本发明涉及体外诊断免疫检测领域，具体地，本发明提供了一种化学发光免疫检测肺炎支原体IgM试剂盒及其制备方法。
背景技术：
肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，MP）是介于细菌和病毒之间的一种超过滤性病原微生物，主要通过呼吸道飞沫以气溶胶微粒的形式传播。1962 年首先从人类原发性非典型肺炎（primary atypical pneumonia，PAP）患者的痰液中分离和培养而来。20 世纪90 年代以来，随着肺炎病原学的变迁，MP已成为小儿肺炎的重要病原体，MP感染不仅引起肺部病变，且能侵犯心、脑、肝、肾等其他器官，引起多种肺外表现。MP还是社区获得性肺炎（CAP）的重要病原，尤其是5 岁以上小儿，MP在非流行年占CAP 病原10~20％。因MP生长缓慢、潜伏期及带菌时间长，形成间歇期发病缓慢、长时期传播的流行特点，流行可达数月至数年。近些年来，流感人群比例逐年增加，不仅侵犯青少年和儿童，婴幼儿发病率也呈增多趋势，且由于MP感染常无特异性临床表现，容易与一般的病毒性感冒相混淆，因此能够及时确诊何种病因致病，做到早发现早治疗，减少儿童急性肺炎病情恶化，故早期诊断极为重要。
肺炎支原体抗体分为IgG抗体和IgM抗体两种，因为肺炎支原体感染的潜伏期为2周-3周，当患者出现症状而就诊时，IgM抗体已达到相当高的水平，因此，IgM抗体阳性可作为急性期感染的诊断指标。如IgM抗体阴性，也不能否定肺炎支原体感染，还需检测IgG抗体。IgG较IgM出现晚，需动态观察。肺炎支原体IgG抗体的测定，同时结合肺炎支原体IgM抗体的检测，可以用于辅助诊断支原体肺炎等疾病。
临床检测肺炎支原体IgM的主要方法为酶联免疫吸附法，但该方法存在着下述的不足之处：
（1） 使用12×8型、6×8型、8×12型或整板型96孔专用微孔板作为抗原包被用具和反应容器，在使用时只能分成12批次、6批次、8批次或整板一次使用，无法进行独立的、单人份的检测；
（2） 定量测定所用的试剂种类较多，每一种检测试剂都要用试剂瓶来盛装，并且每使用一种试剂时都需要更换吸液嘴来分别加注到微孔板的微孔中，不但试剂瓶种类多，加注试剂的操作也极为繁琐；
（3） 缺少对检测信息的相应标注，只能通过查看试剂盒外包装盒的标识才能了解或知悉检测试剂的生产批号及有效期信息，而且所知悉的信息在检测过程中不受控，具有很大的随意性；
（4） 检测试剂在检测过程中处于开放的空间，容易引起各种试剂之间的交叉污染而影响检测结果的准确性；
（5） 检测过程多采用手工操作，试剂或样本的加量不很精确，操作过程极为繁琐和复杂，容易发生操作差错，检测结果的准确度和精密度较差；
（6） 在检测项目成套试剂的数量配置及使用上均为项目数×48/96人份，如果需要检测10个项目，则试剂的配置及使用数须为10×48/96人份，如果只有一份样本需要检测10个不同的项目，也需要配置10×48/96人份的试剂，存在着不够经济合理的缺点。
技术实现要素：
目前肺炎支原体IgM检测技术存在以下缺点：检测成本高、检测灵敏度低、检测线性范围窄、重现性低、不能定量、操作复杂等。
本发明正是为了克服以上所述缺点，公开了一种检测成本低、灵敏度高、检测线性范围广、重现性高、可以定量、操作简单的肺炎支原体IgM试剂盒及其制备方法。本发明首先制备化学发光免疫分析试剂盒，主要包括：肺炎支原体IgM单克隆抗体包被的磁颗粒、肺炎支原体IgM单克隆抗体包被的吖啶酯以及肺炎支原体IgM定标品；然后利用全自动化学发光免疫分析仪对定标品进行检测，绘制标准曲线，内置于电脑软件，测试实际样本，根据样本发光值计算样本浓度；最后对肺炎支原体IgM全自动化学发光免疫分析系统进行性能（灵敏度、线性、精密度、干扰性）的评价。
本发明与目前技术相比，具有以下优点：
1、本发明选择吖啶酯作为标记材料，并应用于化学发光免疫分析系统，该发光体系为直接化学发光，与传统的酶促化学发光相比，该反应不需要酶的参与，更加节约成本；
2、本发明选用的吖啶酯化学发光免疫分析系统检测灵敏度高；
3、本发明选用的吖啶酯化学发光免疫分析系统准确性高；
4、本发明选用的吖啶酯化学发光免疫分析系统重复性高，批内及批间差均在5%以内，这是其它化学发光免疫分析系统难以达到的；
5、本发明的化学发光免疫分析系统已实现样本的定量，通过内置标准曲线到测试软件，只需测试样本就可直接得到样本的浓度值；
6、本发明的化学发光免疫分析系统已实现全自动化，试剂及样本的添加全有仪器完成，操作更加简便，减少了人为的误差。
具体实施方式
实施例1：肺炎支原体IgM化学发光免疫检测试剂盒制备方法
（1）肺炎支原体IgM单克隆抗体包被的纳米磁珠制备：
取50mg羧基化的磁微粒（粒径为0.05-1um）悬浮液，磁分离去上清，用0.02 M，pH为5.5 MES缓冲液重悬，加入0.5-2mL新配置的10 mg/mL的EDC水溶液，活化磁珠表面羧基，加入3-5 mg 肺炎支原体IgM单克隆抗体，室温下混悬2-10 h，磁分离，去除上清，用含2% BSA 的0.1 M pH为8.0的Tris缓冲液重悬到1mg/mL，得到肺炎支原体IgM单克隆抗体包被的磁颗粒，每瓶5mL分装保存于4℃备用。
（2）肺炎支原体IgM衍生物标记的吖啶酯的制备：
取50 uL 25mg/mL的肺炎支原体IgM衍生物，加入150 uL 0.1-0.2 M pH 9.0-9.5的碳酸盐缓冲液，混匀，然后加入1-2 uL 5 mg/mL的吖啶酯混匀，室温下避光反应，1-2 h后取出，用2 mL的zeba离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，最后加入得到的肺炎支原体IgM衍生物标记的吖啶酯溶液，收集离心管中的液体至保存管得到肺炎支原体IgM衍生物标记的吖啶酯，每瓶5 mL分装保存于4℃备用。
（3）肺炎支原体IgM定标品的制备：
用标准品缓冲液（40 mM Tris-HCl，0.5% BSA，1% NaCl，pH 8.0）将肺炎支原体IgM配置成一定浓度，每瓶0.5 mL分装冻干，4 ℃保存备用。
(4)化学发光预激发液的配制：
量取1.0升纯化水，依次加入80uL质量分数为20%的双氧水(H2O2)、1.0克叠氮化钠、1.5克吐温20，摇匀后避光存放。
(5)化学发光激发液的配制：
量取1.0升纯化水，依次加入0.6克氢氧化钠、0.5克PC300、0.5g叠氮化钠、1.5克Triton X-405，摇匀后避光存放。
实施例2：肺炎支原体IgM化学发光免疫检测方法：
本发明以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，本发明的方法学模式为竞争法，即仪器依次加入20 uL的样品、50 uL的肺炎支原体IgM单克隆抗体包被的磁颗粒以及50 uL的肺炎支原体IgM包被的吖啶酯，反应10 min后，进行磁分离，仪器将反应混合物送入暗室，依次加入50uL化学发光预激发液、50uL化学发光激发液进行发光反应，最后记录发光强度，从标准曲线计算出被测样品的 肺炎支原体IgM含量。
实施例3：肺炎支原体IgM化学发光免疫检测试剂盒性能评价
灵敏度的检测：
对血清盘中的灵敏度参考品进行检测，符合试剂盒技术要求。
准确度的检测：
对血清盘中的阳性参考品和阴性参考品进行检测，符合性均为100% 。
精密度测定：
对重复性参考品R1、R2和R3进行检测，每个样本每个浓度各做10个平行，用三批试剂盒进行检测，计算试剂盒批内及批间差，结果，测试R1和R2的试剂盒批内及批间差均小于5%，R3均为阴性。
干扰性实验：
取混合血清分别添加干扰物包括： 结合胆红素、游离胆红素、血红蛋白、抗坏血酸、甘油酯，添加比例按照 1:20 进行，分别测定混合血清及添加了各种干扰物后混合血清的测值，计算二者之间的偏差，以 ±10%为可接受范围。结果表明，干扰性均达到 NCCLS 的文件标准，可用于临床实验室肺炎支原体IgM浓度的准确评估。