用于HPV‑相关病症的新方法、生物试验和生物标记物与流程

本申请要求2014年4月28日提交的美国临时专利申请61/985,357的优先权，通过引用将该申请全文纳入本文。

政府权利的声明

本发明在国立癌症研究院授予的基金号U01 CA117374下由政府资助完成。政府对本发明拥有某些权利。

技术领域

本文公开的实施方式涉及患者样品中HPV检测的方法和材料，并且更具体地涉及用于HPV-相关病症的诊断、监测、预测和预后用途的试验和生物标记物。

背景技术：

检测体液免疫应答对于感染性疾病和自身免疫的诊断和预后而言是必要的，并且可也提供用于检测癌症等病症的生物标记物。已经开发了多种蛋白组学多重化免疫试验来促进对这些抗体的检测。具体地，基于载片的试验是用于抗体检测的出色发现工具，但是需要一般常规免疫学实验室中不常见的专门高通量设备。

人乳头瘤病毒(HPV)是最常见的性获得感染，估计多达75％的性生活活跃的人在其一生中的某些时间被感染。HPV的生殖器感染通常在首次性行为后不久获得，并且在青少年和年轻成年人中流行率最高。在大多数病例中，感染是暂时并且无症状的，并且流行率一般随着年龄逐渐降低。顽固的生殖器感染更可能与感染后许多年(一般数十年)出现的侵入性癌症、肿瘤进展相关。

已经清楚HPV 16和18的感染与口咽癌、宫颈癌、肛门癌或其他恶性肿瘤相关。事实上，已经确定西方世界中大多数OPC与HPV感染相关并且数量在上升。

目前，还没有针对HPV-相关病症(如OPC)的免疫情况的检测或监测的筛选和相关方法。

发明概述

本文公开的实施方式涉及快速检测患者样品中HPV类型，如HPV 16和HPV 18-特异性抗体的方法。患有头颈癌的患者具有针对衍生自HPV的多种早期基因的可检测抗体。此外，可在各种实施方式中单独或组合采用这些抗体作为生物标记物，针对HPV-相关病症、恶性肿瘤和癌前状态，用于诊断和预后，并且用于评价治疗和癌症复发预测的方法。

由于需要可用作HPV-相关病症，包括头颈癌的诊断和预后检测剂的一种或多种生物标记物，本文公开了用于筛选具有HPV癌症风险的患者，并用于早期检测、复发、预测和预后的改善的HPV蛋白质产生方法和生物标记物。一些实施方式涉及另采用ELISA(酶联免疫吸附试验)的快速可编程珠试验的构建。

除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。材料、方法和实施例都仅是说明性的，并不意在构成限制。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献都通过引用全文纳入本文。

从下文的详述和附图，以及所附权利要求中能够很容易地了解本发明的其他特征和优点。

附图说明

图1.HPV-相关OPC的患者中多种HPV16抗体的特异性检测。HPV16蛋白表达为GST-融合蛋白并且在抗-GST包被平板上捕获。显示了在HPV-相关OPC血清(n＝256)和对照(n＝250)中检测到的IgG的RLU比率(HPV抗原的RLU/GST-对照的RLU)。

图2.接受者操作特性曲线显示(A)2-Ab生物标记物组(E6，E7)和(B)7-Ab生物标记物组(E1，NE2，CE2，E4，E5，E6，E7)对HPV-阳性肿瘤(n＝111)和对照(n＝250)病例中OPC癌症的早期诊断的比较性能。实线：训练组。虚线：验证组。该组的最优操作点为90％，特异度为98％(AUC＝0.94)。

图3.HPV-相关OPC的患者中多种HPV16抗体的特异性检测。HPV16蛋白表达为GST-融合蛋白并且在磁珠上捕获。显示了在HPV-相关OPC血清中检测到的IgG的MFI比率(HPV抗原的MFI/GST-对照的MFI)。检测HPV-相关OPC患者与对照相比的针对E1、CE2、NE2、E4、E6、E7、和L2的HPV16-特异性抗体。

图4.检测来自136个HPV-OPC病例、48个参与者、和81个健康志愿者的基线血清中的HPV16E6和E7抗体。显示了血清中检测到的针对特异性HPV蛋白质/对照GST蛋白质的IgG的RLU比率。各组中的黑线表示该组中的中值。各组的虚线表示在健康志愿者平均值以上3个标准偏差(阳性截止值)。在x-轴上的各组之下列出了被认为血清阳性的各组的比例。

图5.209名OPC患者的无进展存活。(A)对至少一种E抗体呈阳性的患者对比对所有E抗体呈阴性的患者(P＜.001)。(B)对至少一种L抗体呈阳性的患者对比对所有L抗体呈阴性的患者(P＝.657)。

图6.114名OPC患者的无进展生存，其中可获得肿瘤HPV DNA状态。(A)对至少一种E抗体呈阳性的患者对比对所有E抗体阴性呈的患者(P＜.001)。(B)通过PCR的HPV16-阳性肿瘤患者对比通过PCR的HPV16-阴性肿瘤患者(P＝.016)。

图7.96名HPV16-阳性OPC患者的无进展存活。(A)对至少一种E抗体呈阳性的患者对比对所有E抗体呈阴性的患者(P＜.001)。(B)对E1抗体呈阳性的患者对比对E1抗体呈阴性的患者(P＝.002)。(C)对NE2抗体呈阳性的患者对比对NE2抗体呈阴性的患者(P＜.001)。(D)对E6抗体呈阳性的患者对比对E6抗体呈阴性的患者(P＝.005)。

图8.针对(A)E1抗体、(B)NE2抗体、和(C)E6抗体，HPV-阳性OPC患者随时间的中值抗体水平对比疾病复发状态。最后跟进的复发的所有8个HPV-阳性患者和没有复发的随机亚组的23个HPV-阳性患者在初始处理时、治疗后6个月，和以6个月为间隔至治疗后36个月时测试。

发明详述

说明书中所引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请通过引用纳入本文，如同它们完全示于本申请中那样。

在一个方面中，提供了一种检测HPV的方法。该方法包括以下步骤：将含有来自患者的抗体的样品与体外转录并翻译的来自HPV的蛋白质接触；并且将与蛋白质结合的HPV抗体的特征与HPV-相关病症的对照比较。HPV-相关病症可包括头颈癌或恶化前生长中的一种或多种。HPV-相关病症可包括口咽癌(OPC)。在一些情况中，所述蛋白质包括HPV16 E1、NE2、CE2、E4、E6、E7、和L1中的一种或多种。在一些情况中，所述蛋白质包括HPV18 E1、E2、和L1中的一种或多种。来自HPV的超过一种蛋白质可用于样品。样品可选自下组：血液样品、血清样品和口腔冲洗样品。

在另一个方面中，本文提供了包括至少一种体外转录和翻译的来自HPV的蛋白质的底物作为针对HPV-相关病症的诊断、预后、预测或监测试验的部分。

在另一个方面中，提供了一种检测HPV的方法。该方法包括以下步骤：将含有来自患者的抗体的样品与体外转录并翻译的来自HPV的蛋白质接触；和将与蛋白质结合的HPV抗体的特征与HPV-相关病症的对照比较；并且基于相对于对照的与蛋白质结合的HPV抗体的特征鉴定患者患有HPV-相关病症。在一些情况中，所述蛋白质包括HPV16 E1、NE2、CE2、E4、E6、E7、和L1中的一种或多种。在一些情况中，所述蛋白质包括HPV18E1、E2、和L1中的一种或多种。

以下实施例进一步描述了本发明，这些实施例并不限制权利要求书所述的本发明范围。

实施例

本文的一些实施方式采用新的可编程珠试验ELISA来检测HPV16-阳性头颈癌患者的血清样品中的人乳头瘤病毒16型(HPV16)蛋白质组。这些蛋白质使用体外转录和翻译(IVTT)实时表达，然后结合至平板、单重或多重珠用于检测单血清样品中的多种抗原。患者中检测到的HPV16抗原可用作潜在诊断和预后生物标记以及在症状诊断前2年以70％灵敏度和90％特异度检测疾病中的临床用途。

从布朗大学获得训练组的患者血清，其具有由默克公司(Merck)开发的竞争性Luminex免疫试验(cLIA)所确定的头颈癌状态和HPV16或HPV18-阳性的已知数据。对照血清也获自相同部位并且匹配至年龄(±5岁)、停留处和性别。然后从Dana-Farber癌症研究院和约翰霍普金斯大学(Johns Hopkins University)获得该实验的验证组。

这些样品获自治疗前的头颈癌病例，并且匹配的对照包括该情况的健康参与者。另一组获自CDC的对照含有来自患有证明宫颈感染HPV16的女性的血清，采用罗氏原型线印迹试验用针对剥落的宫颈细胞的HPV16DNA呈阳性来确认。所有血清样品储存在-80℃下直至使用。

通过巢式PCR获得PV16和18基因E1、E2、E4、E5、E6、E7、L1、和L2。发现HPV16 E2弱表达并且因此片段化成N-和C-端的半截部分。用来自HPV16和HPV18纯化质粒DNA的基因特异性引物来进行初始PCR。使用引物衍生PCR来添加attB用于重组克隆。然后按照生产商的推荐使用BP克隆酶(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，CA))将att PCR产物插入pDONR221载体并且用LR重组酶(英杰公司)转化成pANT7GST载体。然后使用标准大量质粒提取(maxi-prep)来纯化DNA，之后进行序列确认。

抗-GST抗血清被透析到PBS中以去除叠氮化钠，并且然后用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)偶联至SeroMAP微球(德克萨斯州奥斯汀的Luminex公司(Luminex Corporation，Austin，TX))。使用离心来从上清中分离微球。首先去除储存微球的溶液，然后用无菌水来洗涤微球。微球然后在100mM磷酸二氢钠，pH 6.2中重悬。然后添加50mg/ml磺基-NHS，之后是50mg/ml EDC并且在室温(RT)下孵育20分钟以活化微球上的羧基。

然后用50mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)洗涤活化的微球2次。在用MES重悬之后，以5μg/1百万微球添加抗-GST，并且然后在室温下旋转孵育2小时。然后去除上清并且偶联的微球在PBS-BN(PBS，1％BSA，0.05％叠氮化物，pH7.4)中重悬，并在室温下旋转孵育30分钟。再次去除上清并且偶联的微球在PBS-0.05％吐温，pH 7.4中重悬，持续总共2次洗涤。偶联的微球在PBS-BN中在4℃下避光储存。使用血细胞计数器来确认最终微球计数。

各HPV基因按照生产商的推荐(威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega Corporation，Madison，WI))使用单批次的T7网状细胞裂解物和500ng DNA表达成GST-融合蛋白。也表达载体和p21-GST作为对照。在体外转录和翻译(IVTT)之后，表达的蛋白质在PBS-1％BSA中以40微球/μl在2000个抗-GST偶联的微球上捕获。

然后，将蛋白质结合的微球收集到一起以形成多重试验，然后再等分到96-孔滤板中，并使用真空过滤系统用PBS-1％BSA洗涤。微球用PBS-1％BSA中10％的来自小鼠、兔、山羊和大鼠的各普通血清；0.5％聚乙烯醇；0.8％聚乙烯吡咯烷酮；和2.5％Chemicon(马萨诸塞州比尔里卡的密理博公司(Millipore Corporation，Billerica，MA))在室温下振荡1小时来封闭。血清在相同的封闭缓冲液中以1∶80稀释并且用微球在4℃下过夜振荡孵育。添加4μg/ml的生物素偶联的山羊抗人IgG抗体和4μg/ml的链霉亲和素-R-PE。使用Luminex200IS 2.3软件来测量中值荧光强度(MFI)。为了控制非特异性和GST-特异性自抗体背景，测量了单独HPV-特异性抗体的MFI与对照p21-GST抗原的MFI的比率。

就结果而言，在患者血清中检测到了针对多种HPV-衍生的早期基因的抗体应答。与健康对照样品相比，HPV16 E1、E2、E4、E6、E7、和L1抗体水平(但不是ES或L2)在HPV16 L1 Ab+患者中升高(由默克试验确定)。中值MFI比率为：E1 39对比2.0，p＜0.0001；E2 2.7对比1.4，p＜0.0001；E4 9.1对比1.4，p＜0.001；E6 10对比2.1，p＜0.0001；E7 3.9对比2.0，p＜0.01；和L1 10.8对比2.4，p＜0.0001。对于由默克试验确定的具有HPV18 L1抗体的患者，仅具体检测到针对HPV18 E1(11.9对比2.3，p＜0.001)；E2(20.7对比1.9，p＝0.0016)，和L1(9.8对比2.7，p＜0.0001)的抗体。没有检测到HPV16和HPV18-特异性抗体之间的交叉反应性。

因此，已经开发了定制的多重珠试验用于快速检测患者血清中的HPV16和HPV18-特异性抗体。

用于检测口咽癌的HPV16血清学生物标记物

使用了以下缩写：CV，变异系数；HPV，人乳头状瘤病毒；IVTT，体外转录/翻译；OPC，口咽癌；OR，让步比；SD，标准偏差。

人乳头状瘤病毒(HPV)16型是大部分口咽癌(OPC)的病因。针对HPV16蛋白质组的抗体(Ab)是HPV-相关OPC(HPV-OPC)的潜在生物标记物。

使用可编程ELISA试验来对针对HPV16抗原E1、E4、E5、E6、E7、L1、L2，以及E2的N-端和C-端(NE2，CE2)的IgG抗体进行定量。从分成训练组和验证组的258个诊断的OPC患者以及250个健康对照获得血清。已知137个病例的通过PCR测量的HPV16肿瘤状态，其中111个是HPV16阳性。确定了各抗原与对照GST蛋白质的平均发光(RLU)值的比率。通过威尔科克森秩和检验来计算P-值。

与健康对照相比，HPV16 E1、E2、E4、E5、E6、E7、和L1-特异性IgG水平在OPC患者中上升(p＜0.05)。使用SVM分类器建模，鉴定了用于OPC癌症的潜在诊断的7-Ab生物标记物组(E1、NE2、CE2、E4、E5、E6、E7)。对于患有已知HPV16-阳性肿瘤的患者亚组(n＝111)，98％特异度下的灵敏度为90％(AUC＝0.94)。在多变量调整之后，任意抗原的Ab阳性与OPC风险相关(OR[95％CI]，65.6[26.0-165.1])。在病例中，Ab阳性与具有HPV16阳性肿瘤(OR[95％CI]，5.3[1.3-21.2])强烈相关，并且尤其是在≤10包年(pack year)吸烟史的群体中(OR[95％CI]，22.7[2.5-208.8])。

因此，已经产生了用于早期检测HPVOPC的HPV16 IgG Ab的新生物标记物组。

通过以下实施例，在德克萨斯州休斯顿的德克萨斯大学，M.D.Anderson癌症中心开始治疗之前(n＝258)，从患者中选择用于以下分析的血清。生物储备库中的样品从参加2006年1月至2008年9月的头颈临床试验的患者中收集并且与人口统计学、流行病学和临床数据相关联。患者使用标准化问卷提供人口统计学和接触史，包括抽烟和饮酒，并且提供血液样品用于生物学测试。健康对照血清获自德克萨斯大学，M.D.Anderson癌症中心，频率在年龄、性别和种族上匹配病例(n＝250)。病例和对照先验随机分配到训练组和验证组。所有样品使用标准化的样品收集方案收集并在-80℃下储存直至使用。在机构审查委员会的批准下，获得了所有对象的书面知情同意。

含有序列验证的全长cDNA表达质粒(pANT7_cGST)的Gateway-相容性供体系统从亚利桑那州立大学的生物设计院的DNASU质粒储存库获得，并且在dnasu.org/DNASU/上网上公开。DNA经纯化并插入pANT7_cGST载体中。在pANT7_cGST载体中，各HPV16基因按照生产商的说明使用人HeLa细胞裂解液(马萨诸塞州沃特汉姆市的热科学公司(Thermo Scientific，Waltham，MA))表达为C-端GST-融合蛋白。HPV16E2基因表达为N-和C-端片段用于优化蛋白质表达。GST表达为阴性对照蛋白质。

进行ELISA，采用以下修饰：采用IVTT使用HeLa细胞裂解液从200ng模板cDNA表达88μ1蛋白质，并在抗-GST抗体偶联的96孔板(新泽西州皮斯卡特维的GE医疗公司(GE Healthcare，Piscataway，NJ))上捕获。血清以1∶100稀释并且用10％大肠杆菌DH5a裂解液在室温下封闭2小时，然后用表达的蛋白质孵育1小时。使用BioMek NxP实验室自动化工作站(加利福尼亚州布瑞亚的贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter，Brea，CA))来进行封闭物、血清和抗体的添加。同时一式两份分析病例和对照。以1∶10000添加辣根过氧化物酶(HRP)抗-人IgG抗体(宾夕法尼亚州西格鲁甫的杰克逊免疫研究实验室公司(Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA))并且使用Supersignal ELISA Femto化学发光底物(热科学公司)检测。以425nm处Glomax 96微孔板光度计(威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司)上的相对光单位(RLU)检测发光。为了控制非特异性和GST-特异性抗体，测量了单独HPV-特异性抗体的RLU与对照GST抗原的RLU的比率。

根据对用于确定肿瘤HPV状态的诊断的组织病理学确认获得诊断性内部石蜡包埋的组织。使用组织DNA提取试剂盒(加利福尼亚州巴伦西亚的凯杰公司(Qiagen Inc.，Valencia，CA))来提取DNA。使用基于PCR的类型特异性试验测试来自研究对象的肿瘤组织是否存在HPV E6或E7区，并且各对象基于这些结果分类为HPV-阳性或HPV-阴性。样品一式三份与阳性(Siha细胞系)和阴性(TPC-1细胞系)对照一起运行，并且β-肌动蛋白作为DNA质量对照。

所有试验一式两份进行，并且将值绘制成平均值。为了确定截止值，RLU比率＞训练组对照样品的(平均+3标准偏差)(n＝125)被指定为阳性。这些水平为E1：2.66；NE2：2.29；CE2：4.35；E4：2.58；E5：1.69；E6：2.01；E7：1.99；L1：1.84；L2：3.58。使用曼-惠特尼非参数检验来进行比较(GraphPad Prism版本5.0c，加利福尼亚州圣迭戈)。使用二元逻辑回归分类器建模，我们计算了接受者操作特性曲线(ROC)下的面积作为比较所有抗体组的组合的早期诊断OPC癌症性能的基础。

使用Stata 12.0(德克萨斯州学院站的Stata公司(StataCorp，College Station，TX))作为所有统计学分析的基础。p-值＜.05被认为是显著的并且所有测试是双侧的。产生类别变量以描述研究对象的人口统计学、临床和接触(吸烟和酒精)史。如果对象在其生命中已抽吸至少100支烟，则他们被认为是常吸烟者(ever-smoker)，并且如果对象在其生命中已经每周至少一次饮用酒精饮料持续1年或更久，则他们被认为是常饮酒者(ever-drinker)。之前吸烟或饮用酒精但是其诊断前的一年没有这样做的对象被分别认为是前吸烟者(former-smoker)和前饮酒者(former-drinker)。

使用标准说明统计学方法来分析感兴趣的人口统计学和临床变量。对于类别变量，使用卡方检验或菲希尔精确(细胞频率＜5时)检验，并且对于连续变量，使用斯氏t检验(调整不相等变量)来比较组间差异。

使用逻辑回归模型来计算95％置信区间(CI)的让步比(OR)，调整可能混淆的因素以确定肿瘤HPV状态与使用HPV16的治疗前抗体状态之间的关联。对于HPV-，HPV+＞10包年吸烟史，和HPV+≤10包年吸烟史之间的比较，使用多元逻辑回归，使用HPV-患者作为基础结果。

初步目标是确定：是否在新诊断患有OPC的患者中检测到任何HPV16-特异性抗体。参与正在进行的针对头颈癌的大型分子流行病学研究的患有新诊断的、组织病理学确认的并且之前未治疗的口咽癌的患者适于该研究。在来自随机分成训练组和验证组的258个OPC病例和250个年龄、性别和种族匹配的对照的血清中比较针对HPV16蛋白质和GST对照蛋白质有特异性的抗体水平。从进一步研究中略去2个病例，因为他们在诊断时有远处转移，留下256个病例的样本大小。病例和对照的人口统计学示于表1。

表1.病例和对照的人口统计学、接触和临床特征

^a针对不相等变量调节

大部分病例衍生自扁桃体或舌根(95％)并且呈现为III/IV期(92.6％)。虽然在病例和对照之间吸烟状态上没有差异(表1)，对照报告了现时饮酒的更高发生率(46.5％病例对比59％对照，p＝0.025；表1)。在256个病例中，可获得137个病例的HPV状态(有针对E6和E7的HPV肿瘤PCR所确定)，其中111个病例是HPV16阳性(81％)。

图1显示了健康对照和OPC病例的合并组中针对HPV16抗原的血清IgG抗体的RAPID ELISA结果。为了控制非特异性和GST-特异性自抗体背景，测量了单独HPV-特异性抗体的RLU与对照GST抗原的RLU的比率。在总OPC样品(未由HPV状态选择)中，在OPC患者中，除了L2以外的所有HPV16抗体明显高于健康对照(p＜0.05，图1)。

比健康对照更高比例的OPC患者对于这些抗体各自都是血清阳性的(表2)。

表2.治疗前抗体状态与病例-对照状态的关联

^a任意阳性对比全部阴性

^b菲希尔精确检验

^c针对年龄、吸烟和酒精状态调整

NC，由于零细胞而不可计算

使用来自训练组健康对照的截止值(＞平均以上3SD)，与15/250(6.0％)的健康对照相比，在213/256(84.2％)的OPC病例的血清中检测到至少一种HPV16早期基因抗体(表2)。大部分患者是对于HPV16E1(144/256，56.3％)、NE2(104/256，40.6％)、CE2(137/256，53.5％)、E6(148/256，57.8％)、和/或E7(148/256，57.8％)的抗体是阳性的。与此相比，仅15个病例(5.9％)对L1抗体是阳性的并且没有病例对L2抗体是阳性的。针对E1、E2、E4、E5、E6、和E7的抗体在验证组的病例和对照之间明显不同。

通过计算OR(95％CI)(针对年龄和性别调整)来估计OPC风险(表2)。E1、E2、E6、和E7抗体的OR范围是31.5-335.3。虽然95％CI是宽泛的，OPC的极高风险与E2的N-端部分(OR＞300)、E6蛋白(OR＞250)、和E1蛋白(OR＞150)的血清阳性相关。对任何抗原呈血清阳性与66倍增加的OPC风险相关，同时对早期蛋白质呈血清阳性与93倍增加的OPC风险相关，并且对晚期蛋白质呈血清阳性与5倍增加的OPC风险相关。

在137个具有通过PCR测试HPV16 E6或E7DNA的肿瘤组织的病例中，111个(81.0％)确定为HPV肿瘤阳性，并且26个(19.0％)是HPV肿瘤阴性。

在HPV肿瘤阳性病例中，95/111(85.5％)对于至少一种HPV早期抗原而言是血清学阳性的。然而，16/26(61.5％)的HPV肿瘤阴性病例对于至少一种HPV早期抗原而言也是血清学阳性的。针对NE2或E6的抗体的存在也与HPV肿瘤状态(OR[95％CI]，分别是5.8[1.8-19.4]和4.5[1.6-12.6])相关，并且这在吸烟史小于或等于10包年的人中特别如此(OR[95％CI]，分别是22.3[3.9-26.8]和8.9[2.7-28.9])。对于任意分析的蛋白质的血清阳性与吸烟史≤10包年的HPV肿瘤状态强烈相关，但是这种相关主要针对早期蛋白质(OR[95％CI]，21.3[2.3-192.8])而不是晚期蛋白质。在吸烟者中(吸烟史＞10包年)，没有鉴定到血清阳性和HPV肿瘤状态之间的持续相关性。HPV16 E2、E6、和E7的血清学与HPV肿瘤状态的相关性被抽烟隔离。

对于HPV肿瘤阳性状态的患者亚组(n＝111)，基于他们与HPV肿瘤状态的个体强烈相关性，我们评价了早期抗原特异性抗体的组合作为一组。使用多个截止值，与对照相比，大部分病例是E6和/或E7抗体(88/111，79.3％)阳性的。整个组的添加(至少一种HPV16早期基因抗体)与对照相比改善了对95/111(85.5％)病例的检测的灵敏度。E1抗体与NE2抗体强相关(R²＝0.63)。

我们使用训练组中具有已知HPV16肿瘤阳性状态的患者(n＝111)和对照(n＝125)的亚组来构建对疾病状态的分类器，并且比较E6/E7-特异性抗体的组合(图2A，实线)和7种早期抗原特异性抗体的整个组(图2B，实线)。然后，我们使用分类器来构建验证组中病例(n＝111)和对照(n＝125)的独立HPV16肿瘤阳性接受者操作特征曲线。在98％特异度下，E6/E7抗体组的灵敏度为84％(AUC＝0.9276)。相比而言，7-抗体组(E1、NE2、CE2、E4、E5、E6、和E7)具有改善的98％特异度下90％的灵敏度(AUC＝0.9395，图2，虚线)。与单独截止值相比，使用分类器同时改善了该组的灵敏度和特异度。

大部分口咽癌与人乳头瘤病毒16型(HPV16)相关。由于上升的HPV-OPC发生率，临床上迫切需要用于这些患者的早期组检测、诊断、预后和监测的生物标记物。之前的研究已经证明HPV-OPC的患者亚组(约64-74％)在他们的血清中有可检测的针对HPV16E6的抗体和/或E7抗体。在先驱研究中，我们观察到OPC患者内针对HPV16早期蛋白质的血清应答的个体特征的显著异质性，表明针对多种HPV16-衍生的蛋白质的IgG抗体的组可改善对HPV-OPC的检测。在本发明的研究中，我们评价了对整个HPV16蛋白质组有特异性的抗体作为潜在生物标记物用于诊断OPC，使用大量预期收集的来自过去十年在MD Anderson癌症中心呈现OPC的头颈临床症状的患者的血清。

我们证明，与年龄、性别和种族匹配的对照相比，在患者血清中特异性地检测到针对多种HPV16早期抗原(E1、E2、E4、E5、E6、和E7)的抗体。针对HPV16早期抗原(E1、E4、E5、E6、E7、以及E2的N-和C-端片段)的整个组的抗体以98％的特异度检测到90％的HPV16+病例。我们的数据支持以下假设，HPV16抗体特性可以是HPV-OPC的特异性且临床有用的生物标记物，并且潜在针对其他HPV-相关恶性肿瘤。

这项研究的一个限制在于，在招募这些患者的10年中检测肿瘤组织中HPV的标准和方法的快速发展变化。目前还没有用于HPV的组织生物标记物的标准，虽然通过IHC检测的p16表达通常用作替代标记物，用或不用针对HR HPV核酸的ISH。通过针对HPV16E6和E7的PCR来确定这项研究中HPV状态分配。这些病例中只有一小亚组具有可用于针对p16免疫组织化学的组织(n＝22)。因此，我们无法用p16测试来确认组织HPV状态。

在通过PCR鉴定组织HPV16状态的病例亚组中(n＝137)，在85.6％的具有通过PCR测试为HPV16阳性的肿瘤的病例中检测到针对HPV16早期抗原(E1、E2、E4、E5、E6、E7)的抗体，但是61.5％的组织HPV PCR为阴性的病例仍然是血清学阳性的。这些血清学应答在强度和抗原性特异性上与组织HPV PCR阳性病例中的应答是相似的(数据未显示)。由于10-15％的HPV-OPC与除HPV16以外的HPV亚型相关，我们不能排除在血清阳性的PCR阴性群中血清试验与其他亚型HPV有交叉反应。第二种可能性是用于该研究中的HPV16PCR具有优先的灵敏度(假阴性)，这无法通过该研究中的p16测试来确认。

我们的数据确认并延伸了证明在新诊断HPV-OPC的患者中检测到E6和E7抗体的公开研究。在此，我们在79.3％的HPV-OPC患者中检测到E6和/或E7抗体(n＝111)。我们的结果与我们在来自独立多中心HOTSPOT研究的76.0％的HPV-OPC患者(n＝119)中E6和/或E7抗体的发现相似，这表明在对HPVOPC的血清学检测中存在有限的区域或技术变异。

这也表明，HPV状态定义(用于该研究中的PCR)对比HOTSPOT中的p16/ISH的差异并没有显著影响这些结果。使用人细胞裂解液的体外蛋白质表达的技术改善和对试验的广泛优化已经改善了可编程ELISA检测的分析限同时最小化变异和背景。使用全组的早期蛋白质，在98％特异度下，检测灵敏度改善至90％，这强烈支持了用于HPV-OPC检测的多参数特性的使用。

从我们的数据中，值得注意的发现是这些患者中针对HPV16的血清应答的异质性，这具有未知的生物或临床意义。大部分(79.3％)患者血清具有针对E6和/或E7的抗体，但是也特异性地检测到针对多种其他早期基因，包括E1、E2和E4的抗体。这对于HPVOPC而言是独特的，因为在患有侵入性宫颈癌的患者的血清中很少检测到这些抗体。E1抗体与E2抗体强相关，并且仅在具有E7抗体的患者的亚组(25.7％)中检测到E4抗体。5％的患者具有针对E1/E2抗原的分离抗体，而没有E6/E7抗体。

由于通过抗原表达来诱导体液免疫，我们预测针对单独HPV抗原的血清应答的患者间差异是肿瘤中抗原表达差异的结果。事实上，通过IHC观察到E6和E7表达中的差异。在此时，还没有关于OPC组织中E1、E2、E4、或E5抗原的蛋白质表达的公开数据。在充分认识其中疾病进展中的病毒发病机理的动态作用的宫颈疾病中，E2在CIN II/III中高表达，并且表达由于E6/E7的病毒整合和解除抑制而降低。因此，我们预测可在HPV-OPC发展中比E6/E7抗体更早地检测到针对E2(和可能的E1、E4和E5)的抗体。

针对HPV早期抗原的抗体的生物学结果未知。这些抗体很少在患有HPV感染的患者的没有异常发育的宫颈中被检测到(如通过罗氏线性试验测量)(CIN 0/1)，表明他们是癌症而非急性感染的生物标记物。2个研究已经显示针对E6和/或E7蛋白质的抗体与改善的HPV-OPC临床预后相关，但这仍需要在更大的HPV-OPC组中确认。

表3.训练和验证组中病例和对照的HPV16 IgG检测的RLU比率和范围。

RLU比率＊(范围)

特异性HPV16抗体可能预测HPV+口咽癌中改善的预后

人乳头状瘤病毒16型(HPV16)导致大部分口咽癌(OPC)。如本文所述，针对特定HPV16蛋白质的抗体(Ab)是针对HPV16+OPC改善的预后的潜在生物标记物。

使用可定制编程ELISA试验来对针对HPV16抗原E1、E4、E5、E6、E7、L1、L2，以及E2的N-端和C-端(NE2，CE2)的IgG抗体进行定量。从97个在诊断时由PCR确认的HPV16+OPC患者获得血清。确定了各抗原与对照GST蛋白质的平均荧光强度(MFI)值的比率。通过Cox比例风险回归来确定与临床结果的相关性。

HPV16 E1的存在以及NE2-特异性IgG水平都与HPV16+患者中改善的总体和无复发存活强相关(p＜0.05)。在研究期间结束时存活的那些的中值随访时间为49个月(针对总体存活)和46个月(针对无复发存活)。对于总体存活，当对吸烟(＞10包年吸烟史对比≤10包年吸烟史)、饮酒(常对比从不)、T类别(T3-4对比T0-2)、和亚位置(T/BOT对比其他)调整时，E1抗体阳性的危险比为0.2并且NE2抗体阳性的危险比为0.2(分别为p＝0.029和p＝0.022)。E6抗体阳性与死亡风险降低70％相关，虽然这在多变量调整之后不是统计学显著的(HR＝0.3；p＝0.074)。对于无复发存活，对于E1抗体阳性，调整的危险比为0.2，并且对于NE2抗体阳性，调整的危险比为0.2(分别为p＝0.014和p＝0.020)。

因此，我们已经鉴定了与HPV16+OPC的改善的总体和无复发存活相关的2种HPV16-特异性抗体。

另外，我们已经鉴定了作为头颈癌的潜在诊断生物标记物的一组HPV16抗原。我们之前已经鉴定了单独抗原，我们现在已经用关于用于检测这些癌症的这些抗原的最优组的大得多的数据库提供了详细信息。未包括在该组中的其他HPV抗原也可有益处。

目前，还没有用于HPV+头颈癌的早期检测的生物标记物。针对来自HPV16的E6和E7蛋白质的抗体已经鉴定为潜在诊断性抗原。我们已经开发了针对整个HPV16蛋白质组的新试验，并且已经证明一组这些抗原用于癌症检测(和潜在检测复发或监测治疗)的具体应用。

我们鉴定了三种抗原作为HPV+头颈癌的潜在预后生物标记物：针对蛋白质HPV16 E1、E2的N-端、和E6的抗体。目前，所有HPV+头颈癌患者经过标准头颈癌治疗。然而，他们总体上有良好预后，并且可受益于更低剂量的放疗和/或化疗。我们已经开发了试验并且鉴定了有特别良好预后的那些患者的亚组。

我们已经开发了一种称为快速抗原性蛋白质原位展示(RAPID)的可定制编程的ELISA试验用于在患者血清中检测针对HPV抗原的抗体。RAPID ELISA采用原位蛋白质表达和捕获用于标记的蛋白质的抗原展示，能够高效并特异性展示HPV16的蛋白质组，以及肿瘤抗原p53，其在20％的患有p53-突变癌症的患者中是高度免疫原性的。在该研究中，我们研究了HPV16作为用于HPV+OPC诊断的生物标记物的应用。我们使用广泛追溯收集的来自新诊断OPC患者的血清来评价HPV16蛋白质组范围血清学、疾病状态、年龄、吸烟和肿瘤HPV状态之间的相关性。

在德克萨斯州休斯顿的德克萨斯大学，M.D.Anderson癌症中心开始治疗之前(n＝256)，从患者中选择用于OPC疾病分析的血清。由俄勒冈州波特兰市的俄勒冈健康和科学大学(组1，n＝78)和德克萨斯大学M.D.Anderson癌症中心(组2，n＝50)获得对照患者血清。所有样品使用标准化的样品收集方案收集并在-80℃下储存直至使用。在机构审查委员会的批准下，获得了所有对象的书面知情同意。

含有序列验证的全长cDNA表达质粒(pANT7_cGST)的Gateway-相容性供体系统从亚利桑那州立大学的生物设计院的DNASU质粒储存库获得，并且在dnasu.org/DNASU/上网上公开。DNA经纯化并插入pANT7_cGST载体中。磁性羧酸化微球(德克萨斯州奥斯汀的Luminex公司)以5μg的抗-GST抗血清(新泽西州皮斯卡特维的GE医疗公司)的比率偶联至一百万的珠。使用人HeLa细胞裂解液(马萨诸塞州沃特汉姆市的热科学公司)和500ng DNA将各HPV基因表达为GST-融合蛋白。GST-对照载体表达为阴性对照蛋白质。HPV16 E2基因表达为N-和C-端片段用于最优蛋白质表达。

基本如本领域已知的那样进行珠阵列ELISA，采用以下修改。使用人HeLa细胞裂解液进行体外转录/翻译(IVTT)，并且产物各自在微球(Luminex)上捕获，收集，并用稀释到SeaBlock(伊利诺州洛克福德的热科学公司)中的(蒙大拿州博兹曼的欧米茄生物公司(Omega Biologicals，Bozeman，MT))封闭。血清以1∶80稀释并且与封闭缓冲液中收集的珠在4℃下过夜振荡孵育。为了进行检测，以1∶10000添加藻红蛋白-标记的山羊抗-人IgG抗体(宾夕法尼亚州西格鲁甫的杰克逊免疫研究实验室公司)，并且然后检测中值荧光强度(MFI)。为了控制非特异性和GST-特异性抗体，测量了单独HPV-特异性抗体的MFI与对照GST抗原的MFI的比率。

基本如珠阵列ELISA那样进行单重可编程ELISA，采用几处关键修改。如上所述，使用人HeLa细胞裂解液进行体外转录/翻译(IVTT)，并且产物各自在抗-GST(源)包被的96-孔板(板类型)上捕获。血清以1∶80稀释并且用大肠杆菌DH5a细胞的裂解液(通过超声制备)封闭。使用山羊抗-人IgG抗体(宾夕法尼亚州西格鲁甫的杰克逊免疫研究实验室公司)和ECL来检测结合的IgG。

如果存在E6和/或E7DNA，则病例通过肿瘤PCR确定为HPV阳性。

在多重化平台上使用Luminex xPONENT软件(马萨诸塞州比尔里卡的EMD密理博公司(EMD Millipore，Billerica，MA))，50个计数/分析来进行净MFI测量。所有试验一式两份进行，并且值绘制成平均值。为了确定截止值，MFI比率＞78个对照样品的(平均+3标准偏差)被指定为阳性。这些水平为E1：1.4；CE2：2.4；NE2：1.5；E4：2.7；E5：1.5；E6：1.7；E7：2.2；L1：1.4；L2：1.4。使用曼-惠特尼非参数检验来进行比较(GraphPad Prism版本5.0c，加利福尼亚州圣迭戈)。使用二元逻辑回归分类器建模，我们计算了接受者操作特性曲线(ROC)下的面积作为比较所有抗体组的组合的早期诊断OPC癌症性能的基础。

患有OPC的患者被鉴定为适于该研究。从病例对象中获得治疗前的血液样品。从258个对象中获得HPV16的血清学。2个病例在他们显示远处转移时从进一步研究中略去。在256个病例中，获得了137个病例的通过HPV肿瘤PCR确定的HPV状态。在22个病例上进行P16免疫染色，并且在55个病例上进行ISH。从参加俄勒冈头颈癌筛选中的健康供体群中选择对照(组1，n＝79)。一个对照由于扁桃体癌的病史而略去。病例和对照的人口统计学示于表1。为了控制基于年龄、性别和位置的潜在偏差，从MD Anderson癌症中心的健康供体群中选择第二组对照样品(组2，n＝50)。

收集治疗前的病例血清。从健康俄勒冈州波特兰地区没有癌症病史的健康男性和女性收集对照血清和问卷。通过MagProBE测量病例和对照血清中针对HPV16抗原的血清IgG抗体(图3)。为了控制非特异性和GST-特异性自抗体背景，获取了单独HPV-特异性抗体的MFI与对照GST抗原的MFI的比率。各单独抗原的这些值的平均和范围示于表3。使用从对照生成的截止值，与11/78(14.1％)的健康对照相比，在225/256(87.9％)的OPC病例的血清中检测到至少一种HPV16抗体。大部分患者对于E1、CE2、NE2、E6和/或E7抗体分别显示69.1％(177/256)、47.3％(121/256)、77.3％(198/256)、74.6％(191/256)、和64.8％(166/256)百分比的阳性。如果存在一种或多种阳性抗体，则一个病例在血清学上被确定为HPV-阳性。

在137个通过PCR测试HPV肿瘤状态的病例中，111(81.0％)个确定为HPV肿瘤阳性，并且26(19.0％)个是HPV肿瘤阴性。

比较了血清学和通过肿瘤PCR的HPV-状态的结果。在HPV肿瘤阳性病例中，100/111(90.0％)对于至少一种HPV抗原而言也是血清学阳性的。18/26(69.2％)的HPV肿瘤阴性病例对于至少一种HPV抗原而言是血清学阳性的。存在针对CE2和/或NE2的抗体与HPV肿瘤炎性OPC相关(OR，5.8；95％CI)，如同存在针对E6和/或E7的抗体那样(OR，4.1；95％CI)。当针对吸烟调整时，吸烟史小于或等于10包年且对CE2和/或NE2血清阳性的那些的与HPV-阳性OPC的关联性的让步增加22倍(OR，22.3；95％CI)。对E6和/或E7血清阳性的吸烟者与HPV-阳性OPC的关联性的让步也增加12倍(OR，11.8；95％CI)。

我们使用威尔科克森秩和检验比较了IPC患者和健康对照样品中的HPV16E1、E2、E4、E6、E7、和L2抗体水平(p＜0.0001)。对于具有HPV肿瘤阳性状态的患者亚组(n＝113)，我们鉴定了一个4-抗体生物标记物组(NE2、CE2、E6、E7)。该组的最优操作点为97％的特异度下90％(AUC＝0.96)。这种AUC对应于其中假阳性率至多2.5％的值。

用于头颈癌预后的HPV血清学

人乳头状瘤病毒16型(HPV16)导致大部分口咽癌(OPC)。针对特定HPV16蛋白质的抗体(Ab)是针对HPV16+OPC改善的预后的潜在生物标记物。

最终分析中总共包括209个患者。这些患者中，114个具有亚组分析可用的肿瘤HPV16状态；这些患者中96个有HPV16-阳性肿瘤。存活患者的中值随访时间是62.7个月(范围，3.9-96.9个月)。存活的HPV16-阳性肿瘤患者的中值随访时间是68.9个月(范围，4.1-92.5个月)。对于有肿瘤HPV16状态和没有该状态的患者的存活而言，没有差异(P＝.577)。

在对任意E抗体阳性的患者中，无进展存活更好(图5A)，但是在对任意L抗体阳性的患者中没有注意到存活优势(图5B)(分别为P＜.001和P＝.657)。因此，我们在后续分析中排除了L抗体状态。

HPV16 E1的存在以及NE2-特异性IgG水平都与HPV16+患者中改善的总体和无复发存活强相关(p＜0.05)。在研究期间结束时存活的那些的中值随访时间为49个月(针对总体存活)和46个月(针对无复发存活)。对于总体存活，当对吸烟(＞10包年吸烟史对比＜10包年吸烟史)、饮酒(常对比从不)、T类别(T3-4对比T0-2)、和亚位置(T/BOT对比其他)调整时，E1抗体阳性的危险比为0.2并且NE2抗体阳性的危险比为0.2(分别为p＝0.029和p＝0.022)。E6抗体阳性与死亡风险降低70％相关，虽然这在多变量调整之后不是统计学显著的(HR＝0.3；p＝0.074)。对于无复发存活，对于E1抗体阳性，调整的危险比为0.2，并且对于NE2抗体阳性，调整的危险比为0.2(分别为p＝0.014和p＝0.020)。

对任意E抗体阳性的患者比对所有E抗体阴性的患者有更好的总体和无进展存活：5年总体存活估计分别为87.4％和42.2％，并且5年无进展存活估计分别为82.9％和46.1％(两者P＜.001)。在多变量Cox比例风险回归中，对任意E抗体阳性的患者有降低80％的死亡(HR，0.2；95％CI，0.1-0.4)和进展(HR，0.2；95％CI，0.1-0.5)风险(表4)。NE2阳性、E1阳性、和E6阳性降低死亡风险多达80％，并且降低进展风险多达70％(表4)因为吸烟是存活的强预测指标并且具有HPV-阳性肿瘤的患者更可能是从不吸烟的人或轻度吸烟者，我们也评价了具有10包年或更少吸烟史的患者亚组。在这些患者中(n＝130)，对任意E抗体阳性也与死亡(HR，0.1；95％CI，0-0.7)和进展(HR，0.1；95％CI，0-1.0)风险的显著降低相关(表4)。在从不吸烟的人和轻度吸烟者中，我们没有观察到对于整个组观察到的与单个抗体的强相关性；无论如何，在该亚组中观察到抗体-阳性患者中存活改善的趋势。

为通过E抗体状态和肿瘤HPV16 DNA状态比较患者之间的存活差异，我们生成了卡普兰-迈耶曲线(图6)。图6A显示了E抗体状态的无进展存活，并且图6B显示了肿瘤HPV16 DNA状态的无进展存活。虽然E抗体阳性和HPV16肿瘤阳性与明显更好的存活相关，E抗体状态似乎是更强的预测指标(E抗体状态的P＜.001和HPV16的P＝.016)。这在多变量Cox比例风险回归中得到确认，其中E抗体阳性和HPV16阳性都是总体和无进展存活的强预测指标。在多变量调整之后，对E抗体阳性的患者的死亡风险降低80％(95％CI，0.1-0.5；针对年龄、吸烟和治疗调整)，并且针对肿瘤HPV16炎性的患者的死亡风险也降低80％(95％CI，0.1-0.7；针对年龄、吸烟、治疗和T类别调整)。类似地，E抗体状态和HPV16状态与无进展存活强相关(E抗体：HR，0.2；95％CI，0.1-0.5，在针对年龄、吸烟和治疗调整之后，并且HPV16：HR，0.2；95％CI，0.1-0.7，在针对年龄、吸烟、T类别和亚位置调整之后)。

我们使用ROC曲线来确定用于预测全部209个患者的疾病复发的E抗体的最佳组合。NE2、E4、E6和E7的组合显示最高的准确性；70.2％特异度下的最优操作点是71.4％(AUC＝0.71)。添加E1、CE2和E5并不改善这种效果。另外，相对于组合抗体，单独NE2和E6的准确性良好(AUC＝0.69和AUC＝0.61；数据未显示)。

在HPV16-阴性肿瘤患者中，E抗体阳性对于总体或无进展粗活都没有可证明的预测价值(数据未显示)。然而，当分析局限于HPV16-阳性肿瘤(通过PCR)的患者时，与对E抗体血清阴性的患者相比，对E抗体血清阳性的患者保持存活优势。这种相关性在多变量调整之后保持显著(对于总体存活，HR，0.3；95％CI，0.1-0.9，而对于无进展存活，HR，0.3；95％CI，0.1-0.8)。具体地，针对NE2、E1、和E6的抗体仍然是总体和无进展存活的强预测指标。

图8显示了根据复发状态，对于HPV-阳性OPC患者，随时间变化的E1、NE2和E6的中值抗体水平。随机选择的23个没有复发的患者亚组比8个复发的患者有更高的中值抗体水平，虽然由于样本大小太小，我们不能在统计学上检验组间的显著差异。

讨论

我们发现E1、NE2、和E6 HPV16抗体阳性都与整个组和具有已知HPV16-阳性肿瘤的患者中改善的总体和无进展存活强相关(P＜.05)。我们也发现，针对包被蛋白L的抗体血清阳性无法预测存活。因此，我们已经鉴定了与HPV16+OPC的改善的总体和无复发存活相关的3种HPV16-特异性抗体。该证据表明，针对参与HPV-介导的癌发生的抗原的血清应答，而不是针对感染过程(L蛋白质)而言重要的抗原的血清应答，可区别预测癌症结果。我们的发现支持了以下结论，即癌症结果部分取决于免疫应答，并且E抗体可以是致癌变化和预后的生物标记物。

除了评价针对E6和E7的血清应答以外(这是大多数研究的焦点)，我们评价了针对可用作存活标记物的HPV16蛋白质的更广泛阵列的血清应答。我们之前显示E6和E7阴性的HPV16-阳性肿瘤的患者的一小亚组对E1和NE2抗体阳性，这表明需要在HPV16血清学研究和诊断(23)中包括多种标记物。最近，我们在一项包括256个病例和250个对照的研究(数据未显示)中显示了E抗体阳性的个体中急剧增加的OPC风险。我们发现，对任意E抗体呈阳性的那些患者的OPC风险是对所有E抗体呈阴性的那些患者的244倍。此外，具有HPV16 DNA阳性的肿瘤的患者对任意E抗体呈阳性的可能性是具有HPV16 DNA阴性的肿瘤的患者的4倍，并且这种相关性在具有HPV16-阳性肿瘤的从未吸烟的人或轻度吸烟者的患者中特别强。

表4.治疗前抗体状态与总体和无进展存活的相关性的Cox比例风险回归

^a全部患者：针对年龄、吸烟、和治疗调整；吸烟史≤10包年的患者：针对年龄和治疗调整；HPV-阳性患者：针对年龄、吸烟、和T类别调整。

^b全部患者：针对年龄、吸烟、和治疗调整；吸烟史≤10包年的患者：针对年龄、N类别、和治疗调整；HPV-阳性患者：针对年龄、吸烟、和T类别调整。

NC：由于零细胞而不可计算。

口腔人乳头瘤病毒(HPV)

如前所述，使用PGMY 09/11引物和线印迹杂交测试了口腔冲洗样品的36种类型的HPV DNA。简言之，使用基于磁珠的自动化平台(QIAsymphony SP，凯杰公司(Qiagen))从口腔剥落细胞纯化DNA并且然后采用PGMY09/11PCR引物集和针对β-球蛋白的引物，之后是与Roche^TM线性阵列的反向线印迹杂交来分析36种不同的HPV DNA基因型。使用相同的方法和实验室在NHANES 2009-2010中生成口腔HPV感染数据。所有的口腔冲洗测试结果显示β-球蛋白阳性。

如前所述，也在ABI的7300实时PCR系统(加利福尼亚州福斯特城的应用生物系统公司(Applied Biosystems，Foster City，CA))中使用TaqMan定量实时-PCR(qPCR)来评价基线口腔冲洗样品的HPV16病毒载量。检测口腔脱落的细胞中的HPV DNA无法区分感染性病毒颗粒与胞内DNA；即，其是否是能够被传播的活性HPV感染，或其是否是从DNA已经整合且无感染性的肿瘤细胞脱落的HPV DNA。

在96孔板中，通过在Anderson实验室修改为单重试验的可编程ELISA集中测试血液样品(1∶100)的HPV16 L1、E6、和E7IgG抗体。蛋白质使用人HeLa细胞裂解液转录/翻译(IVTT)系统(热科学公司)表达并且用10％的通过超声制备的大肠杆菌DH5a裂解液封闭。发光度量为与GST-抗原对照的比率的相对光单位(RLU)。阳性血清的截止值定义为健康志愿者(n＝81)中观察的RLU比率的平均+3标准偏差。

164个HPV-OPC病例基于HPV16的原位杂交(ISH)的集中测试、机构致癌HPV ISH测试(n＝66)、或机构p16免疫组化(n＝43；其中的25个已经机构PCR测试，其中88％[22/25]为HPV16-阳性)分类为HPV-阳性，考虑到ISH和p16目前在临床条件中用于鉴定HPV-OPC。16个其他病例及其参与者基于HPV16的阴性集中测试(n＝8)或阴性局部p16(n＝8)结果从分析中排除。

使用对类别的卡方检验和对连续变量中值的检验比较有和没有招募的参与者的病例的特征。病例和参与者中的口腔HPV流行率与来自2009-10NHANES数据的基于群的样品中的加权流行率相比较，限于45-65年龄的个体，以与研究参与者相容。

如果在线印迹上检测到评价的36种HPV类型中的任一种，则口腔冲洗样品被认为对“任意口腔HPV”是HPV阳性。“任意致癌HPV”的流行率定义为检测到以下中的任何一种：HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、或73。也使用定量PCR(qPCR)来评价HPV16阳性，其阳性使用通用实验室截止值(2μ1的测试口腔冲洗样品中拷贝数＞3个拷贝)定义；由于关于可能的低水平传播的口腔HPV DNA的研究假设，也显示当拷贝数＞0时的结果。

图4显示了检测来自136个HPV-OPC病例、48个参与者、和81个健康志愿者的基线血清中的HPV16 E6和E7抗体。显示了血清中检测到的针对特异性HPV蛋白质/对照GST蛋白质的IgG的RLU比率。

应理解虽然本发明已结合其详述进行描述，但以上描述意在说明而不是限制本发明的范围，该范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优势和修改在以下权利要求的范围内。