一种鸭茅根部组织石蜡切片的制备方法与流程

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本发明涉及石蜡切片技术领域，具体涉及鸭茅根部组织石蜡切片的方法。

背景技术：

石蜡切片法是以石蜡作为包埋剂，经一系列处理制作永久装片的方法。它不仅可将材料切成极薄的切片（4 μm以下），而且能制成连续切片，并永久保存，清晰度好，亦适合作细胞学研究。石蜡切片是植物显微技术上最重要最常用的一种方法，在植物解剖学及其相关领域的生产和科研中有着广泛应用。

尤其是近年来，随着科学技术的发展与植物生态解剖学的兴起，石蜡切片成为了不同生境植物或演替系列优势种生态适应性研究的重要手段。但是，传统的石蜡切片方法存在制片周期长，易受条件限制，制片中使用化学试剂较多，对人有一定的毒害，易使材料变脆、变硬或变形，某些内含物易于消失，常使组织变小，甚至使组织扭转变形，细胞所含物质缩小而折光性增强，影响观察正确性，且制片成本较高等问题，加上若所取的组织块较小，则如何快速准确的包埋成功也是制片的关键之处。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种鸭茅根部组织石蜡切片的制备方法。该方法制得的鸭茅根部组织石蜡切片组织完整、细胞边界清晰。

本发明目的通过如下技术方案实现：

一种鸭茅根部组织石蜡切片的制备方法，包括对新鲜鸭茅根部组织块的杀死与固定，冲洗，脱水与透明，浸蜡与包埋，修块与切片，展片与烤片，脱蜡、复水与番红染色，固绿染色、脱水与透明，以及封片步骤；其特征在于：在冲洗步骤后、脱水与透明步骤前，还进行琼脂糖预包埋，所述琼脂糖预包埋是将冲洗后的鸭茅根部组织块包埋在经熬化后的5%琼脂糖凝胶中、以质量百分含量计（5 g琼脂糖溶于100 mL蒸馏水中）。实验中发现，进行所述的琼脂糖预包埋处理解决了因鸭茅根部组织过小难以快速准确包埋的问题。

进一步优化，在杀死与固定后、冲洗前，还进行酸化，具体是将固定好的鸭茅根部组织块置于0.5 mol/L三氯乙酸溶液中，酸化6-7 d，在酸化过程中，3-4 d时，更换一次0.5 mol/L三氯乙酸溶液。

更进一步，上述杀死与固定步骤中，采用的固定液为FAA混合固定液，即为福尔马林：冰醋酸：70 %乙醇（体积浓度）=1:1:18、以体积比计。

优选地，脱水与透明步骤是将经上述琼脂糖预包埋后的鸭茅根部组织块依次置于体积比为1:5:4的正丁醇、体积浓度为95%乙醇、蒸馏水混合液中2 h，置于体积比为2:5:3的正丁醇、体积浓度为95%乙醇、蒸馏水混合液中2 h，置于体积比为3:5:2的正丁醇、体积浓度为95%乙醇、蒸馏水混合液中2 h，置于体积比为5:4:1的正丁醇、体积浓度为100%乙醇、蒸馏水混合液中2 h，置于体积比15:4:1的正丁醇、体积浓度为100%乙醇、蒸馏水混合液中2 h，置于分析纯正丁醇中2 h，再置于新的分析纯正丁醇中2 h。

进一步，上述浸蜡与包埋步骤中，将脱水与透明处理后的鸭茅根部组织块放于42℃的体积比为1:1的二甲苯和软蜡混合剂中，分Ⅰ、Ⅱ两级，各1小时；然后转移至53℃纯软蜡中浸蜡6小时，分Ⅰ、Ⅱ两级，各3小时；再转移至63℃纯硬蜡中浸蜡3小时，分Ⅰ、Ⅱ两级，各1.5小时；所述软蜡为熔点46-48℃的石蜡，所述硬蜡为熔点为56-58℃的石蜡。上述Ⅰ、Ⅱ两级是指重复两次，每次换上新的没使用过的相应蜡液。

进一步，上述展片与烤片步骤中，在用于展片的载玻片上涂上蛋白甘油粘贴剂，所述蛋白甘油粘贴剂由体积比为1:1的鸡蛋清和甘油组成。

进一步，上述脱蜡、复水与番红染色步骤中，采用二甲苯脱蜡三次，每次25分钟；所述复水依次进入无水乙醇Ⅰ级、无水乙醇Ⅱ级、无水乙醇Ⅲ级、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇中、乙醇均为体积百分浓度，每步停留4-5分钟，然后蒸馏水洗5秒后进入1%水溶液番红染液、质量浓度，密封过夜。上述Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级是指重复三次，每次换上新的没使用过的无水乙醇。

更进一步，上述固绿染色、脱水与透明步骤中，将经脱蜡、复水与番红染色处理的切片在95%乙醇中漂去浮色5-10秒，然后进入质量浓度为0.5%的95%乙醇固绿染液，保持30秒，所述95%乙醇为体积百分浓度；然后进行脱水：经三级分析纯无水乙醇处理，即为进入无水乙醇Ⅰ级、无水乙醇Ⅱ级、无水乙醇Ⅲ级，每级30秒-1分钟；脱水后进入透明处理：经三级分析纯二甲苯处理，即为进入二甲苯Ⅰ级、二甲苯Ⅱ级、二甲苯Ⅲ级，每级20分钟。上述Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级是指重复三次，每次换上新的没使用过的无水乙醇或二甲苯。

最优选地说，一种鸭茅根部组织石蜡切片的制备方法，按如下步骤：

（1）杀死与固定

剪取新鲜鸭茅根部，用一次性双面刀片切取鸭茅根部组织块，约2~3 mm，后立即轻轻置于FAA混合固定液中固定、所述FAA混合固定液为体积比为1:1:18的福尔马林、冰醋酸、70 %乙醇；固定液体积应为鸭茅根部组织块总体积的10~15倍。材料经固定后，若不及时使用需要保存下来备用；鸭茅根部组织在上述FAA混合固定液中且置于冰箱4℃可保存半年至一年，材料的结构不会发生变化也不至于变坏。所述杀死与固定有效防止了细胞组织发生自溶现象。

（2）酸化

将固定好的鸭茅根部组织块置于0.5 mol/L三氯乙酸溶液中，酸化6-7 d，在酸化过程中，3-4 d时，更换一次0.5 mol/L三氯乙酸溶液。

（3）冲洗

剪取干净双层纱布折成方形，采用细小镊子将经酸化的鸭茅根部组织块置于纱布中央，用2 B铅笔做好材料名称及编号标记后，将纱布合拢，用尼龙绳将纱布绑好，以材料在流动的水中不漏出为准；将纱布小团置于流动的水中，冲洗约24 h。

（4）琼脂糖预包埋

配制质量百分浓度为5 %的琼脂糖凝胶（取5 g琼脂糖溶于100 mL蒸馏水中），经多次熬化后，倒入预先放置的4孔打孔器的平板上，厚度约5~7 mm，以备材料放入后进行封口；待琼脂糖冷凝后，取出打孔器，从流动的水中取出纱布团并打开纱布团，将冲洗完成后的鸭茅根部组织块横切面向上，依次用细小镊子轻放至凝胶孔底部（打孔器不会将孔打穿，鸭茅根部组织块不会从凝胶孔底部漏出），并将琼脂糖修整成规则的长条形，切去左上角以示材料编号，然后在酒精灯上进行琼脂孔的封口、避免在孔内密封大量空气。

（5）脱水与透明

用镊子轻轻夹取包埋着的鸭茅根部组织琼脂块依次置于体积比为1:5:4的正丁醇、体积浓度为95%乙醇、蒸馏水混合液中2 h，置于体积比为2:5:3的正丁醇、体积浓度为95%乙醇、蒸馏水混合液中2 h，置于体积比为3:5:2的正丁醇、体积浓度为95%乙醇、蒸馏水混合液中2 h，置于体积比为5:4:1的正丁醇、体积浓度为100%乙醇、蒸馏水混合液中2 h，置于体积比15:4:1的正丁醇、体积浓度为100%乙醇、蒸馏水混合液中2 h，置于分析纯正丁醇中2 h，再置于新的分析纯正丁醇中2 h。

（6）浸蜡与包埋

在烘干的烧杯中倒入二甲苯，再倒入等量的液态软蜡制得体积比为1：1的二甲苯、软蜡混合剂，置于42℃恒温箱中备用；用细镊子夹取透明完全的鸭茅根部组织琼脂糖块轻放于42℃恒温箱中的二甲苯、软蜡混合剂，分I、II两级，各1 h；然后将琼脂糖块转移至纯软蜡在53℃恒温箱中浸蜡6 h，分I、II两级，各3 h；再转移至纯硬蜡在63℃恒温箱中浸蜡3 h，分I、II两级，各1.5 h。上述Ⅰ、Ⅱ两级是指重复两次，每次换上新的没使用过的相应蜡液。

在备好的包埋纸盒中，倒入纯硬蜡II中的硬蜡，同时夹取浸蜡完成的琼脂糖块，摆正切面，待包埋纸盒中的硬蜡表面开始冷凝成固体，则立即将整个包埋纸盒置于冷水中，使其立刻凝固成蜡块。

上述石蜡平滑均匀而无杂质，均由上海永华石蜡有限公司提供。上述软蜡为熔点46~48℃的石蜡，硬蜡为熔点56~58℃的石蜡。

（7）修块与切片

剪开包埋纸盒，将石蜡块取出，用修块刀将石蜡块修成棱台形状，上、下切面平行，避开组织块，防止损伤组织块，然后固定在坚硬的小木方块上；用切片机夹夹紧木块，使蜡块与刀口平行，然后进行切片，切片厚度以5~7μm为宜。

（8）展片与烤片

经上述修块、切片后的蜡块成一连续条带状的蜡带，选取完整的蜡带分切成小段，先在洗净的载玻片上涂抹上一层由体积比为1:1的鸡蛋清和甘油组成的蛋白甘油粘贴剂、有效防止展片过程蜡带脱落，再用细小镊子轻轻地将蜡带放置于盛有蒸馏水的大烧杯内（预先放置于49~50℃恒温水浴锅内，保持大烧杯内水温与恒温水浴锅水温一致）进行展片，用覆有所述蛋白甘油的载玻片进行捞片，用小镊子摆正蜡带位置（位于载玻片下1/3~2/3处），用吸水纸吸去多余的水分，并用2B铅笔做好标记；然后将覆有蜡带的载玻片置于切片架上，于37℃恒温箱中烘片24 h，或自然风干。

（9）脱蜡、复水与番红染色

将上述干燥后的切片用二甲苯脱蜡三次，每次25分钟；脱蜡完毕后，即进入复水与番红染色系列：依次进入无水乙醇Ⅰ级、无水乙醇Ⅱ级、无水乙醇Ⅲ级、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇中、乙醇均为体积百分浓度，每步停留4-5分钟，然后蒸馏水洗5秒后进入1%水溶液番红染液、质量浓度，密封过夜。上述Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级是指重复三次，每次换上新的没使用过的无水乙醇。

（10）固绿染色、脱水与透明

将经脱蜡、复水与番红染色处理的切片在95%乙醇中漂去浮色5-10秒，然后进入质量浓度为0.5%的95%乙醇固绿染液，保持30秒，所述95%乙醇为体积百分浓度；然后进行脱水：经三级分析纯无水乙醇处理，即为进入无水乙醇Ⅰ级、无水乙醇Ⅱ级、无水乙醇Ⅲ级，每级30秒-1分钟；脱水后进入透明处理：经三级分析纯二甲苯处理，即为进入二甲苯Ⅰ级、二甲苯Ⅱ级、二甲苯Ⅲ级，每级20分钟。上述Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级是指重复三次，每次换上新的没使用过的无水乙醇或二甲苯。

（11）封片

将上述透明好的切片从二甲苯中取出，用纱布擦干净多余的二甲苯，然后用中性树胶封片，即在要观察的组织块附近滴上封片剂，沿着一边轻轻地盖上盖玻片（防止产生气泡），最后自然风干后即可在Olympus显微镜下观察和摄像。

本发明有益效果如下：

本发明方法制得的鸭茅根部组织石蜡切片，其组织完整、细胞界限清晰、色彩鲜艳、颜色对比鲜明、切片干净，表明该法适用于鸭茅根部组织石蜡切片制作，比传统植物石蜡切片制作方法能具有更好的效果。且能够在较短时间内完成较大批量鸭茅根部组织石蜡切片的制作，试验效果佳。

附图说明

图1：‘滇北’鸭茅侧根组织切片图；

图2：‘PI 594994’鸭茅初生根组织切片图；

图3：‘PG 49’鸭茅初生根组织切片图；

图4：‘黔草4号’鸭茅初生根组织切片图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整。

以下实施例中采用的‘滇北’、‘PI 594994’、‘PG 49’、‘黔草4号’为鸭茅品种（系）名称，分别来源于四川农业大学、美国牧草种质资源库、新西兰、贵州省草业研究所；为本领域所公知的品种（系）。

实施例1

一种鸭茅根部组织石蜡切片的制备方法，按如下步骤：

（1）杀死与固定

剪取新鲜‘滇北’鸭茅侧根部，用一次性双面刀片切取鸭茅根部组织块，约2~3 mm，后立即轻轻置于FAA混合固定液中固定、所述FAA混合固定液为体积比为1:1:18的福尔马林、冰醋酸、70 %乙醇；固定液体积应为鸭茅根部组织块总体积的10~15倍。材料经固定后，若不及时使用需要保存下来备用；鸭茅根部组织在上述FAA混合固定液中且置于冰箱4℃可保存半年至一年，材料的结构不会发生变化也不至于变坏。所述杀死与固定有效防止了细胞组织发生自溶现象。