具有含基于萘醌的调节剂和FAD‑GDH的酶试剂层的基于电化学的分析测试条的制作方法

技术领域

本发明整体涉及医疗装置，并且具体涉及基于电化学的分析测试条和在其中使用的酶试剂。

相关领域的描述

医学领域中特别关注对流体样本中的分析物或流体样本的特性的测定(例如，检测和/或浓度测量)。例如，可期望测定体液诸如尿液、血液、血浆或间质液的样本中的葡萄糖、酮体、胆固醇、脂蛋白、三甘油酯、对乙酰氨基酚、血细胞比容和/或HbA1c的浓度。可使用基于例如视觉、光度或电化学技术的分析测试条来实现此类测定。常规的基于电化学的分析测试条在例如美国专利5,708,247和6,284,125中有所描述，所述专利中的每个专利据此全文以引用方式并入本文。

附图说明

并入本文中并且构成本说明书的一部分的附图示出了本发明的目前优选实施例，并且与上面给出的一般描述和下面给出的详细描述一起用于说明本发明的特征，其中：

图1为根据本发明的实施例的基于电化学的分析测试条的简化分解透视图；

图2是沿其纵向轴线截取的图1的基于电化学的分析测试条的一部分的简化横截面侧视图(未按比例绘制)；

图3为根据本发明实施方案的酶试剂的线性性能图；

图4为根据本发明实施方案的酶试剂的尿酸敏感度的图；并且

图5为根据本发明实施方案的另一种酶试剂的线性性能图。

例示性实施方案的具体实施方式

应结合附图来阅读下面的具体实施方式，其中不同附图中相同元件的编号相同。各附图未必按比例绘制，仅出于说明的目的示出示例性实施方案，并不旨在限制本发明的范围。具体实施方式以举例的方式而不是限制性方式示出本发明的原理。此具体实施方式将清楚地使得本领域的技术人员能够形成和使用本发明，并且描述了本发明的多个实施方案、改型、变型、替代方案和用途，包括目前据信是实施本发明的最佳模式。

如本文所用，针对任何数值或范围的术语“约”或“大约”指示允许部件或多个部件的集合执行如本文所述的指定用途的适当公差。

本发明公开了一种根据本发明实施方案的用于测定体液样本中的分析物(诸如葡萄糖)的基于电化学的分析测试条，该基于电化学的分析测试条包括电绝缘基底层、设置在电绝缘基底层上并且包括至少一个电极的导电层、设置在该至少一个电极上的酶试剂层、图案化隔层和顶层。此外，酶试剂层包括至少一种基于萘醌的调节剂和FAD-GDH酶。基于萘醌的调节剂可为以下形式：

其中R为有机取代基。

例如，R可为–S-(CH₂)_n-X，其中n为1-6，通常为2-3，并且X为-SO₃H或-COOH。此类基于萘醌的调节剂可为例如1,2-萘二酮-4-(3-巯基-1-丙磺酸)和1,2-萘二酮-4-(3-巯基丙酸)。

酶试剂层还可包含表面活性剂、增稠剂，以及任选的干燥的缓冲至pH为7的磷酸盐水溶液。基于萘醌的调节剂可在涂覆至基于电化学的分析测试条期间以大约0.1mM至大约200mM、大约0.175mM、大约175mM或大约40mM范围内的浓度存在。具体地，1,2-萘二酮-4-(3-巯基-1-丙磺酸)可在涂覆至基于电化学的分析测试条期间以大约0.175mM或大约175mM的浓度存在。另选地，1,2-萘二酮-4-(3-巯基丙酸)可在涂覆至基于电化学的测试条期间以大约40mM的浓度存在。

可使用丝网印刷技术或喷墨印刷技术施用酶试剂层。酶试剂层的厚度可在大约0.1微米至大约15微米、大约0.1微米至大约5微米或大约5微米至大约15微米的范围内。通常，使用丝网印刷技术涂覆酶试剂层，并且厚度在大约5微米至大约15微米的范围内，或者使用喷墨技术涂覆酶试剂层，并且具有在大约0.1微米至大约5.0微米范围内的厚度。

体液样本可为全血样本，并且分析物可为葡萄糖。

根据本发明实施方案的基于电化学的分析测试条是有利的，因为至少一种基于萘醌的调节剂(例如，1,2-萘二酮-4-(3-巯基-1-丙磺酸)和1,2-萘二酮-4-(3-巯基丙酸)中的至少一种)和FAD-GDH酶的组合形成生化有效(例如，调节剂为双电子受体，产生不通过自由基途径进行的酶反应，并且酶反应(对一些基于萘醌的调节剂来说)的一级速率常数大于常规FAD-GDH调节剂铁氰化钾的一级速率常数)并且不受来自尿酸、对乙酰氨基酚、谷胱甘肽和抗坏血酸的干扰影响的酶试剂层。

在根据本发明的基于电化学的分析测试条中使用的酶试剂包含至少一种基于萘醌的调节剂，诸如例如(i)1,2-萘二酮-4-(3-巯基-1-丙磺酸)和(ii)1,2-萘二酮-4-(3-巯基丙酸)中的至少一种；以及黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶，本文缩写为FAD-GDH酶。此类酶试剂的有利之处在于它们形成生化有效(即，调节剂为双电子受体并且酶反应不通过自由基途径进行)并且不受来自尿酸、对乙酰氨基酚、谷胱甘肽和抗坏血酸的干扰影响的酶试剂层。此外，该酶试剂可在使用常规技术诸如喷墨印刷和丝网印刷制造基于电化学的分析测试条期间施加。

酶试剂可包含缓冲至pH为7的磷酸盐水溶液、表面活性剂和增稠剂。酶试剂可包含消泡剂。

基于萘醌的调节剂可以大约20mM至大约200mM、大约175mM或大约40mM的浓度存在。具体地，1,2-萘二酮-4-(3-巯基-1-丙磺酸)可以大约175mM的浓度存在。另选地，1,2-萘二酮-4-(3-巯基丙酸)可以大约40mM的浓度存在。

图1为根据本发明的实施方案的基于电化学的分析测试条100的简化分解透视图。图2为沿图1透视图的纵向轴线截取的基于电化学的分析测试条100的一部分的简化横截面侧视图(未按比例绘制)。图3为根据本发明实施方案的酶试剂的线性性能图。图4为根据本发明实施方案的酶试剂的尿酸敏感度的图。图5为根据本发明另一个实施方案的酶试剂的线性性能图。

参考图1至图5，用于测定体液样本(例如，全血样本)中的分析物(诸如葡萄糖)的基于电化学的分析测试条100包括电绝缘基底层102、图案化导电层104、图案化绝缘层106、酶试剂层108、图案化隔层110，以及由亲水性亚层114和顶带116组成的顶层112。

在图1和图2的实施方案中，至少图案化隔层和顶层限定基于电化学的分析测试条100内的样本接收室118(具体参见图2)。

电绝缘基底层102可为本领域的技术人员已知的任何合适的电绝缘基底层，包括例如尼龙基底层、聚碳酸酯基底层、聚酰亚胺基底层、聚氯乙烯基底层、聚乙烯基底层、聚丙烯基底层、糖化聚酯(PETG)基底层或聚酯基底层。电绝缘基底层可具有任何合适的尺寸，包括例如约5mm的宽度尺寸、约27mm的长度尺寸和约0.5mm的厚度尺寸。

电绝缘基底层102向基于电化学的分析测试条100提供结构，以便于处理，并且还用作涂覆(例如，印刷或沉积)后续层(例如，图案化导电层和通过根据本发明和本文所述酶试剂的喷墨印刷或丝网印刷形成的酶试剂)的基底。

图案化导电层104设置在电绝缘基底层102上，并且包括第一电极104a、第二电极104b和第三电极104c。第一电极104a、第二电极104b和第三电极104c可例如分别被构造为反电极/参考电极、第一工作电极和第二工作电极。因此，第二电极和第三电极在本文中也被称为工作电极104b和工作电极104c，并且第一电极也被称为反电极104a。虽然仅用于说明的目的，基于电化学的分析测试条100被描述为包括总共三个电极，但包括本发明的实施方案的基于电化学的分析测试条的实施方案可包括任何合适数量的电极。

基于电化学的分析测试条100的包括第一电极104a、第二电极104b和第三电极104c的图案化导电层104可由包括例如基于导电碳的材料的任何合适的导电材料形成，该基于导电碳的材料包括碳墨。应当指出的是，根据本发明的实施方案的基于电化学的分析测试条中所采用的图案化导电层可采取任何合适的形状，并且可由任何合适的材料形成，该材料包括例如金属材料和导电碳材料。

具体地参考图1和图2，设置第一电极104a、第二电极104b和第三电极104c以及酶试剂层108，使得基于电化学的分析测试条100被构造用于对已填充的样本接收室118的体液样本(诸如全血样本)中的分析物(诸如葡萄糖)进行电化学测定。此类全血填充的方向在图2中由标记为“S”的箭头示出。

酶试剂层108设置在图案化导电层104的至少一部分上(参见图1和图2)。酶试剂层108包括至少一种基于萘醌的调节剂以及FAD-GDH酶。如本文所用的术语“基于萘醌的调节剂”是指以下形式的调节剂：

其中R为任何合适的有机取代基。

适用于本发明实施方案的基于萘醌的调节剂的尤其有利的示例为1,2-萘二酮-4-(3-巯基-1-丙磺酸)[在本文中也称为化合物A]和1,2-萘二酮-4-(3-巯基丙酸)[在本文中也称为化合物B]。然而，一旦获悉本发明，本领域的技术人员便可采用常规试验选择合适的有机取代基(即，合适的“R”基团)以形成具有有利的反应动力学、合适的水溶性以及不受干扰效应影响的其它基于萘醌的调节剂。在此方面，合适的R基团可为例如充分亲水的，以赋予调节剂以合适的水溶性。

化合物A的分子式为C₁₃H₁₂S₂O₅，分子量为312.36，并具有以下结构：

化合物A为橙色的无定形固体，可在室温下溶于碱性和中性磷酸盐缓冲液。化合物A具有以下有利的电化学特性：

相对于Ag/AgCl(0.1M KCl)的E₀＝0.086V

k_cat＝900s^-1

其中E₀为相对于Ag/AgCl的形式氧化还原电势(相比于铁氰化物的0.25V)，并且k_cat为调节剂(即，化合物A)和酶辅助因子FAD之间均匀电子传递的速率常数。应当注意，铁氰化物的E₀为0.25V，并且铁氰化物的k_cat为230s^-1。化合物A的E₀有利地低于铁氰化物的E₀(并因此不易受干扰物的影响)并且其k_cat有利地高于铁氰化物的k_cat。此外，化合物A在40摄氏度下存放26天后表现出对葡萄糖的敏感度没有下降。

化合物A以如下步骤合成。将1,2-萘醌-4-磺酸钠盐(10mmol)加入蒸馏水(100ml)中并搅拌，直到形成澄清的溶液。立即加入3-巯基-1-丙磺酸单钠盐(10mmol)，生成深棕色溶液。静置溶液，12小时之后，将澄清的棕色溶液蒸发至干燥以得到深黄色固体。用氯仿洗涤深黄色固体并在真空下干燥以得到作为橙色固体的1,2-萘二酮-4-(3-巯基-1-丙磺酸)(1.48g，47％)。质谱分析确认了该成分。然而，一旦获悉本公开，本领域的技术人员便可开发用于合成化合物A的其它方法。

化合物B的分子式为C₁₃H₁₀S₂O₄，分子量为262.28，并具有以下结构：

化合物B为橙色无定形固体，可在室温下溶于碱性和中性磷酸盐缓冲液。化合物A具有以下有利的电化学特性：

相对于Ag/AgCl(0.1M KCl)的E₀＝0.016V

k_cat＝100s^-1

其中E₀为相对于Ag/AgCl的形式氧化还原电势(相比于铁氰化物的0.25V)，并且k_cat为调节剂(即，化合物A)和酶辅助因子FAD之间均匀电子传递的速率常数。应当注意，铁氰化物的E₀为0.25V，并且铁氰化物的k_cat为230s^-1。化合物B的E₀有利地低于铁氰化物的E₀(并因此不易受干扰物的影响)，并且k_cat低于铁氰化物的k_cat，但仍为合适的。此外，化合物B在40摄氏度下存放26天后表现出对葡萄糖的敏感度没有降低。

化合物B以如下步骤合成。将1,2-萘醌(10mmol)加入甲醇(50ml)中，并于冰中搅拌5分钟。加入3-巯基丙酸(10mmol)，并且5分钟内溶液变得澄清，并将其蒸发至干燥。使用乙酸乙酯作为洗脱液于硅胶中纯化深棕色固体，得到1,2-萘二酮-4-(3-巯基丙酸)(1.19g，51％)。质谱分析确认了该组成。然而，一旦获悉本公开，本领域的技术人员便可开发用于合成化合物B的其它方法。

根据本发明的包括化合物B的酶试剂的示例性但为非限制性的示例包括以下组分：

10ml的缓冲至pH为7的0.1M磷酸盐水溶液，已向其加入下列组分：

1％(w/v)Pluronic 103，一种以伯羟基基团封端的双官能嵌段共聚物表面活性剂

2.5％(w/v)羟乙基纤维素，一种增稠剂；

最终浓度为40mM的化合物B

0.05g FAD-GDH

该酶试剂在本文中也称为“化合物B酶试剂”。

包括化合物A的根据本发明的酶试剂的另一个示例性但为非限制性的示例如下：

100mL的缓冲至pH为7的0.01M磷酸盐水溶液，已向其加入以下组分：

1％(w/v)二氧化硅

1％(w/v)Pluronic 103

5滴Dow Corning Antifoam 1500(可从VWR International,United Kingdom商购获得)

5％羟乙基纤维素。

进行轨道式混合之后，加入以下组分：

最终浓度为175mM的化合物A

0.33g FAD-GDH，由Amano Enzyme China Ltd供应

该酶试剂在本文中也称为“化合物A酶试剂”。

具体地参考图3和图4，采用化合物B酶试剂的分析测试条通过在制备期间使用喷墨技术施加酶试剂进行制备。此类喷墨技术通常产生厚度在大约0.1微米至5微米范围内的最终干酶层。测试所得分析测试条的结果示出于图3和图4中，所述图示出有利的线性关系，并且不含来自根据本发明实施方案的分析测试条的尿酸的干扰。

图3的数据是使用加入某些物质的静脉全血采集到的，所述静脉全血来自3个具有正常血细胞比容(即，在的38％至42％范围内)的代表性供体。图4的数据比较了该测试条和可商购获得的基于电化学的分析测试条的性能，并使用YSI血浆葡萄糖浓度为65mg/dL的单个供体血液进行。向血液中加入尿酸，至22mg/dL的最终浓度。与YSI血浆葡萄糖水平的偏差值是按照相关测试仪葡萄糖信号的增加计算并绘制的，所述信号的增加是相对于未添加尿酸的对照组而言的。图4示出采用化合物B酶试剂的分析测试条没有干扰效应。此处未详述的进一步研究显示出相似不含对乙酰氨基酚、谷胱甘肽和抗坏血酸的干扰。

具体地参考图5，采用化合物A酶试剂的分析测试条通过在制备期间使用丝网印刷技术涂覆酶试剂进行制备。此类丝网印刷技术通常产生厚度在大约5微米至15微米范围内的最终干酶层。测试所得分析测试条的结果在图5中示出，该图示出根据本发明另一个实施方案的分析测试条的有利线性关系。图5的数据是使用加入某些物质的静脉全血采集到的，所述静脉全血来自3个具有正常血细胞比容(即，在38％至42％范围内)的代表性供体。

一旦获悉本公开，本领域的技术人员便将认识到，可配制包含化合物A和/或化合物B和FAD-GDH的多种合适酶试剂。此类合适的酶试剂可包含例如柠檬酸三钠、柠檬酸、聚乙烯醇、羟乙基纤维素、消泡剂、热解法二氧化硅(具有或不具有疏水表面改性)、PVPVA和水。一般来讲，关于试剂层和基于电化学的分析测试条的更多细节在美国专利6,241,862和6,733,655中，这些专利的内容全部以引用方式并入本文中。

参考图1和图2，图案化绝缘层106可由包括商购获得的可丝网印刷的介电油墨的任何合适的电绝缘电介质材料形成。

图案化隔层110可由例如从Apollo Adhesives,Tamworth,Staffordshire,UK商购获得的可丝网印刷的压敏粘合剂形成。在图1和图2的实施方案中，图案化隔层110限定样本接收室118的外壁。图案化隔层110的厚度可为例如大约110微米，可为非导电的，并且可由具有顶侧丙烯酸类压敏粘合剂和底侧丙烯酸类压敏粘合剂的聚酯材料形成。

例如，顶层112可为具有亲水特性的透光膜，该亲水特性促进基于电化学的分析测试条100被流体样本(例如，全血样本)润湿和填充。此类透光膜可从例如Minneapolis,Minnesota U.S.A.的3M和Coveme(San Lazzaro di Savena,Italy)商购获得。顶层112可为例如涂覆有表面活性剂的聚酯膜，该表面活性剂提供小于10度的亲水性接触角。顶层112也可为涂覆有表面活性剂或其它表面处理的聚丙烯膜。在此类情况下，表面活性剂涂层用作图案化亲水性亚层114。顶层112可具有例如约100μm的厚度。

可制造基于电化学的分析测试条100，例如通过以图案化导电层104、图案化绝缘层106、酶试剂层108、图案化隔层110和顶层112的顺序排列形成。可使用本领域的技术人员已知的任何合适的技术来实现此类顺序排列形成，所述技术包括例如丝网印刷、喷墨印刷、照相平版印刷、照相凹版印刷、化学气相沉积和条带层合技术。然而，根据本发明实施方案的酶试剂尤其有用，因为可将它们配制成适用于成本相对较低并且原本也是常见的喷墨印刷技术和丝网印刷技术的含水组合物。例如，可采用此类酶试剂，以在高达至少700mg/dL的葡萄糖浓度的全血样本中，产生具有电化学生成的电流和葡萄糖浓度之间的线性响应的酶试剂层。

虽然本文已示出和描述了本发明的优选实施方案，但对本领域的技术人员显而易见的是，此类实施方案仅作为举例提供。在不脱离本发明的情况下，本领域的技术人员可以设想出各种变型、更改和替代形式。应当理解，本文所述的本发明实施方案的多种另选形式可用于实施本发明。以下权利要求书旨在限定本发明的范围，并覆盖落入这些权利要求的范围内的装置和物质的组成及其等同物。