盐酸兰地洛尔原料药物中起始物料A的检测方法与流程

本发明涉及一种盐酸兰地洛尔原料药物中起始物料A的检测方法，具体涉及一种采用液相色谱-串联质谱测定盐酸兰地洛尔原料药物中起始物料A的方法。
背景技术：
：盐酸兰地洛尔是一种选择性β1受体阻滞剂，主要拮抗存在于心脏的β1受体，通过抑制儿茶酚胺引起的心搏增加而改善心动过速性心律失常。目前，该药在国内还处于研究阶段，主要针对国外过期专利进行工艺改造，以达到降低用药成本的目的。根据合作企业提供的盐酸兰地洛尔的合成路线，(S)-(+)-间硝基苯磺酸缩水甘油酯(起始物料A)，其结构式如下：(S)-(+)-间硝基苯磺酸缩水甘油酯(起始物料A)是合成盐酸兰地洛尔的必备原料，但其即使在药物原料中痕量存在，也会影响盐酸兰地洛尔药物的使用安全性。如果采用常规的液相色谱方法检测，不仅检测灵敏度达不到要求，而且其中的主成分盐酸兰地洛尔对其检测有比较大的干扰。因此，建立一种能够检测并控制合成盐酸兰地洛尔原料药物中痕量起始物料A的含量的方法，对于保障该药物的使用安全性具有十分重要的意义。技术实现要素：针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种盐酸兰地洛尔原料药物中起始物料A的检测方法，采用液相色谱-串联质谱法对盐酸兰地洛尔原料药物中起始物料A进行定量测定，该检测方法快速、准确、灵敏度高，可实现盐酸兰地洛尔原料药物中痕量起始物料A的检测。为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：一种盐酸兰地洛尔原料药物中起始物料A的检测方法，包括：对盐酸兰地洛尔原料药物进行前处理的步骤，以及对前处理后的盐酸兰地洛尔原料药物进行液相色谱-串联质谱检测，采用外标法对盐酸兰地洛尔原料药物中起始物料A进行定量分析的步骤。所述对盐酸兰地洛尔原料药物进行前处理，具体步骤为：将盐酸兰地洛尔原料药物用稀释溶剂溶解，超声处理，离心，取上清液，作为检测样品。所述稀释溶剂选自色谱甲醇。所述盐酸兰地洛尔原料药物与稀释溶剂加入量的比为1mg：0.5mL。所述超声功率为250W或以上，超声时间为8-15分钟。超声处理的目的是加速样品溶解。所述离心速率为12000r/min，离心时间为5-15分钟。所述液相色谱-串联质谱检测，其中，液相色谱条件为：C18色谱柱，柱温：30℃，进样量5-10μL，流速0.3-0.5mL/min，含0.1％(体积比)甲酸的水溶液和乙腈作为流动相进行梯度洗脱。质谱条件为：电喷雾离子源(ESI源)，正离子模式检测，毛细管电压4000V，四极杆温度100℃，雾化压力35psig，干燥气温度330℃，干燥气流量12L/min，多反应监测(MRM)扫描模式。进一步的，所述液相色谱条件为：XDB-C18色谱柱，柱温：30℃，进样量5μL，流速0.4mL/min，含0.1％(体积比)甲酸的水溶液和乙腈作为流动相进行梯度洗脱。进一步的，所述梯度洗脱的程序为：时间(min)流动相A(％)流动相B(％)0802085951059510.18020128020其中，流动相A为含0.1％甲酸的水溶液，流动相B为乙腈。进一步的，MRM的具体参数设置如下：所述采用外标法对盐酸兰地洛尔原料药物中起始物料A进行定量分析的步骤为：配制10ng/mL-200ng/mL的起始物料A的系列标准品溶液，浓度梯度5个以上且均匀分布；利用液相色谱-串联质谱对标准品溶液进行检测，以目标物浓度为横坐标，以目标物峰面积为纵坐标做回归曲线，计算回归方程及相应的线性回归系数；然后在相同条件下对样品进行检测，将得到的起始物料A的峰面积代入回归方程中，即可计算得出起始物料A的含量。本发明中，由于起始物料A在盐酸兰地洛尔原料药物中多以痕量存在，所以需要对盐酸兰地洛尔原料药物进行预处理，目的是使起始物料A最大限度的溶出，以保证检测结果的准确性。本发明对盐酸兰地洛尔原料药物进行预处理方法进行了优化考察，结果发现，采用如下方法对原料药物进行预处理：将盐酸兰地洛尔原料药物用稀释溶剂溶解，盐酸兰地洛尔原料药物与稀释溶剂加入量的比为1mg：0.5mL，超声处理，离心，取上清液，作为检测样品；超声功率为250W或以上，超声时间为8-15分钟，离心速率为12000r/min，离心时间为5-15分钟。相对于其他预处理方法，采用本发明的上述预处理方法，可以最大限度的将起始物料A溶出，保证了检测结果的准确性。本发明中，建立合适的液相色谱条件，目的是让化合物能够实现良好的分离，使目标化合物不受其他物质的干扰。在本发明的液相色谱条件中，流动相的流速低则出峰慢，流速高则出峰快，色谱柱内径小则出峰较快，内径大则出峰相对较慢；另外，梯度洗脱程序是影响目标物分离效果的关键因素。本发明对流动相的流速、色谱柱等液相色谱条件进行了优化考察，特别是对梯度洗脱程序进行了优化，结果表明，采用本发明优化后的梯度洗脱程序能够在最短的时间内实现目标物的良好分离。本发明中，质谱条件的建立依据是让目标物的丰度最大，信噪比最高。液相色谱条件和质谱条件是根据目标化合物的保留时间和丰度来调节的，采用本发明的检测方法，最大限度的降低了对于起始物料A的检测限。本发明的有益效果：(1)本发明利用高效液相色谱-四级杆串联质谱，建立了盐酸兰地洛尔原料药物中(S)-(+)-间硝基苯磺酸缩水甘油酯的检测方法。本方法的检测灵敏度可达到0.50mg/kg，且方法的精密度和回收率均能满足(S)-(+)-间硝基苯磺酸缩水甘油酯的检测要求。本发明操作简单、结果可靠，可实现盐酸兰地洛尔原料药物中痕量(S)-(+)-间硝基苯磺酸缩水甘油酯的快速、低成本检测。(2)本发明对检测过程中液相色谱和质谱的操作参数进行了优化选择，使得检测时间短，同时又保证了检测的特异性、准确性和灵敏性。此外，为进一步的提高检测的准确性，发明人对样品进行了预处理，预处理的操作方法简单。本发明通过样品的预处理和检测过程的相互配合，使得本发明的检测方法能够用于盐酸兰地洛尔原料药物中(S)-(+)-间硝基苯磺酸缩水甘油酯的痕量检测，保证了盐酸兰地洛尔原料药物的使用安全性。附图说明图1：(S)-(+)-间硝基苯磺酸缩水甘油酯标准曲线；图2：盐酸兰地洛尔空白样品检测质谱图；图3：盐酸兰地洛尔空白样品加标(S)-(+)-间硝基苯磺酸缩水甘油酯的检测质谱图。具体实施方式结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。下述实施例中使用的主要仪器有：Agilent-1200型快速分离高效液相色谱(美国安捷伦科技有限公司)，6410型三重串联四级杆质谱(QQQ)(美国安捷伦科技有限公司)；Vortex-5型涡旋振荡器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；HeraeusMultifugeX1R型高速冷冻离心机(美国赛默飞世尔科技公司)；AL104型天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；0.5-10μL移液器(德国艾本德公司)；20-200μL移液器(德国艾本德公司)；100-1000μL移液器(德国艾本德公司)。下述实施例中使用的主要试剂有：(S)-(+)-间硝基苯磺酸缩水甘油酯标准品(武汉大华伟业医药化工有限公司)；色谱级甲醇(瑞典OceanPak公司)；色谱级甲酸(美国ROE科技公司)；色谱级乙腈(瑞典OceanPak公司)；哇哈哈饮用纯净水(杭州哇哈哈集团有限公司)。实施例1：盐酸兰地洛尔原料药物中起始物料A的检测具体步骤如下：(1)样品的前处理准确称取盐酸兰地洛尔原料约20.0mg，置于10mL容量瓶中，精密加入稀释溶剂至刻度，摇匀后超声10分钟，精密转移1.0mL至离心管中12000r/min离心10分钟后，取上清液进样5μL检测。(2)液相色谱-串联质谱检测采用高效液相色谱/质谱仪进行检测，内标法计算盐酸兰地洛尔原料药物中起始物料A的含量。液相色谱仪的参数条件为：XDB-C18色谱柱，柱温：30℃，进样量5μL，流速0.4mL/min，流动相A：含0.1％(体积比)甲酸的水溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱程序如表1所示：表1：串联质谱仪的参数条件为：电喷雾离子源(ESI源)，正离子模式检测，毛细管电压4000V，四极杆温度100℃，雾化压力35psig，干燥气温度330℃，干燥气流量12L/min，多反应监测(MRM)扫描模式。MRM的具体参数设置如表2所示：表2：(3)配制10ng/mL-200ng/mL的起始物料A的系列标准品溶液，具体方法如下：(S)-(+)-间硝基苯磺酸缩水甘油酯标准储备溶液的配制：准确称取(S)-(+)-间硝基苯磺酸缩水甘油酯标准品0.0100g，利用校准后的移液器准确加入1000μL的色谱级甲醇溶液溶解，配成浓度为10.0mg/mL的(S)-(+)-间硝基苯磺酸缩水甘油酯标准溶液。将1000μL的1.00mg/mL的(S)-(+)-间硝基苯磺酸缩水甘油酯标准溶液转移至10mL容量瓶中，色谱级甲醇溶液稀释并定容至刻度，配成浓度为1.00mg/mL的(S)-(+)-间硝基苯磺酸缩水甘油酯标准溶液储备液I。准确移取1000μL浓度为1.00mg/mL的(S)-(+)-间硝基苯磺酸缩水甘油酯标准溶液储备液至100mL容量瓶中，加入色谱级甲醇至刻度，配成浓度为10.0μg/mL的(S)-(+)-间硝基苯磺酸缩水甘油酯标准储备液II，备用。精密量取(S)-(+)-间硝基苯磺酸缩水甘油酯标准储备液II1.0mL于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配成浓度为1.00μg/mL的标准品溶液，然后用甲醇逐级稀释配置成浓度分别为200ng/mL、160ng/mL、100ng/mL、80ng/mL、40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL的起始物料A标准曲线溶液。上述溶液各进样5.0μL，记录峰面积。以目标物浓度与内标浓度的比值为横坐标，以相应目标物峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标做回归曲线，计算回归方程及相应的线性回归系数。(S)-(+)-间硝基苯磺酸缩水甘油酯的标准曲线结果见图1和表3。表3：然后在相同条件下对样品进行检测，将得到的起始物料A的峰面积代入回归方程中，即可计算得出起始物料A的含量。3批实际样品中起始物料A的含量检测结果见表4；表4：实施例2：本发明检测方法的方法学考察1.专属性(1)盐酸兰地洛尔原料空白样品的配制(2.0mg/mL)：精密称定空白盐酸兰地洛尔样品20.0mg，置于10mL量瓶中，加稀释溶剂至刻度，摇匀后超声10分钟，作为空白样品溶液。移取1.0mL至离心管中，12000r/min离心10分钟后，取上清液进样5.0μL，按实施例1的液相色谱/串联质谱检测条件检测，质谱图如图2所示。(2)盐酸兰地洛尔原料药加标(起始物料A)样品溶液的配制：准确称取盐酸兰地洛尔样品20.0mg，置于10mL量瓶中，准确加入浓度为2.0mg/mL的(S)-(+)-间硝基苯磺酸缩水甘油酯标准溶液1.0mL，加稀释溶剂至刻度。摇匀后超声10分钟，作为空白样品加标溶液。移取1.0mL至离心管中，12000r/min离心10分钟后，取上清液进样5.0μL，按实施例1的液相色谱/串联质谱检测条件检测，质谱图如图3所示。由图2和图3可以看出，空白的盐酸兰地洛尔原料中未检出起始物料A，而加标的盐酸兰地洛尔原料中起始物A有检出，说明盐酸兰地洛尔对起始物料A的检测无干扰，该方法起始物料A的检测灵敏度高。2.精密度准确配制浓度为80ng/mL的起始物料A标准溶液，重复进样6次，每次5.0μL，考察检测方法的精密度，实验结果见表5。表5：进样次数起始物料A的峰面积平行1437828.5789平行2424975.1409平行3430663.8039平行4414880.109平行5392250.6115平行6388165.0621平均值414793.8844RSD(％)4.943.定量限及检出限用甲醇逐级稀释(S)-(+)-间硝基苯磺酸缩水甘油酯标准储备溶液II，配制浓度为10.0ng/mL的(S)-(+)-间硝基苯磺酸缩水甘油酯标准溶液，作为起始物料A的定量限浓度，平行做三组，各进样5.0μL检测，检测结果如表6所示。用甲醇逐级稀释(S)-(+)-间硝基苯磺酸缩水甘油酯标准储备溶液II，配制浓度为1.0ng/mL的(S)-(+)-间硝基苯磺酸缩水甘油酯标准溶液，作为起始物料A的检出限浓度，平行做三组，各进样5.0μL检测，检测结果如表6所示。表6：结果表明，起始物料A最终的定量限为5.00mg/kg，检测限为0.50mg/kg。4.加标回收率空白样品溶液：精密称定盐酸兰地洛尔样品20.0mg，置10mL量瓶中，加稀释溶剂至刻度，摇匀后超声10分钟，作为空白样品溶液。平行制备3份。加样回收率试验溶液：称取三份取盐酸兰地洛尔样品20.0mg，置10mL量瓶中，分别加入起始物料A标准品溶液(浓度1.0μg/mL)1.6mL、0.8mL及0.2mL，再加稀释溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀后超声10分钟，作为加标浓度为160ng/mL、80ng/mL及20ng/mL的加样回收率试验溶液。每个浓度平行制备3份。利用液相色谱质谱联用仪进样上述溶液各5.0μL，记录样品峰面积，并计算回收率。结果见表7。表7：从表7中可以看出，利用本发明检测起始物料A，不仅空白样品无干扰，而且三个浓度点的加标回收率的范围在93.18％～103.3％之间，完全满足检测灵敏度的要求。当前第1页1 2 3