,000个阱。例如，正方形芯片可包括125X 125个直径为0.1mm的纳米阱。

多阱装置中的阱(例如，纳米阱)可以任何实用的尺寸、形状或体积制造。所述阱的长度为约100μm至约1mm，宽度为约100μm至约1mm，并且深度为约100μm至约1mm。在各种实施方案中，每个纳米阱的纵横比(深度与宽度比)为约1至约4。在一个实施方案中，每个纳米阱的纵横比为约2。横截面区域可为圆形、椭圆形、卵形、圆锥形、矩形、三角形、多面或任何其他形状。阱的任何给定深度处的横向区域的尺寸和形状也可变化。

在某些实施方案中，所述阱的容积为约0.1nl至约1μl。所述纳米阱的容积通常小于1μl，优选地小于500nl。所述容积可小于200nl，或小于100nl。在一个实施方案中，所述纳米阱的容积为约100nl。当需要时，可以制造纳米阱以增加表面积与容积比，从而促进通过单元的热传递，这可以减少热循环的斜坡时间。每个阱(例如，纳米阱)的腔可以采取各种构形。例如，阱内的腔可以由线性或曲壁分隔以形成分开但是相邻的隔室，或者由圆形壁分隔以形成内部和外部环形隔室。

如果需要，具有高内表面与容积比的阱可以涂覆有材料，以减少其中含有的反应物可能与阱的内表面相互作用的可能性。如果试剂倾向于不合需要地与内表面相互作用或粘附到内表面，那么涂层是特别有用的。根据反应物的特性，可以选择疏水性或亲水性涂层。多种适当的涂层材料在本领域中是可用的。一些材料可以共价粘附到表面，其他材料可以通过非共价相互作用附着到表面。涂层材料的非限制性实例包括硅烷化试剂诸如二甲基氯硅烷、二甲基二氯硅烷、六甲基二硅氮烷或三甲基氯硅烷、聚马来酰亚胺，以及渗硅试剂，诸如氧化硅、AQUASIL和SURFASIL。另外的适合涂层材料为阻滞剂诸如氨基酸，或包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、聚腺苷酸和聚马来酰亚胺的聚合物。某些涂层材料可以通过加热、辐射以及通过化学反应来交联到表面。本领域技术人员将知道用于涂覆多阱装置的纳米阱的其他适合方法，或者将能够确定所述方法，而无需过多的实验。

示例性多阱装置(例如，芯片)的厚度可为约0.625mm，阱具有长度和宽度为约0.25mm(250um)的尺寸。纳米阱深度可为约0.525mm(525um)，在给定阱下方留下约0.1mm的芯片。纳米阱开口可以包括任何形状，诸如圆形、正方形、矩形或任何其他期望的几何形状。以举例的方式，纳米阱可包括约100μm与约1mm之间的直径或宽度，约150μm与约1mm之间的间距或长度，并且约10μm至约1mm的深度。每个阱的腔可以采取各种构形。例如，纳米阱内的腔可以由线性或曲壁分隔以形成分开但是相邻的隔室。

可以使用例如公知的光刻技术来形成多阱装置的阱(例如，纳米阱)。可以例如使用湿KOH蚀刻技术、各向异性干蚀刻技术、机械钻孔、注塑和/或热成型(例如，热压花)来形成纳米阱。

多阱装置中的液体内容纳的试剂取决于待与沉积到每个阱中的单细胞一起进行的反应。在一个实施方案中，所述阱含有用于进行核酸扩增反应的试剂。试剂可为用于免疫测定、包括但不限于核酸扩增的核酸检测测定的试剂。试剂可以在芯片的单元中处于干燥状态或液体状态。在一个实施方案中，所述阱含有以下试剂中的至少一种：探针、聚合酶和dNTP。在另一个实施方案中，所述阱含有包含探针、引物和聚合酶的溶液。在各种实施方案中，每个阱包含：(1)引物，所述引物用于所述标准基因组内的多核苷酸靶标，以及(2)探针，如果引物与所述靶标结合，所述探针就与发出浓度相关信号的所述引物结合。在各种实施方案中，每个阱包含：引物，所述引物用于基因组内的多核苷酸靶标，以及探针，如果引物与所述靶标结合，所述探针就与发出浓度相关信号的所述引物结合。在另一个实施方案中，芯片的至少一个阱含有包含正向PCR引物、反向PCR引物和至少一种FAM标记的MGB淬火PCR探针的溶液。在一个实施方案中，将引物对分配到阱中，然后诸如通过冷冻来干燥。然后，用户可以选择性地分配(诸如，纳米分配)样品、探针和/或聚合酶。

在本发明的其他实施方案中，所述阱可含有干燥形式的任何以上溶液。在此实施方案中，可将这种干燥形式涂覆到阱或引导到阱的底部。在分析之前，用户可以向每个阱中添加水和捕获的细胞的混合物。在此实施方案中，包含干燥的反应混合物的芯片可以用衬垫密封、储存或运送到另一个位置。

在每个阱中具有单细胞的多阱装置可用于基因分型、基因表达或通过PCR进行的其他DNA测定。在板中进行的测定不限于DNA测定，诸如TAQMAN、TAQMAN金、SYBR金和SYBR绿，而且还包括其他测定，诸如受体结合、酶和其他高通量筛选测定。在一些实施方案中，ROX标记的探针用作内标。

本公开的另一示例性实施例呈现于以下段落中，描述了使用聚合物捕获膜捕获单细胞的外壳组件的初始结构和用途，以及用于处理每个捕获的单细胞(例如，用于对每个捕获的单细胞的mRNA进行测序)的多阱芯片的组件。此讨论总体上是参考仅作为示例性实施方案提供的图2-9。

可以通过组合通孔芯片和粘合剂密封膜以形成多阱芯片中的阱的底部来产生多阱芯片。可以通过在平面的、相对硬的并且相对薄的材料(诸如，金属(例如，铝)、硅、陶瓷和相关材料)中钻出多个孔来产生通孔芯片。材料的厚度取决于每个阱的期望深度，并且在一些实施例中可在1.0和9.0mm之间(例如，1.0...2.7...3.4...5.0...7mm)。可以使用任何数量的适合技术，包括在可编程高速精密钻孔机(例如，由Kern Precision,Inc.制造的Kern HSPC 25钻孔机)上进行的机械钻孔，来将孔钻穿这种材料。例如，可以在可编程高速精密钻孔机上对金属基底(例如，铝)进行机械钻孔。通常，将3D CAD设计文件诸如STEP AP214转换为适当的机器指令，然后所述机器指令使用正确的直径钻子执行钻孔模式和深度。所钻出的孔的直径可以根据期望的最终阱的直径而变化。在一些实施方案中，材料中钻出的每个孔的直径在0.20与2.5mm之间(例如，0.2…0.45…1.5…2.5mm)。孔的数目取决于期望阱的数目。在某些实施方案中，所钻出的孔的数目在2与30,000个之间(例如，2…15…50…96…386…1000…3000…5184…15,000…30,000个孔)。在特定实施方案中，将72×72的栅格编程到钻孔机中以产生具有5184个孔的通孔芯片。在某些实施方案中，然后处理通孔，以便每个通道(其将变成阱)涂覆有疏水性涂层(例如，这种涂层的实例为聚对二甲苯保形涂层)，以使最终阱是生物相容的。最后，向通孔芯片的一侧添加密封膜以形成每个阱的底部(例如，使用低粘性密封膜)。

可以通过以下描述的示例性实施方案来产生含有用于分离单细胞(用于与多阱芯片一起使用)的聚合物捕获膜和相关部件的外壳组件。

外壳组件(例如，图2中所示的外壳组件)内的三个部件产生有与多阱芯片的阱对齐的孔。这三个部件包括双面粘合剂、聚合物捕获膜和膜支撑板(如果使用膜支撑板代替如图1所示的多孔层)。在与通孔芯片相同的间距上对可具有两个释放层和中间的载体(例如，全部由聚酯制成)的双面粘合剂(例如，3M 9965压敏粘合剂)进行钻孔(例如，激光钻孔)。钻出的孔通常比在对应的通孔芯片中钻出的孔小(例如，小5-50％)。在某些实施方案中，所钻出的孔在0.10mm与4.0mm之间(例如，0.1…0.350…2.0…和4.0mm)。双面粘合剂的钻孔可以通过使用具有可编程X-Y工作台的准分子激光器(例如，由Potomac Photonics制造)来完成。与上述精密钻子类似，加载3D CAD文件以在与通孔芯片相同的间距上钻孔。

聚合物捕获膜中的孔可以与双面粘合剂相同类型的方式，使用激光钻，例如使用与通孔间距相同的间距来制成。所产生的孔的直径是这样的，以便单细胞将在孔(通道)的顶部附近或内部捕获。所述孔取决于分离的细胞的类型(例如，单细胞/通道)。示例性尺寸范围为2至35微米(例如，2…4…25…或35微米)。所述膜可为任何类型的适合材料，包括惰性和疏水性聚合物(例如，聚酰亚胺膜，诸如来自DuPont的KAPTON膜、聚酯、聚乙烯、聚氨酯、TEFLON和/或PTFE；还参见Vladkova,T.G.(2010)“Surface engineered polymeric biomaterials with improved biocontact properties.”Int.J.Polym.Sci.,2010,1–22，所述文献以引用方式整体并入本文，特别是关于其中论述的聚合物)。在某些实施方案中，所述膜的厚度在10um与50um之间(例如，10…25…35…和50um)。在特定实施方案中，纵横比(孔的直径比聚合物的厚度)为约5:1、6:1或7:1。

在某些实施方案中，膜支撑部件中的孔可使用与通孔芯片相同类型的方法、材料和装置(参见上文)，使用与通孔芯片相同的间距来制成。在某些实施方案中，膜支撑部件中的孔的直径与通孔芯片的孔的直径相同或相似(参见上文)。例如，所述膜支撑部件的孔的直径可在0.20与2.5mm之间(例如，0.2…0.45…1.5…2.5mm)。膜支撑部件可以具有与通孔芯片的厚度相似的厚度，或者可以更薄(例如，约0.9-1.1mm厚的铝或其他金属或材料)。

可以使用与聚合物捕获膜中的孔相同的间距来制造具有多个狭槽(例如，等于聚合物捕获膜中的通道/孔的行数)的狭槽阵列部件(例如，图2、5A和5B中的部分180)。在某些实施方案中，基于聚合物捕获膜的尺寸设计狭槽阵列部件的尺寸，以便狭槽可将含有细胞的液体递送到聚合物膜中的孔/通道的顶部。示例性尺寸为400um宽X 200um深。狭槽阵列部件可以通过注射模具制造和蒸汽抛光制造。在某些实施方案中，狭槽阵列由热塑性聚合物(例如，聚碳酸酯)或其他类型的塑料制成。

示例性外壳组件可以与图2所示的一些或所有部件一起组装，并且用来在聚合物捕获膜上捕获单细胞。图2示出具有示例性附着的样品递送部件(190)的示例性外壳组件(45)。除了图2所示的圆形形状和图3所示的正方形形状之外，还可以采用用于外壳组件的其他形状。外壳组件可由任何适合材料(包括塑料)构成。样品递送部件(190)在图2中作为注射器示出，但是可以是可与入口端口(150)配对的其他装置，诸如移液管或类似装置。外壳组件(45)具有外壳基部(60)，外壳基部(60)具有内部顶面(120)，内部顶面(120)在其上具有两个导向销(100)。外壳基部(60)还具有液体储器(80)、膜支撑凹部(70)和对应的垫圈(85)，以及储器(80)的底部中的真空连接端口(90)。外壳基部(60)还具有将外壳基部(60)连接到外壳顶部(140)的一对连接杆(110)。外壳顶部(140)具有入口端口(150)和出口端口(160)。入口端口(150)与此图中作为注射器示出的样品递送部件(190)连接。外壳顶部(140)具有狭槽阵列(180)和一对连接杆接收器(170)，以连接到连接杆(110)。外壳顶部(140)还具有两个导向销接收器(105)。示例性外壳组件(45)还具有位于膜支撑部件(50)上的聚合物捕获膜(10)。聚合物捕获膜(10)具有一对膜导向部件(130)，膜导向部件(130)各自具有用于接收导向销(100)的膜导向销接收器(135)。所述膜导向部件可为来自聚合物捕获膜的具有孔或其他附着部件的瓣片或其他突出物。膜支撑部件(50)被配置来位于膜支撑凹部(70)中，以便导向销(100)插入膜导向销接收器(135)中，从而使聚合物膜中的多个单独的细胞捕获通道与膜支撑部件(50)中的多个孔对齐。聚合物捕获膜置于膜支撑部件之上，以便聚合物捕获膜中的孔(例如4um)与膜支撑部件的400um孔在中心对齐。在其他实施方案中，使用多孔层(图1中的部分20)代替膜状支撑部件。

图3A示出具有两个导向销(100)、聚合物捕获膜(10)和膜导向部件(130)的示例性外壳基部(60)。在某些实施方案中，导向销(100)为杆、锥形体或其他有用的形状。图3B示出具有外壳基部(60)和外壳顶部(140)的示例性外壳组件(45)。示出了具有入口端口(150)和出口端口(160)的外壳顶部(140)。入口端口(150)的形状和尺寸被设计来适应所选样品递送部件(190)。

图4示出具有外壳组件(45)和摆臂(210)的示例性细胞捕获仪(200)，摆臂(210)具有被设计来与出口端口(160)啮合的排放端口(220)。所述细胞捕获仪还具有用户界面显示器(240)。通常，用户将外壳组件置于细胞捕获仪中，并且启动仪器中的软件程序(例如，可操作地连接到控制各种部件的定时和功能的细胞捕获仪的处理器和各种部件的软件程序)。

图5A示出具有摆臂(210)的示例性细胞捕获仪(200)，摆臂(210)具有摆臂样品递送槽和排放端口(220)。示例性细胞捕获仪(200)还具有真空泵(280)(可操作地连接到真空连接端口90)、第一废物收集容器(270)(例如，用于从连接端口90接收液体)、隔膜泵(260)(例如，用于使含有细胞的液体在外壳组件中到处移动)以及第二废物收集容器(290)(例如，充当液体的真空阱)。图5B示出具有终止于一对狭槽阵列端板(185)的多个狭槽的狭槽阵列(180)。图5C示出具有终止于狭槽阵列端板(185)的多个端板(此图中示出的72个狭槽)的狭槽阵列(180)的特写透视图。狭槽阵列端板可操作地连接到入口端口(150)(例如，鲁厄连接)。在某些实施方案中，狭槽阵列中的每个狭槽被设计来直接处于聚合物捕获膜中的孔阵列之上。在某些实施方案中，每个狭槽在两端处终止于用来补料狭槽或使所述狭槽排放的端板。通常，狭槽的目的是使细胞悬液直接在聚合物捕获膜中的每行孔上流动，这帮助确保细胞通常不以随机方式到处流动。因此，在某些实施方案中，由于这种类型的流动控制，细胞悬液可通过使入口和出口端口之间的压力交替来来回移动(例如，以提高捕获效率)。

回到图5A，具有调节器的隔膜真空泵(260)通过液阱连接到出口端口(160)。当启动程序时，摆臂在外壳组件上移动并将其夹下来。将具有缓冲液(例如，3ml的1x PBS)的10ml塑料注射器连接到入口端口。激活真空泵(280)以向外壳组件的底部提供负压(例如，12”Hg负压)，以使液体从注射器中向下移动，并且预湿聚合物捕获膜中的捕获孔。然后，真空停止，并将另一个填充有细胞悬液(例如，2x 10⁵个细胞)的10ml注射器连接到入口端口。连接到出口端口(160)的隔膜泵(260)在细胞悬液缓慢地注入入口端口(150)中时激活。使用在出口端口侧的隔膜泵(例如，使用设定为4”Hg的真空)来将细胞牵拉穿过外壳组件(由慢阵列(180)引导)。隔膜泵停止，而真空泵(280)维持真空(例如，在4”hg处)，以通过聚合物捕获膜捕获细胞。此时，聚合物捕获膜中的至少一些单独通道/孔具有在通道/孔中的或在其顶上捕获的单细胞(例如，参见图1)。在约3-10分钟(例如，约5分钟)之后，移除注射器，然后将具有缓冲液(例如，10ml 1x PBS)的注射器引入入口端口中并且牵拉穿过用于初始清洗的组件。

图6A示出在移除外壳顶部(140)、显示出聚合物捕获膜(10)的情况下的示例性细胞捕获仪(200)。图6B示出含有膜支撑部件(50)上的聚合物捕获膜(10)的外壳基部(60)下方的离心机马达(250)。接着，随着捕获循环完成，用于聚合物捕获膜的真空仍然开启(例如，在4”hg处)，摆臂向上移动并处于上方以允许接近外壳组件。然后移除外壳顶部(140)。

此时，使用图6所示的离心机马达(250)来离心外壳基部(具有聚合物捕获膜)以移除任何过量的洗涤缓冲液。可以将缓冲液喷在膜上以完成过量细胞的清洗。离心还允许在聚合物捕获膜上产生干燥表面，以具有用于将多阱芯片粘结到聚合物捕获膜的干燥表面。

接着，使用如图7A和7B所示的芯片对齐部件上的芯片对齐导向销接收器(330)来将芯片对齐部件(310)置于聚合物捕获膜之上。具有附着双面粘合剂膜(350)(具有其中形成的孔)的多阱芯片(320)置于聚合物捕获膜(10)上的芯片对齐部件(310)之内。双面粘合剂将多阱芯片粘结到聚合物捕获膜，并将每个阱与其相邻阱密封。图8示出图7中的布置的侧视图。具体而言，示出了多阱芯片由通孔芯片(370)和在多阱芯片中形成底部并且产生阱(360)的第一密封膜(340)构成。示出了多阱芯片的顶面具有双面粘合剂膜(350)，双面粘合剂膜(350)允许多阱芯片附着到聚合物捕获膜(10)，以便单个捕获的细胞(40)与多阱芯片的阱(360)对齐。示出的具有捕获的细胞(40)的聚合物捕获膜(10)位于具有真空连接端口(90)的外壳基部(60)内的膜支撑部件(50)上。

接着，如图9A所示，摆臂(210)在上方并向下移动以向多阱芯片施加压力，以便用聚合物捕获膜密封所述多阱芯片。然后摇臂向上移动并处于上方以允许移除多阱芯片/聚合物捕获膜组件。然后将此组件倒置，并将聚合物捕获膜的底部吸干，并且用第二密封膜(380)(例如，PCR密封膜)密封。在某些实施方案中，向此密封组件中添加低渗缓冲液，并且将组件在–80C下冷冻30分钟或过夜。此组件可以在室温下解冻并用于任何类型的单细胞分析。冷冻和解冻程序(例如，在低渗溶液中)使细胞裂开，并且允许细胞裂解物处于多阱芯片的阱中的溶液中。然后将顶面上的聚合物膜(例如，临时密封膜)剥离，并且可以将芯片用于任何类型的生物分析。在其他实施方案中，将捕获的单细胞从聚合物膜中释放和/或用变性剂诸如胍和尿素或用酶组合物来裂解。

作为处理的结果，现在多阱芯片的一些、大部分或所有阱具有来自溶液中的单细胞的细胞裂解物。可将用于任何适合类型的测定的试剂添加到多阱芯片的阱中(例如，使用多阱分配器，诸如来自WAFERGEN BIOSYSTEMS的多阱分配器)。在某些实施方案中，向阱中添加蛋白质检测测定组分(例如，基于抗体的测定)。在其他实施方案中，向阱中添加SNP检测测定组分。在其他实施方案中，向阱中添加核酸测序测定组分。在某些实施方案中，采用了采用用于标记单独mRNA分子和/或用于标记细胞/阱来源(例如，如果在测序分析之前合并阱)和/或用于标记特定多阱芯片(例如，如果在测序之前合并来自两个或更多个多阱芯片的阱)的条形编码的核酸序列测定组分。所述条形编码方法和试剂的实例见于专利公布US2007/0020640、专利公布2012/0010091、美国专利8,835,358、美国专利8,481,292、Qiu等(Plant.Physiol.,133,475-481,2003)、Parameswaran等(Nucleic Acids Res.2007年10月；35(19):e130)、Craig等参考(Nat.Methods,2008年10月,5(10):887-893)、Bontoux等(Lab Chip,2008,8:443-450)、Esumi等(Neuro.Res.,2008,60:439-451)、Hug等,J.Theor.,Biol.,2003,221:615-624)、Sutcliffe等(PNAS,97(5):1976-1981；2000)、Hollas和Schuler(Lecture Notes in Computer Science Volume 2812,2003,第55-62页)以及WO201420127；所有所述文献均以引用方式整体并入本文，包括与核酸的条形编码和测序有关的反应条件和试剂。

在某些实施方案中，采用了WO2014201272(“SCRB-seq”方法)的条形编码标记和测序方法。将用于SCRB-seq方法的必需试剂(例如，根据需要修改为小体积)添加到各自含有裂解的单细胞的多芯片阱中。简言之，SCRB-seq方法扩增来自多阱板(如上所述)中的单细胞的初始mRNA样品，在所述多阱板中每个阱具有单细胞。初始cDNA合成使用具有以下特征的第一引物：i)用于细胞/阱鉴定的N6，ii)用于特定分子鉴定的N10，iii)结合mRNA的多聚T延伸，以及iv)产生其中第二模板转换引物将杂交的区的区。第二引物是具有多聚G 3’端和具有异碱基(iso-base)的5’端的模板转换引物。cDNA扩增后，将标记的cDNA单细胞/阱样品合并。然后，用两种不同的引物进行全长cDNA合成，并且纯化全长cDNA。接着，使用i7引物(添加12个i7标签中的一个以鉴定特定的多阱板)和添加用于NEXTERA测序(将P7标签添加到NEXTERA的另一端)的P5标签的P5NEXTPT5来制备NEXTERA测序文库。在凝胶上纯化文库，然后进行NEXTERA测序。作为非限制性实例，使用十二个i7板标签和384个细胞/阱的特异性条形便码，这允许一次完成总共4,608个单细胞转录组。此方法允许定量单细胞中的mRNA转录物，并且允许用户对转录物分子/细胞的绝对数进行计数以从归一化中去除任何变量。

本申请中提及的所有出版物和专利均以引用方式并入本文。本发明的描述的方法和组合物的各种修改和变化对于本领域技术人员将显而易见，而不背离本发明的范围和精神。虽然已结合具体优选实施方案描述了本发明，但应理解的是，要求保护的本发明不应不适当地局限于所述具体实施方案。事实上，对于相关领域技术人员来说显而易见的用于进行本发明的描述的模式的各种修改旨在处于以下权利要求书的范围内。