本发明涉及生物免疫检测技术领域，特别是涉及一种电化学纳米免疫传感器的通用信号放大系统的制备方法。
背景技术：
目前需检测的常见生物分子对象包括所有可以作为抗原的生物大分子，如蛋白质、微生物等，以及作为半抗原的化合物，如抗生素、激素、毒素、农药等，都可以制备其特异性的识别抗体，从而制成相应的电化学免疫传感器。对于蛋白质等生物大分子常用检测方法是Western blot和ELISA，但周期较长且灵敏度不高；对于微生物常用的检测方法是培养基法，周期相对ELISA更长，而电化学纳米免疫传感器具有快速、灵敏、耗费低，操作简单等优点，成为生物检测领域的新潮流。但实现电化学信号系统对抗原或者带有该抗原的病原菌进行快速、定量和特异性检测，需解决的一个关键问题是：抗原和抗体结合的微弱信号如何能够转化成足够强电化学信号，再经过放大处理而被采集到。
为解决上述问题，本发明提供一种电化学纳米免疫传感器的通用信号放大系统的制备方法法。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，提供一种灵敏度高、特异性强、快速定量的电化学纳米免疫传感器的通用信号放大系统的制备方法。
本发明提供一种电化学纳米免疫传感器的通用信号放大系统的制备方法，包括步骤如下：
(1)玻碳电极预处理，其中，所述玻碳电极用0.03μm粒径的氧化铝浆在麂皮上呈8字形抛光；
(2)待预处理后的玻碳电极干燥后，取5μL壳聚糖/硫堇共聚物溶液 滴加于干燥后的玻碳电极表面的中心，自然干燥后用超纯水反复清洗形成的聚合物膜至洗出水在600nm下无吸光值；
(3)取5μL纳米金/辣根过氧化物酶溶液滴加于用超纯水反复清洗的玻碳电极表面的中心，37℃干燥箱干燥20-30min，待干燥后用超纯水清洗2-3次；其中，纳米金溶胶的制备方法如下：
取4mL 1％柠檬酸钠溶液加入到100mL 0.01％氯金酸溶液中混匀，置于微波炉中中火保持5-10min，反应至溶液成透亮的酒红色即得纳米金溶胶，上述百分数均指的是质量百分数；
(4)再将所述玻碳电极置于纯化的单克隆抗体溶液中4℃自组装24h；
(5)最后将所述玻碳电极置于1％的牛血清白蛋白溶液中37℃温育1h，以封闭非特异性位点，以含体积百分比0.05％Tween-20的PBS溶液清洗未结合的BSA；自然晾干即得电化学纳米免疫传感器。
进一步地，在步骤(1)中，所述玻碳电极预处理还包括下述过程：将抛光后的玻碳电极用水清洗后在超声水浴中清洗数十秒，至表面光滑洁净，并在1×10-3mol/L K3Fe(CN)6溶液中用循环伏安法活化电极，重复扫描直至出现稳定的循环伏安曲线，最后置于氮气中备用；其中，所述循环伏安法的扫描范围为0.6～－0.1V，扫描速度为50mV/s，峰电位差为64mV。
进一步的，在步骤(2)中，所述壳聚糖/硫堇共聚物通过下述方法得到：
首先取0.6mL质量百分比为10％的戊二醛溶液滴加到5mL质量百分比2％的壳聚糖溶液中混匀，然后加入0.4mL浓度为0.01mol/L硫堇溶液再次混匀，最后再滴加4mL体积百分比2％的乙酸溶液至总体积为10mL，摇匀后静置5min至溶液中无气泡，即得所述壳聚糖/硫堇共聚物。
进一步地，所述纳米金利用分光光度计对其进行扫描，光吸收性胶体金在可见光范围内有一单一光吸收峰，且光吸收峰的波长λmax在518nm；用透射电镜对所制纳米金溶胶颗粒的大小、形状及分散情况进行进一步精确的表征，结果显示颗粒呈球形，分散均匀，粒径为18-20nm。
进一步地，在步骤(3)中，所述纳米金/辣根过氧化物酶溶液采用下述方法制备：用浓度为0.1mol/L K2CO3调节所述纳米金溶胶的pH值至7.0后， 取1mL所述纳米金溶胶与1mL 2.0g/L HRP溶液搅拌混匀，即得所述纳米金/辣根过氧化物酶溶液。
进一步地，在步骤(4)中，所述单克隆抗体为Balb/c小鼠腹水纯化，且浓度不低于0.5mg/mL。
进一步地，在步骤(5)中，所述牛血清白蛋白溶液采用下述方法制备：称取1g牛血清白蛋白粉末加到双蒸水中，混合均匀。
采用上述技术方案，具有以下有益技术效果：
(1)本发明玻碳电极的预处理采用8字型抛光，这种预处理方式可使电极表面更平滑，且不需要在不同铝粉粒径下反复研磨，操作更简单，所需时间更短；
(2)本发明纳米金溶胶制备时间减少至5-10min；
(3)本发明直接以壳聚糖/硫堇(Chit/Thi)共聚物作为侨联剂吸附纳米金/辣根过氧化物酶(GNPs/HRP)，并通过纳米金粒子(GNPs)吸附单克隆抗体分子。
(4)本发明中经优化，单克隆抗体来自于Balb/c小鼠，且浓度不得低于0.5mg/mL。抗体分子Fc端与纳米金粒子可以稳定结合，意味着只要是来自于Balb/c小鼠的单克隆抗体分子均可以利用该信号放大系统制备成电化学免疫传感器用于相应抗原的检测。
为了实现上述以及相关目的，本发明的一个或多个方面包括后面将详细说明并在权利要求中特别指出的特征。下面详细说明了本发明的某些示例性方面。然而，这些方面指示的仅仅是可使用本发明的原理的各种方式中的一些方式。此外，本发明旨在包括所有这些方面以及它们的等同物。
具体实施方式
在下面的描述中，出于说明的目的，为了提供对一个或多个实施例的全面理解，阐述了许多具体细节。然而，很明显，也可以在没有这些具体细节的情况下实现这些实施例。
本发明中的传感器检测原理是采用三电极检测系统，基于结合在玻碳电极上的HRP和Thi可以与H2O2产生一系列氧化还原反应释放电子， 电极表面的抗体与抗原结合形成的免疫复合物由于空间位阻效应阻碍了电子转移，位阻效应的变化可以通过电流的变化而测得，因此可以通过检测免疫结合前后电流的变化检测细菌浓度。其中Thi、GNPs对检测过程中的电子转移具有非常好的信号放大作用。利用循环伏安法、交流阻抗法，原子力显微镜等表征电极组装的各个阶段，利用时间-电流曲线法对抗原样品溶液进行测定，结果表明检测灵敏度高、特异性强、稳定性好，检测速度快，可应用于多数可制备成单克隆抗体的微生物、毒素、蛋白分子等的快速检测。
其中，在本发明中的检测原理是基于结合在玻碳电极上的HRP和Thi可以与H2O2产生一系列氧化还原反应：
(1)HRP+H2O2→CompoundⅠ+H2O；
(2)CompoundⅠ+Thionine(red)→CompoundⅡ+Thionine(ox)*；
(3)CompoundⅡ+Thionine(ox)*+2H+→HRP+Thionine(ox)+H2O；
(4)Thionine(ox)+2e－+2H+→Thionine(red)。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。以下将一种谷胱甘肽电化学纳米免疫传感器的通用信号放大系统的制备方法为实施例进行说明。
实施例1
本发明提供的一种谷胱甘肽电化学纳米免疫传感器的通用信号放大系统的制备方法包括:
(1)玻碳电极预处理，其中，玻碳电极用0.03μm粒径的氧化铝浆在麂皮上呈8字形抛光；
(2)待预处理后的玻碳电极干燥后，取5μL壳聚糖/硫堇共聚物溶液滴加于干燥后的玻碳电极表面的中心，自然干燥后用超纯水反复清洗形成的聚合物膜至洗出水在600nm下无吸光值；
(3)取5μL纳米金/辣根过氧化物酶溶液滴加于用超纯水反复清洗的玻碳电极表面的中心，37℃干燥箱干燥20-30min，待干燥后用超纯水清洗2-3次；其中，纳米金溶胶的制备方法如下：
取4mL 1％柠檬酸钠溶液加入到100mL 0.01％氯金酸溶液中混匀， 置于微波炉中中火保持5-10min，反应至溶液成透亮的酒红色即得纳米金溶胶，上述百分数均指的是质量百分数；
(4)再将玻碳电极置于纯化的单克隆抗体溶液中4℃自组装24h；
(5)最后将玻碳电极置于1％的牛血清白蛋白溶液中37℃温育1h，以封闭非特异性位点，以含体积百分0.05％Tween-20的PBS溶液清洗未结合的BSA；自然晾干即得电化学纳米免疫传感器。
其中，在上述制备过程中包括玻碳电极的预处理、壳聚糖/硫堇(Chit/Thi)共聚物的制备、纳米金(GNPs)溶胶的制备、纳米金/辣根过氧化物酶溶液(GNPs/HRP)溶液制备和单克隆抗体浓度的优化。
1、玻碳电极的预处理：
将玻碳电极0.03μm粒径的氧化铝浆在麂皮上呈8字形抛光，用水清洗后在超声水浴中清洗数十秒，至表面光滑洁净；该电极在1×10-3mol/L K3Fe(CN)6溶液(含0.20mol/L KNO3)中的循环伏安曲线(扫描范围为0.6～－0.1V，扫描速度为50mV/s)满足下述要求：峰电位差应在80mV以下，并尽可能的接近64mV，电极方能使用，最后置于氮气环境中干燥待用。
常规玻碳电极预处理方法为：将玻碳电极依次分别用1.0μm、0.3μm、0.05μm粒径的α-Al2O3浆在麂皮上抛光三次，且每次抛光后在超声水浴中清洗30s，最后依次用HNO3与H2O按照体积比为1∶1配置的混合液、无水乙醇、超纯水清洗。本发明玻碳电极的预处理方法相比于常规玻碳电极预处理方法，在达到同样要求的条件下，本发明的操作更简单，所用时间更短。
2、壳聚糖/硫堇(Chit/Thi)共聚物的制备:
取0.6mL质量百分比10％的戊二醛溶液滴加到5mL 2％的壳聚糖溶液中完全混匀，后取0.4mL 0.01mol/L硫堇(Thi)溶液于混合液中再次混匀，最后向混合溶液中滴加4mL体积百分比2％的乙酸溶液至总体积为10mL，摇匀后静置5min至溶液中无气泡，且该共聚物溶液需现用现配。
3、纳米金(GNPs)溶胶的制备:
取4mL 1％柠檬酸钠溶液加入到100mL 0.01％氯金酸溶液中混匀， 置于微波炉中中火保持5-10min，至溶液成透亮的酒红色即得纳米金溶胶，置于4℃避光保存备用。
在本发明中利用分光光度计对所制备的纳米金溶胶在可见光范围内(400-700nm)进行扫描，光吸收性胶体金在可见光范围内有一单一光吸收峰，且光吸收峰的波长λmax在518nm处左右。用透射电镜对所制纳米金溶胶颗粒的大小、形状及分散情况进行进一步精确的表征,所合成的纳米金形状规则，粒度均匀，平均粒径约为18-20nm，且没有聚集现象。
4、纳米金/辣根过氧化物酶溶液(GNPs/HRP)溶液制备：
用0.1mol/L K2CO3调节纳米金溶胶的pH值至7.0后，取1mL纳米金溶胶与1mL 2.0g/L HRP溶液搅拌混匀，现配现用。
5、单克隆抗体浓度的优化
将结合有壳聚糖/硫堇(Chit/Thi)-纳米金/辣根过氧化物酶(GNPs/HRP)的玻碳电极在浓度依次为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5……1.0mg/mL抗-谷胱甘肽单克隆抗体溶液中4℃自组装24h，自然干燥后，采用循环伏安法表征该电极，检测底液为1×10-3mol/L K3Fe(CN)6溶液(含0.20mol/L KNO3)，扫描范围为0.6～－0.1V，扫描速度为50mV/s。经比较其氧化还原峰电流变化量发现，当自组装抗体溶液浓度大于0.5mg/mL时，峰电流变化量基本不变，约为3.5μA。此时，抗体吸附量达到最大。
在本发明的实施例中，采用时间-电流曲线法对上0.01mol/L pH7.2 PBS梯度稀释的GST蛋白溶液(含5μL 30％H2O2)进行检测，检测电位-0.4V，检测时间100s，得到电流浓度标准响应曲线，从而对样品溶液进行检测，结果表明其具有较宽的线性范围，免疫反应前后稳定电流的变化率与标准GST蛋白质量浓度的对数在0.1～104pg/mL范围内线性相关，最低检测限达(S/N＝3)0.03pg/mL。连续测定12次，结果相对标准偏差R.S.D为4.23％，证明该传感器的误差较小，定量效果较好。将该传感器于0.01mol/L pH值为7.2的PBS缓冲液上方4℃保存，间歇性使用，第15天电流响应信号为初始电流的93.44％，表明该传感器具有良好的稳定性。取不同批次制备的免疫传感器5支，在相同条件下对同一浓度蛋白 溶液进行测定，结果响应电流的相对标准偏差R.S.D.＝3.37％，说明该传感器重现性良好。
通过上述实施方式可以看出，本发明提供的电化学纳米免疫传感器的通用信号放大系统的制备方法是一种灵敏度高、特异性强、快速定量的制备方法。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。