本发明涉及一种透明质酸的测定试剂及其制备方法，属于生化手段测试
技术领域：
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背景技术：
：据统计，我国现有9000万的乙肝患者和感染者，部分患者在数年或数十年的慢性病程中由慢性肝炎发展至肝硬化，在这个过程中，肝纤维化是肝病进展的重要阶段，是许多慢性肝病的共同病理过程，是向肝硬化甚至原发性肝癌发展的一个中间环节，肝纤维化的早期治疗可以逆转或抑制其发展。因此，及早发现肝纤维化对于及时治疗、阻断和逆转肝纤维化发生和发展，防止肝硬化发生具有十分重要的意义。乙型与丙型病毒性肝炎是引起肝纤维化最常见的病因。肝纤维化(1iverfibrosis)是肝细胞损伤后的一种异常修复过程，其实质是肝细胞外基质(ECM)合成和降解失衡，ECM在肝内过度沉积。肝纤维化发生时，肝脏沉积的纤维结缔组织包括细胞成分和细胞外间质两大部分。细胞外间质有胶原、非胶原性糖蛋白、蛋白多糖，三者统称为细胞外基质。肝纤维化发展过程中，ECM合成量增多，分解减少。它是各种慢性肝病的共同转归，最终发展为肝硬化，甚至肝癌。通过肝穿刺对肝组织进行活检仍是目前判断肝纤维化程度的“金标准”。但它具有创伤性，且由于肝硬化在全肝中的不均一性，穿刺活检也有其局限性。目前临床上应用最为广泛的血清学指标是与肝细胞外基质相关的直接指标和反映炎症活动的间接指标。直接指标包括透明质酸(HA)、III型前胶原氨基端肽(PIIINP)、IV型胶原(CIV)、层粘连蛋白(LN)、基质金属蛋白酶(MMPs)及其抑制剂(TIMPs)等。间接指标包括血小板计数(PLT)、谷丙转氨酶(ALT)、α2-巨球蛋白(α2M)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、触珠蛋白(HP)、总胆红素(TBIL)、载脂蛋白A1(APOAl)等，但这些指标对肝纤维化诊断的特异性、敏感性、准确性、阳性和阴性预测值尚不能完全真实地反映肝纤维化的实际状况。目前的临床研究表明，在众多的纤维化生化指标中，HA是最敏感和特异的，HA与病理诊断之间有良好的相关性(R>0.79)，诊断的敏感性为75-90％，特异性为59％，诊断界值为30-60μg/ml。透明质酸(HA)是一种非硫化粘多糖(分子量10-6道尔顿)，存在于组织、体液等细胞外基质(ECM)中。HA是ECM的主要成分之一，正常情况下由间质细胞合成，参与组织重建、扩增组织间隙、炎症反应和肿瘤发生等过程。在组织中，HA以其凝胶性质，行使某些正常生理功能，如保持软骨的完整性、渗透压平衡和水的动态平衡等。腹膜间皮细胞是腹腔内HA的主要来源，故HA是腹腔间皮细胞的功能性标志之一。己知在肝硬化、肺纤维化、类风湿性关节炎及恶性间皮瘤等患者的血清中，可检测到显著增高的HA。HA主要由组织中成纤维细胞合成，可较准确灵敏地反映肝内已生成的纤维量及肝细胞受损、炎症活动状况。有研究认为HA是反映肝纤维化最具价值的血清学标志物。血清HA在急肝、慢迁肝时轻度升高，慢活去肝时显著升高，肝硬化时极度升高，国内张鲁榕等首先用RIA测定方法对254例肝病患者HA水平进行测定也证实了这点。HA水平与血清胆红素、谷丙转氨酶、y-球蛋白呈正相关；与血清白蛋白、凝血酶原时间呈负相关，故是反映肝损害严重程度、判断有无活动性肝纤维化的定量指标，且有助于慢迁肝与慢活肝的鉴别诊断和评估肝病发展趋势和判断药效。另有研究显示，血清HA诊断肝硬化的阴性预测值(99％)明显高于阳性预测值(30％)，因而对排除肝硬化具有较好的应用价值。由于血清学指标具有安全、快速、可重复的优点，因此，近年来利用血清学标志物来监测慢性肝病肝纤维化试剂开始应用，尤其是在随访疗效方面发挥替代肝穿刺活检作用。目前检测血清中HA含量多采用以HA结合蛋白(HABP)为主要试剂的放射免疫法(RIA)和酶联免疫法(ELISA)。这两种方法都较为准确可靠，但放射免疫法(RIA)具有一定的放射性污染，不利于检测的大规模开展；酶联免疫法(ELISA)对实验要求较高，实验时间较长，并且需要配备酶标仪，对于基层医院较难普及。基于此，做出本申请。技术实现要素：为了克服现有透明质酸在测试过程中存在的上述缺陷，本发明具有安全、快速、可重复的特点，可避免不必要的肝脏穿刺。该产品具有检测精度好、测定时间短、程序简便、易于自动测定等优点，能够利用普通医院现有的自动生化仪测定，减少样品间的人为误差。为肝纤维化普查提供快速有效的诊断方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：一种透明质酸测定试剂，包括R1试剂、R2试剂和透明质酸校准品，其中R1试剂组成成分：Tris缓冲液50mmol/L(指Tris缓冲液在R1试剂中的终浓度)、透明质酸结合蛋白0.1mg/L(指透明质酸结合蛋白在R1试剂中的终浓度)、牛血清白蛋白0.1％(体积百分比)、叠氮钠0.1％(体积百分比)；R2试剂组成成分：透明质酸结合蛋白特异性抗体包被胶乳0.2％(体积百分比)、牛血清蛋白0.5％(体积百分比)、叠氮化钠0.09％(体积百分比)；透明质酸标准品组成成分：透明质酸、磷酸盐缓冲液50mmol/L(指磷酸盐缓冲液在透明质酸标准品中的终浓度)、叠氮钠0.1％(体积百分比)。同时，本发明还提供了一种具有上述特征透明质酸测定试剂的制备方法，包括如下步骤：(1)R1试剂配制：向纯化水中加入Tris，搅拌至完全溶解；加入透明质酸结合蛋白，搅拌至溶解；加入牛血清蛋白，搅拌至完全溶解，添加叠氮钠，搅拌至完全溶解，继续搅拌后定容；(2)R2试剂配制：向纯化水中加入牛血清蛋白，搅拌至完全溶解；加入叠氮钠，搅拌至完全溶解；加入透明质酸结合蛋白特异性抗体包被胶乳，搅拌至完全溶解，继续搅拌后定容；(3)透明质酸标准品配制：向纯化水中加入透明质酸，搅拌至完全溶解；加入磷酸氢二钾，搅拌至完全溶解；加入磷酸二氢钾，搅拌至完全溶解；加入叠氮钠，搅拌至完全溶解；继续搅拌后定容；(4)对上述制备的R1试剂、R2试剂及透明质酸标准品进行灵敏度、线性范围、精密度和准确度进行测定。其中上述工序中，搅拌速度均为300-500转/分。本发明的工作原理如下：血清样品中的透明质酸能与试剂盒中的透明质酸结合蛋白结合，结合后的产物与试剂中的含有anti-HABP抗体的胶乳颗粒发生反应，采用比浊法，使用光学监测仪器测定反应液吸光度值。反应液的混浊程度与血清中含有的透明质酸的含量呈正比，浊度越大，透明质酸的含量越高。(1)灵敏度评价试验根据GB/T26124-2011《临床化学体外诊断试剂(盒)》中对“分析灵敏度”检测的要求，以试剂盒在规定参数下对分析灵敏度评价用样本进行检测产生的吸光度改变，换算为n单位的吸光度的差值(ΔA)作为分析灵敏度。分析灵敏度评价试验对分析灵敏度评价用样本重复测定20次。评估结果：分析灵敏度89ng/ml吸光度变化率(ΔA/min)≥0.002ABS/min。(2)线性范围评价试验根据GB/T26124-2011《临床化学体外诊断试剂(盒)》和《体外诊断试剂分析性能评估指导原则——线性范围(征求意见稿)》中的建议，对试剂线性范围进行验证时，在待验证线性范围内选择5个浓度水平，每个浓度水平重复测定3次。评估结果：在线性范围(0-750ng/ml)内，线性回归的相关系数r≥0.990。当浓度≤50ng/ml时，绝对偏差≤5ng/ml；当浓度＞50ng/ml时，相对偏差应不大于10％。(3)精密度评价试验精密度评价包括重复性和批间差，且至少评估二个浓度水平样本的精密度，其中有一个浓度在医学决定水平左右。因此，重复性评价采用在重复性条件下，用二个浓度水平的控制物质(其中一个浓度接近医学决定水平)测试，每个浓度重复测试10次；批间差评价采用二个浓度水平的控制物质(其中一个浓度接近医学决定水平)分别测试3个不同批号的试剂盒，每个批号测试3次。评估结果：变异系数CV≤10％,相对偏差R≤10％。(4)准确度评价试验用不少于40个在检测浓度范围内的不同浓度的人源样品，以指定的分析系统作为比对方法，每份样品按待测试剂操作方法及比对方法分别检测。用线性回归方法计算两组结果的相关系数(r)及每个浓度点的相对偏差。评估结果：相关系数r≥0.975,相对偏差B≤10％。本发明利用胶乳增强免疫比浊法测定透明质酸的方法，其优点是：1.检测速度快：一个反应时间只需要十分钟，节省了病人结果等待时间；2.通用性强：能够使用医院现有的自动生化仪进行检测，无需额外投入新设备；3.样本量消耗少：采用本产品测试，只需要6微升血清样品。本发明可广泛的应用于肝硬化的早期诊断，为肝纤维化血清体检普查提供有效的诊断方法，也为肝硬化的早期诊断提供新的诊断途径。具有较好的市场前景和社会效益。具体实施方式本实施例所用主要试剂：Tris缓冲液50mmol/L、透明质酸结合蛋白0.1mg/L、牛血清白蛋白0.1％、透明质酸结合蛋白特异性抗体包被胶乳0.2％、牛血清蛋白0.5％、磷酸盐缓冲液50mmol/L、叠氮钠，均购自Enzymaker公司。(1)R1试剂的配制①将700ml纯化水加入到适当容器中。②开启电动搅拌器，搅拌速度均为450转/分。③称取100gTris加入上述纯化水中，搅拌至完全溶解。④称取2mg透明质酸结合蛋白加入上述溶液中，搅拌至完全溶解。⑤量取7.2ml牛血清蛋白加入上述溶液中，搅拌至完全溶解。⑥称取2.4g叠氮钠加入上述溶液中，搅拌至完全溶解。⑦搅拌十分钟以上。⑧定容至800ml。(2)R2试剂的配制①将300ml纯化水加入到适当容器中。②开启电动搅拌器，搅拌速度均为450转/分。③量取7.2ml血清蛋白加入上述纯化水中，搅拌至完全溶解。④称取2.4g叠氮钠加入上述溶液中，搅拌至完全溶解。⑤称取2.4g透明质酸结合蛋白特异性抗体包被胶乳加入上述溶液中，搅拌至完全溶解。⑥搅拌十分钟以上。⑦定容至400ml。(3)标准品的配制①将200ml纯化水加入到适当容器中。②开启电动搅拌器，搅拌速度均为450转/分。③称取3g透明质酸加入上述纯化水中，搅拌至完全溶解。④称取54.5g磷酸氢二钾加入上述溶液中，搅拌至完全溶解。⑤称取45.4g磷酸二氢钾加入上述溶液中，搅拌至完全溶解。⑥称取1.2g叠氮钠加入上述溶液中，搅拌至完全溶解。⑦搅拌十分钟以上。⑧定容至300ml。(4)试剂检验①仪器配置:仪器使用日立7100全自动生化分析仪。测定参数严格按照产品说明书在仪器中设定，基本测定参数如下：方法：两点终点法；反应方向：递增；波长：700nm(主波长)；温度：37℃。比色杯光径：1cm；R1试剂:165μl,R2试剂:83μl，样品：6μl。第一测光点：在R2试剂加入后1分钟读取；第二测光点：在R2试剂加入后5分钟读取。②试剂外观检查：目测检查。③装量检查：用通用量具测量。④试剂空白测定:用蒸馏水或去离子水作为空白样品测试试剂盒，在测试主波长下，记录测试启动时吸光度(A1试剂)和约5分钟后的吸光度(A2试剂)，A2即为工作试剂的空白吸光度。⑤线性范围测定:取接近线性范围上限的高值样本用生理盐水倍比稀释配制成不同浓度梯度的样本系列。以H值与稀释比例计算出预期值。稀释方法参照表1所示(根据高值的大小可相应调整稀释梯度)。表1样本稀释表实施例12345生理盐水(ml)00.50.50.50.5高值标本H(ml)10.50.50.50.5稀释比例原倍1/21/41/81/16表中：实施例1样本的浓度为已知定值CH，实施例2-5样本浓度按公式：样本浓度＝CH×稀释比例，计算作为预期值，将稀释好的样本系列充分混匀，在校正后的测定系统上按从低值到高值顺序平行测定2次，均值作为对应实施例样本实测值(如2次测定结果有明显偏差应剔除重测)。统计学分析：以预期值为横坐标，样本实测值为纵坐标作图及直线回归分析，确定线性区间计算出直线方程y＝a+bx及相关系数，当相关系数r≥0.990时为线性良好。数据分析处理采用MicrosoftExcel软件。相关公式如下：b=nΣXiYi-ΣXi·ΣYinΣXi2-(ΣXi)2...(1)]]>|a|=|ΣYi-bΣXin...(2)]]>r=nΣXiYi-ΣXi·ΣYi[n·ΣXi-(ΣXi)][nΣYi-(ΣYi)]...(3)]]>式中，C：浓度；V：容积；b：回归线的斜率；∣a∣：回归线截距的绝对值；r：相关系数；Xi：各管预期值；Yi：各管测定值；i：1、2、3.……、n；n：测定样本数。⑥精密度测定:a.重复性测定:用临床标本或质控血清测试试剂盒，重复测试10次，计算测量值的平均值和标准差(s)。按如下公式计算变异系数(CV)。与变异系数CV(％)X‾=ΣX1/n...(4)]]>CV=Σ(X‾-Xi)(X‾)2(n-1)...(5)]]>式中：——待测血清样本的均值；Xi——测定血清样本的测定结果；n——测定次数CV——变异系数b.批间差测定取三个批号送检试剂，每个批号取3瓶，分别测定1份临床样本或质控血清，可选用罗氏质控品，分别计算9份试剂测定均值和每个批号3份试剂的测定均值并用MicrosoftExcel软件统计三个批号试剂测定的变异系数。相关公式如下:式中：——中的最大值；——中的最小值；——总均值。⑦准确性测定:取校准品(有证参考物质，CRM)对试剂盒进行测试，重复检测3次，取测试结果均值(M)，按公式(7)计算相对偏差(B)。相对偏差(B)＝(M-T)/T×100％……………………………………………(7)式中：T——有证参考物质(CRM)标示值；M——样品测定结果均值。⑧分析灵敏度:用已知浓度或活性的样品测试试剂盒，记录在试剂盒规定参数下产生的吸光度改变，换算为n单位的吸光度差值(ΔA)。(5)试剂测定结果：线性范围：在线性范围(0-750ng/ml)内，线性回归的相关系数r≥0.990。当浓度≤50ng/ml时，绝对偏差≤5ng/ml；当浓度＞50ng/ml时，相对偏差应不大于10％。准确度：相关系数r≥0.975,相对偏差≤15％。测量精密度：变异系数CV≤10％,相对偏差R≤10％。空白吸光度：空白吸光度(A)≤2.5(在温度37℃；波长700nm；比色皿光径1.0cm)分析灵敏度：试剂盒测试89ng/ml被测物时，吸光度差值(ΔA)≥0.002ABS。当前第1页1 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