测量液体样品中细菌含量的方法与流程

本发明涉及一种测量液体样品中细菌含量的方法。

背景技术：

由细菌等微生物的生命活动引起的材料的腐蚀破坏被称为微生物腐蚀(mic)。mic是一种普遍存在的现象。油气田、油罐、加油站、油路甚至汽车油箱中都存在着大量的细菌。每年因腐蚀而造成的经济损失在一百亿美元以上。其中最主要的腐蚀微生物为硫酸盐还原菌(srb)，造成了美国生产油井77％以上的腐蚀损失。srb能够在无氧环境下，以环境中的有机物为碳源，利用细菌生物膜内产生的氢，将硫酸盐还原为硫化氢，从氧化还原反应中获得能量，而金属也在此过程中被氧化腐蚀。目前srb的检测方法主要有三种，分别为：培养检测技术、显微镜检测技术和生化直接检测技术。培养检测技术是目前应用较为广泛的一种方法，其原理是将样品做梯度稀释，在适当的培养基上进行培养，最终根据稀释倍数和细菌的阳性反应进行定量。该法的主要依据是美国石油协会api推荐的绝迹稀释法，我国石油行业标准sy/t0532-2012《油田注入水细菌分析方法绝迹稀释法》中也有详细规定。相关专利已有报道(如cn102329851a、cn103983636a、cn1769472a、cn200510010459等)，目前市场上也存在srb专用测试瓶可供购买。培养检测技术的优点在于操作简单、成本低廉，结果准确性较高。其主要缺点在于耗时长(2-14天)，培养菌种不完全导致定量结果偏低。一旦阴性对照组出现菌类生长，需要重做实验，很难保证重新采样结果与原样本一致。

显微镜检测技术结合了特异性染色方法与荧光计数方法，将荧光基团选择性地标记到srb的表面，然后在荧光显微镜下计数以定量。但此种方法仍然需要短期培养以提高菌类浓度，培养周期在两天左右。虽然其操作相对简单、定量成本低，但需要染料分子的高特异性，且不能提供细菌活性的相关信息。

生化直接检测技术包含了多种具体方式【关淑霞叶海春范莹莹油田污水中硫酸盐还原菌检测技术的研究进展化学与生物工程20122917】，可以检测srb内部或表面的某种蛋白(如用酶联免疫吸附剂测定elisa方法测定腺苷-5’-磷酸硫酸盐还原酶aps【如 gb2354072b、cn103983636a、ep272916a1】)，可以检测srb特异性的核酸分子序列(如聚合酶链式反应pcr方法【cn105112543a、cn1769472a、cn200510010459】、荧光原位杂交fish方法【王明义梁小兵郑娅萍赵由之魏中青硫酸盐还原菌鉴定和检测方法的研究进展微生物学杂志20052581】)，也可以检测srb的代谢产物(如电位法或指示剂法测定h2s)【李婉义赵自光硫酸盐还原菌菌量检测方法的研究—硫离子选择电极法化学传感器19911164】。这些检测方法准确性高、特异性高、检测周期短(几小时左右)，但操作复杂，一般只能在专门的生化实验室内由受过训练的专业人员进行实验。市场上虽然已经出现了利用elisa方法快速测量细菌浓度的试剂盒，但该方法仍需要高速离心等操作，不适用于现场检测。

综上所述，目前缺乏一种快速、便捷、准确的srb的现场测定方法和装备。本专利描述的是一种基于elisa方法的样品中细菌的特异性、简单化、可携带式定量检测装置和方法，无需外接电源。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是现有技术中测量速度较慢、不便捷、结果不准确的问题，提供一种新的测量液体样品中细菌含量的方法。该方法具有快速、便捷、准确的优点。

为解决上述问题，本发明采用的技术方案如下：一种测量液体样品中细菌含量的方法，在液体样品中细菌含量测量装置上，进行液体样品中细菌含量的测量；所述装置包括箱体、试剂管放置位置、试剂管、观察孔以及细菌富集和蛋白质分子捕捉设备，所述细菌富集和蛋白质分子捕捉设备包括试剂管放置位置、滤膜、吸附层、至少两个废液池、至少两个阀门，所述试剂管放置位置位于箱体顶部，底部与滤膜上方空间连通，滤膜下方空间分为两路，一路与阀门5a入口端相连，另一路与阀门5b入口端相连，阀门5a出口端与吸附层入口侧通过管道相连，吸附层出口侧的管道伸入废液池4a中，阀门5b出口端的管道伸入废液池4b中，滤膜上方空间的顶部设有金属尖刺，当试剂管放置在试剂管放置位置上时可以刺破试剂管底部的铝箔；设置至少a-h八个试剂管，其中：试剂管a为空管，用以待装样品，试剂管b和试剂管c内盛装滤膜冲洗液，试剂管d内盛装细菌裂解液，试剂管e和试剂管f内盛装吸附层冲洗液，试剂管g内盛装带有染料分子的特异性抗体溶液，试剂管h内盛装吸附层冲洗液；所述观察孔位于吸附层正上方，开孔在箱体顶部；液体样品中细菌含量的测量步骤包括：

(1)在试剂管a中装入样品，放置于试剂管放置位置，试剂管底部铝箔包装被下部金属尖刺破，液体流入滤膜上方，小于滤膜孔径的液体穿过滤膜后进入废液池4b；

(2)当试剂管a中的样品全部流过滤膜后，先后在试剂管放置位置上更换为试剂管b、试剂管c，重复(1)的操作，对滤膜进行冲洗；

(3)对滤膜的冲洗完成后，在试剂管放置位置上更换为试剂管d，重复(1)的操作，将试剂管d中的细菌裂解液流经吸附层后进入废液池4a；

(4)在试剂管放置位置上更换为试剂管e、试剂管f进行冲洗，移除细菌裂解液中的杂质；

(5)冲洗结束后，在试剂管放置位置上更换为试剂管g，重复(3)的操作；

(6)在试剂管放置位置上更换为试剂管h，通过试剂管h中的溶液进行冲洗掉多余的抗体；

(7)通过观察孔观察吸附层的颜色，与比色卡比较，读出对应浓度。

上述技术方案中，优选地，当试剂管放置在试剂管放置位置上时，在试剂管上部放置活塞，将试剂管中的试剂向下压入滤膜上方的空间中。

上述技术方案中，优选地，所述试剂管顶部由滤膜封装，使用前撕掉铝箔。

上述技术方案中，优选地，所述通过选择不同的试剂管，实现所述设备的样品富集、捕捉、冲洗操作。

上述技术方案中，优选地，细菌富集和蛋白质分子捕捉设备集成在所述箱体内。

上述技术方案中，优选地，当样品为水相物质时，采用亲水性滤膜，滤膜尺寸在0.5微米以下，以确保目标微生物能够保留在滤膜上；当样品为油相物质时，采用亲油性滤膜。

上述技术方案中，优选地，吸附层的材质为特异性吸附蛋白质的材料、不同截留分子量的超滤膜或表面功能化了aps抗体的吸附材料。

上述技术方案中，优选地，染料分子通过抗体与aps特异性结合，染料分子的数量与aps成正比；染料分子为金纳米颗粒、其它颗粒、或其它带有颜色的分子。

本发明中，细菌富集是通过样品流经滤膜实现的。撕开试剂管上方铝箔，取空的试剂管a，放入1ml待测样品，将a放入试剂管放置位置1后，样品管底部铝箔包装被下部金属尖刺破，液体流入滤膜2上方，此时在上方施加压力，推动液体经过滤膜，大于滤膜孔径的固体物质被留在滤膜上，液体流出。此时阀门5b开启，阀门5a关闭，废液流出至右侧废液池4b。当样品为油田废水等水相物质时，采用亲水性滤膜，滤膜尺寸应在0.5微米以下以确保目标微生物能够保留在滤膜上。当样品为成品油等油相物质时，采用亲油性滤 膜。当样品全部流经滤膜后，拔除样品管，取出上部活塞，将预置于前排的试剂管b放入位置1，样品管底部铝箔包装被下部金属尖刺破，放入活塞，重复上述加压流程以冲洗滤膜。继续更替为试剂管c进行冲洗。当冲洗结束后，加入试剂管d，内含细菌裂解液，等待一定时间后开始加压，此时阀门5b关闭，阀门5a开启，细菌裂解液流经吸附层3后进入左侧废液池4a。吸附层3的材质可以选择为特异性吸附蛋白质的材料、不同截留分子量的超滤膜、表面功能化了aps抗体的吸附材料等。继续更换试剂管e、试剂管f进行冲洗，此步骤目的为移除细菌裂解液中除(目标)蛋白质外的杂质。g为带有染料分子的特异性抗体溶液，染料分子通过抗体与aps特异性结合，染料分子的数量与aps成正比。染料分子可以为金纳米颗粒、其它颗粒、其它带有颜色的分子等。最后由试剂管h中的溶液冲洗走多余未与aps结合的抗体。吸附层3的位置与上方观察孔i对应，在吸附层3位置边预置不同浓度对应的比色卡作为定量参照。

本装置包含了细菌富集、蛋白质分子捕捉和读出三个单元，是一种整合型可携带式设备，能够实现现场测量。细菌富集单元采用样品流经过滤膜的方式实现细菌的分离和富集，所需时间与培养法相比大大缩短。蛋白质分子的捕捉是通过裂解液打破细胞壁释放出aps后，将aps富集在吸附层上，然后通过抗体-抗原特异性作用进一步富集染料颗粒，染料的浓度与aps的浓度成正比，最终由吸附层的颜色指示srb的浓度，取得了较好的技术效果。

附图说明

图1为本发明所述装置的外观示意图；

图2为本发明所述装置内部各模块结构示意图；

图1、图2中，1为试剂管放置位置；2为滤膜；3为吸附层；4a、4b为废液池；5a、5b为阀门；a为试剂管，空管，待装样品；b、c为试剂管，盛装滤膜冲洗液；d为试剂管，盛装细菌裂解液；e、f为试剂管，盛装吸附层冲洗液；g为试剂管，盛装带有染料分子的特异性抗体溶液；h为试剂管，盛装吸附层冲洗液；i为观察孔。

下面通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不仅限于本实施例。

具体实施方式

【实施例1】

一种测量液体样品中细菌含量的方法，如图1、图2所示。在液体样品中细菌含量测量装置上，进行液体样品中细菌含量的测量；所述装置包括箱体、试剂管放置位置、试剂管、观察孔以及细菌富集和蛋白质分子捕捉设备，所述细菌富集和蛋白质分子捕捉设备包括试剂管放置位置、滤膜、吸附层、至少两个废液池、至少两个阀门，所述试剂管放置位置位于箱体顶部，底部与滤膜上方空间连通，滤膜下方空间分为两路，一路与阀门5a入口端相连，另一路与阀门5b入口端相连，阀门5a出口端与吸附层入口侧通过管道相连，吸附层出口侧的管道伸入废液池4a中，阀门5b出口端的管道伸入废液池4b中，滤膜上方空间的顶部设有金属尖刺，当试剂管放置在试剂管放置位置上时可以刺破试剂管底部的铝箔；设置a-h八个试剂管，其中：试剂管a为空管，用以待装样品，试剂管b和试剂管c内盛装滤膜冲洗液，试剂管d内盛装细菌裂解液，试剂管e和试剂管f内盛装吸附层冲洗液，试剂管g内盛装带有染料分子的特异性抗体溶液，试剂管h内盛装吸附层冲洗液；所述观察孔位于吸附层正上方，开孔在箱体顶部；所述观察孔位于吸附层正上方，开孔在箱体顶部。

本发明所述的装置集成在0.3m*0.2m*0.2m的硬质包装盒中，用户只需要根据说明书进行注射操作即可。

前排试剂管(a-h)为预置的裂解、洗涤、标记溶液，未使用时以铝箔封装好，使用时撕掉铝箔，按照说明书逐个置于试剂管放置位置1，以使不同溶液以一定的顺序流经滤膜和吸附层。i位置为观察孔，用于观察吸附层的颜色，并与预置的参照比色卡相比较，以读出样品中srb的浓度。

本发明中，细菌富集是通过样品流经滤膜实现的。撕开试剂管上方铝箔，取空的试剂管a，放入1ml待测样品，将a放入指定位置试剂管放置位置1后，样品管底部铝箔包装被下部金属尖刺破，液体流入滤膜2上方，此时在上方施加压力，推动液体经过滤膜，大于滤膜孔径的固体物质被留在滤膜上，液体流出。此时阀门5b开启，阀门5a关闭，废液流出至右侧废液池4b。当样品为油田废水等水相物质时，采用亲水性滤膜，滤膜尺寸应在0.5微米以下以确保目标微生物能够保留在滤膜上。当样品为成品油等油相物质时，采用亲油性滤膜。当样品全部流经滤膜后，拔除样品管，取出上部活塞，将预置于前排的试剂管b放入位置1，样品管底部铝箔包装被下部金属尖刺破，放入活塞，重复上述加压流程以冲洗滤膜。继续更替为试剂管c进行冲洗。当冲洗结束后，加入试剂管d，内含细菌裂解液，等待一定时间后开始加压，此时阀门5b关闭，阀门5a开启，细菌裂解液流经吸附层3后进入左侧废液池4a。吸附层3的材质可以选择为特异性吸附蛋白质的材料、 不同截留分子量的超滤膜、表面功能化了aps抗体的吸附材料等。继续更换试剂管e、试剂管f进行冲洗，此步骤目的为移除细菌裂解液中除(目标)蛋白质外的杂质。g为带有染料分子的特异性抗体溶液，染料分子通过抗体与aps特异性结合，染料分子的数量与aps成正比。染料分子可以为金纳米颗粒、其它颗粒、其它带有颜色的分子等。最后由试剂管h中的溶液冲洗走多余未与aps结合的抗体。吸附层3的位置与上方观察孔i对应，在吸附层3位置边预置不同浓度对应的比色卡作为定量参照。

为了使本发明的优点、技术方案更加清楚、明确，下面结合具体实施例对本发明的步骤做详细说明。

废水中srb的定量检测

1)开启阀门5b，关闭阀门5a；

2)取试剂管，撕开上方铝箔封装，取下空试剂管a，装入1ml样品，将其放入试剂管放置位置1，放入活塞，向下推动活塞使液体流经滤膜；

3)待全部液体流经滤膜后，移除试剂管a，取下活塞，将试剂管b放入试剂管放置位置1，推动活塞使试剂管b中液体全部流经滤膜；

4)对试剂管c重复2)中操作；

5)开启阀门5a，关闭阀门5b；

6)取试剂管d，将其放入试剂管放置位置1后略摇晃，使底部铝箔与针接触的位置有空隙，使液体流下至滤膜上方，静置10分钟；推动活塞，控制流速使液体缓慢流经滤膜和吸附层；

7)待全部液体流经滤膜后，移除试剂管d，取下活塞，将试剂管e放入试剂管放置位置1，推动活塞使试剂管e中液体全部流经滤膜；

8)对试剂管f重复7)中操作；

9)取试剂管g，将其放入试剂管放置位置1后推动活塞，控制流速使液体停留在吸附层3前，静置10分钟；推动活塞，控制流速使液体缓慢流经吸附层；

10)待全部液体流经滤膜后，移除试剂管g，取下活塞，将试剂管h放入试剂管放置位置1，推动活塞使试剂管h中液体全部流经滤膜；

11)观察吸附层3的颜色，与比色卡比较，读出对应浓度。

在本实施例中，放入样品为1ml含有10⁷cfu/mlsrb的水溶液，操作总时长为1小时30分钟左右，经与比色卡比较，最终测得浓度为5×10⁶cfu/ml-10⁷cfu/ml之间，与样品值相同。

需要说明的是，在本说明书的教导下本领域技术人员还可以作出这样或那样的容易变化方式，诸如等同方式，或明显变形方式，均应在本发明的保护范围之内。