一种抗氧化药物筛选试剂盒及其使用方法与流程

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗氧化药物高通量筛选试剂盒及其使用方法。

背景技术：

近年来随着社会的快速发展，快节奏的生活环境使人们极易受到各种压力所致的氧化应激反应损伤，而过度的氧化应激损伤是导致如早衰、糖尿病以及心血管系统疾病等严重病症不可忽视的因素。因此研究毒性低、抗氧化效果显著的药物迫在眉睫。

现阶段抗氧化药物筛选所常用体内动物模型主要为细胞、小鼠、大鼠。小鼠和大鼠是抗氧化药物药效检测的理想模型，但其存在试验周期长、成本高、操作繁琐以及不能高通量等问题而大大限制了其在大量抗氧化药物初筛方面的应用。细胞作为体外抗氧化模型，虽然易于在实验室进行大规模测定，节省测定时间和成本，但与体内筛选相比，其所得结果往往相关性较差。

秀丽隐杆线虫培养条件简单，可以在琼脂板上或是液体培养基中取食细菌（e.coli）；世代周期短，通常为3天左右；寿命短，通常为3周左右；而秀丽隐杆线虫实验群体容易放大，且可以同步化，因此秀丽隐杆线虫因为寿命周期短和容易实现高通量的优势，成为体内抗氧化药物高通量筛选的理想模型。

但上述秀丽隐杆线虫体内抗氧化药物高通量筛选模型的建立需要极高的技术和经验，即使在发达国家，线虫高通量药物筛选技术目前仍停留在实验室阶段，还未进入产业化阶段，而且目前很多线虫的筛选模型还没有知识产权保护。

对此，本发明特提供一种抗氧化药物筛选试剂盒，使用该试剂盒能够高通量筛选抗氧化药物，本发明同时提供上述试剂盒的使用方法。供本领域研发人员高通量准确地筛选抗氧化药物。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种抗氧化药物筛选试剂盒，使用该试剂盒能够筛选出抗氧化药物。

本发明的另一个目的是提供上述抗氧化药物筛选试剂盒的使用方法。

本发明提供一种抗氧化药物筛选试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括以下试剂：

①、试剂a：秀丽隐杆线虫悬液；

②、试剂b：线虫培养基；

③、试剂c：大肠杆菌op50；

④、试剂d：2′,7′二氯氢化荧光素乙二脂；

所述试剂盒还含有多孔板，该多孔板为黑色，带有封口膜。封口膜可减缓培养基中的水分散失。所述多孔板为384孔微孔板。

所述试剂a的浓度为50条秀丽隐杆线虫/20μl，试剂c的浓度为10mg大肠杆菌/ml，试剂b的体积为25ml。

所述秀丽隐杆线虫的株系为野生型n2。

所述试剂a中的秀丽隐杆线虫为经同步化后，孵化至l1期的秀丽隐杆线虫，秀丽隐杆线虫同步化的步骤如下：用m9缓冲液将平板上的秀丽隐杆线虫冲下来，将冲洗液吸入离心管；4000rpm离心3min，去除上清；加入裂解液；在涡旋仪上震荡7min，使秀丽隐杆线虫的虫体破裂释放卵；4000rpm离心3min，去除上清，收集沉淀获得大量的秀丽隐杆线虫卵；m9缓冲液冲洗两次，再加入1mlm9缓冲液，置于20℃培养箱中孵化48小时，获得同步化后孵化至l1期的秀丽隐杆线虫。

所述试剂c为含有大肠杆菌op50活菌的冻干粉或菌液。冻干粉在使用时需使用培养液将其配置为浓度为10mg/ml的菌液，培养液可使用s液或m9缓冲液。

所述试剂b为s液培养基。

本发明还提供上述抗氧化药物筛选试剂盒的使用方法：

（1）采用抗氧化药物筛选试剂盒筛选抗氧化药，设定空白对照组和药液测定组，将多孔板中的每一孔设置为一个独立的实验单元；

（2）药液测定组，在无菌条件下将试剂b、含有待测药液的溶液、5μl试剂c以及20μl试剂a依次加入多孔板的孔中，使得每孔总体积均为50μl，设定四个平行；

（3）空白对照组，在无菌条件下将试剂b、与待测药液的溶液等量的无菌水或溶媒、5μl试剂c以及20μl试剂a依次加入多孔板的孔中，使得每孔总体积均为50μl，设定四个平行；其中，所述有机溶媒的溶液为dmso、乙醇。

（4）加样完成后用封口膜将多孔板密封，并将其置20℃恒温摇床中震摇培养96小时；

（5）向所有加样孔中依次加2′,7′二氯氢化荧光素乙二脂，使2′,7′二氯氢化荧光素乙二脂的终浓度为100μm，20℃恒温处理30min；

（6）用荧光酶标仪在激发光504nm，发射光529nm条件下测定多孔板中各处理组的荧光，荧光值即代表活性氧水平；

（7）采用统计软件对实验数据进行处理、分析，如果药液测定组的活性氧水平低于空白对照组，则证明待测药物具有抗氧化活性；如果药液测定组的活性氧水平与空白对照组无显著性差异，则证明待测药物不具有抗氧化活性；以此评价待测药物的抗氧化活性。

本发明的有益效果：

1、本发明提供一种基于秀丽隐杆线虫模型的抗氧化药物筛选试剂盒，该试剂盒筛选效果好，使用方法简单，可广泛用于筛选抗氧化药物及保健食品。

2、此外，本试剂盒还使用了2′,7′二氯氢化荧光素乙二脂，可方便快速高通量地评估待测药物的活性氧水平，操作简单快捷，结果直观可靠。

3、本发明为体内实验。

以下提供具体实施例以实现本发明所述的抗氧化药物筛选试剂盒，但不限于这些实施例。

附图说明

图1使用抗氧化药物筛选试剂盒评估维生素c的抗氧化功效

vc1-40×10^-4mm、vc2-40×10^-3mm、vc3-40×10^-2mm、vc4-40×10^-1mm、vc5-40mm；

图2使用抗氧化药物筛选试剂盒评估百草枯的促氧化功效

p1-0.0625mm、p2-0.125mm、p3-0.25mm、p4-0.5mm、p5-1mm。

具体实施方式

实验生物：

秀丽隐杆线虫野生型n2，购买于thecaenorhabditisgeneticscenter(cgc)。

细菌株：尿嘧啶渗漏突变型大肠杆菌op50，购买于thecaenorhabditisgeneticscenter(cgc)。

试剂：

s液培养基：1升s基础液，10ml1m柠檬酸钾，10mltrace，3ml1mcacl2，3ml1mmgso4，1ml胆固醇（5mg/ml）。

s基础液：5.85gnacl，1gk2hpo4，6gkh2po4，加水至1升，121℃灭菌20min备用。

1m柠檬酸钾：20g柠檬酸，293.5g柠檬酸三钾，加水至1升，121℃灭菌20min。

trace缓冲液：1.86gedta，0.69gfeso4.7h2o，0.2gmncl2.4h2o，0.025gcuso4.5h2o，0.29znso4.7h2o，加水至1升，121℃灭菌20min。

1mcacl2：55.5gcacl2溶于1升水中，121℃灭菌20min。

1mmgso4：246.47gmgso4.7h2o溶于1升水中，121℃灭菌20min。

ngm培养基：nacl1.5g，k2hpo41.3g，kh2po48.5g，蛋白胨1.4g，琼脂粉8.5g，蒸馏水500ml。灭菌后加入过滤除菌的500µl胆固醇（5mg/ml，无水乙醇配制），高压蒸汽灭菌的500µl1mol/lmgso4，500µl1mol/lcacl2。

m9缓冲液：nacl1.98g，na2hpo42.38g，kh2po41.20g，mgso40.048g，蒸馏水400ml。

lb液体培养基：nacl2g，蛋白胨2g，酵母膏1g，蒸馏水200ml。溶解后用1mnaoh调节ph为7.0，高压蒸汽灭菌。

裂解液：6.4%naclo3溶液和1mnaoh溶液按体积比1:1混合。

3.药材：

维生素c：购自北京百灵威科技有限公司

百草枯：购自北京盛世康普化工技术研究院

4.仪器：

高压灭菌锅（上海申安医疗器械厂）

单人单面超净台（苏州净化设备厂）

生化培养箱（宁波江南仪器厂）

隔水式恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）

连续变倍体视显微镜（上海一恒科学仪器有限公司）

离心机（ct15e，日立）

电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）

实施例1试剂盒的装配

本发明所述的一种抗氧化药物筛选试剂盒，该试剂盒包括以下试剂：

①、试剂a：秀丽隐杆线虫悬液；

②、试剂b：线虫培养基；

③、试剂c：大肠杆菌op50；

④、试剂d：2′,7′二氯氢化荧光素乙二脂；

所述试剂盒还含有多孔板，该多孔板为黑色，带有封口膜。

所述多孔板为384孔微孔板。

其中，所述试剂a的浓度为50条秀丽隐杆线虫/20μl，试剂c的浓度为10mg大肠杆菌/ml，试剂b的体积为25ml。

其中，所述试剂c为含有大肠杆菌op50活菌的冻干粉或菌液。

所述试剂b为s液培养基。

将以上试剂和多孔板分装于合适的容器中，放置到外包试剂盒中。

本实验中，选取秀丽隐杆线虫野生型n2，用于筛选对正常株系作用的抗氧化药物。

本领域技术人员可根据具体研究内容，选用类似株系，而不局限于本发明实施例中所述的秀丽隐杆线虫株系。

实施例2秀丽隐杆线虫的同步化

本发明所述试剂a中的秀丽隐杆线虫为经同步化后，孵化至l1期的线虫，秀丽隐杆线虫同步化的步骤如下：用m9缓冲液将平板上的秀丽隐杆线虫冲下来，将冲洗液吸入离心管；4000rpm离心3min，去除上清；加入裂解液；在涡旋仪上震荡7min，使秀丽隐杆线虫的虫体破裂释放卵；4000rpm离心3min，去除上清，收集沉淀获得大量的秀丽隐杆线虫卵；m9缓冲液冲洗两次，再加入1mlm9缓冲液，置于20℃培养箱中孵化48小时，获得同步化后孵化至l1期的秀丽隐杆线虫。

实施例3试剂盒的使用

（1）采用抗氧化药物筛选试剂盒筛选抗氧化药，设定空白对照组和药液测定组，将多孔板中的每一孔设置为一个独立的实验单元；

（2）药液测定组，在无菌条件下将试剂b、含有待测药液的溶液、5μl试剂c以及20μl试剂a依次加入多孔板的孔中，使得每孔总体积均为50μl，设定四个平行；

（3）空白对照组，在无菌条件下将试剂b、与待测药液的溶液等量的无菌水或溶媒、5μl试剂c以及20μl试剂a依次加入多孔板的孔中，使得每孔总体积均为50μl，设定四个平行；其中，所述有机溶媒的溶液为dmso、乙醇；

（4）加样完成后用封口膜将多孔板密封，并将其置20℃恒温摇床中震摇培养96小时；

（5）向所有加样孔中依次加2′,7′二氯氢化荧光素乙二脂，使2′,7′二氯氢化荧光素乙二脂的终浓度为100μm，20℃恒温处理30min；

（6）用荧光酶标仪在激发光504nm，发射光529nm条件下测定多孔板中各处理组的荧光，荧光值即代表活性氧水平；

（7）采用统计软件对实验数据进行处理、分析，如果药液测定组的活性氧水平低于空白对照组，则证明待测药物具有抗氧化活性；如果药液测定组的活性氧水平与空白对照组无显著性差异，则证明待测药物不具有抗氧化活性；以此评价待测药物的抗氧化活性。

实施例4试剂盒效果验证实验

维生素c（vc）为抗氧化剂，本实施例将其用作阳性药物验证抗氧化药物筛选试剂盒的可靠性。百草枯为促氧化剂，本实施例将其用作阴性药物验证抗氧化药物筛选试剂盒的可靠性。

实验步骤：

1.vc样品溶液的制备：将vc用蒸馏水溶解，滤去杂质，将滤液用s液分别稀释至40×10^-4mm（vc1）、40×10^-3mm（vc2）、40×10^-2mm（vc3）、40×10^-1mm（vc4）、40mm(vc5)。

vc在秀丽隐杆线虫野生型n2体系下的抗氧化分析实验：具体实验步骤参照实施例3，抗氧化分析实验结果见图1。

2.百草枯样品溶液的制备：将百草枯用蒸馏水溶解，滤去杂质，将滤液用s液分别稀释至0.0625mm（p1）、0.125mm（p2）、0.25mm（p3）、0.5mm（p4）、1mm(p5)。

百草枯在野生型n2线虫体系下的抗氧化分析实验：具体实验步骤参照实施例3，抗氧化分析实验结果见图2。

结果分析：该抗氧化试剂盒中n2线虫从l1期即开始加药处理至l4期甚至成虫，可稳定检测阳性药物vc的抗氧化活性，即随vc样品浓度升高，活性氧水平逐渐降低；同时亦可稳定检测阴性药物百草枯的促氧化活性，即随百草枯样品浓度升高，活性氧水平逐渐升高。上述两者的检测结果均具有稳定的浓度效应关系。

由此证明本发明的试剂盒可以被用于筛选抗氧化药物，且结果准确，使用方法简便，易于掌握，适合在筛选抗氧化药物领域大规模推广。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。