用于微囊化大肠杆菌口服疫苗免疫抗体检测的检测方法及检测试剂盒与流程

文档序号:14686265发布日期:2018-06-15 00:14阅读:来源:国知局
技术特征:

1.用于微囊化大肠杆菌口服疫苗免疫抗体检测的检测方法,其特征在于:该检测方法包括下述步骤:

(1)抗原包被:用pH为9.6的碳酸盐缓冲液0.05mol/L将抗原按一定比例稀释,每孔加入100μl,4℃包被24h;

(2)洗涤:取出后室温平衡30分钟,弃去液体,用1倍含0.05%吐温–20的pH为7.4的磷酸盐缓冲液PBST洗涤3次,每次1min,在吸水纸上吸干;

(3)封闭:加1%BSA封闭液每孔100μl,37℃孵育1h;

(4)洗涤:弃液体,洗涤3次,吸水纸吸干;

(5)加一抗:加用0.1%BSA稀释液稀释的标准阳性血清每孔100μl,37℃孵育1小时,所述一抗为待测血清中的抗体;

(6)洗涤:洗涤3次,吸水纸吸干;

(7)加二抗:加用0.1%BSA稀释至工作浓度为1∶5000的辣根过氧化物酶标HRP羊抗大鼠IgG每孔100μl,37℃温育1h;所述二抗为辣根过氧化物酶标HRP羊抗大鼠IgG;

(8)洗涤:洗涤3次,于吸水纸上吸干;

(9)显色:加邻苯二胺OPD底物溶液,每孔100μl,微量振荡器振荡2min,37℃温育30min;

(10)终止:加终止液50μl,微量振荡器振荡2min,静置作用15min;

(11)酶标仪测OD值:酶标仪492nm和630nm双波长测OD值,并与制备好的标准曲线及回归方程进行比对判断。

2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:所述抗原为选取C83-1、C83-2、C83-3,血清型(O78:K80)菌株的二级种子菌液接种营养琼脂平板,37℃培养20-24h;然后用含0.5%甲醛的生理盐水洗下菌苔,4℃10000rpm离心10min洗涤沉淀,重复3次,121℃高压2h破坏表面抗原,调整浓度至30亿菌/ml即为凝集原。

3.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:所述抗原稀释度为1∶2,即最佳抗原包被\t浓度15亿菌/ml的细菌浓度,其蛋白含量为4.75μg/ml。

4.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:步骤(5)中最佳标准阳性血清稀释度选用1∶50。

5.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:所述的步骤(11)中的OD492/630为0.444为阴阳性临界值,确定血清样品的P/N值,即标准阳性血清OD值/标准阴性血清OD值≥2.1且临界值≥0.444即为阳性;反之判为阴性。

6.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:所述标准阳性血清通过采用100亿菌/ml的全菌抗原感染健康无免疫家兔,经玻板凝集法试血,效价达标后,放血,无菌分离血清,加万分之一柳硫汞,-20℃冻存。

7.根据权利要求5所述的检测方法,其特征在于:所述的标准阴性血清采取自健康无免疫家兔。

8.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:所述的标准曲线及回归方程的建立以每份标准阳性血清按1∶50稀释时的OD492/630值为横坐标,以相应的ELISA效价倒数的对数为纵坐标,作散点图,得出标准曲线及回归方程。

9.一种依据权利要求1所述的检测方法制备的用于微囊化大肠杆菌口服疫苗免疫抗体检测的检测试剂盒,应用于微囊化大肠杆菌口服疫苗免疫过后的动物,可针对其机体所产生的特异性免疫抗体进行检测。

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