烟草、烟草制品及烟气中挥发性N‑亚硝胺的测定方法与流程

本发明涉及一种烟草、烟草制品及烟气中挥发性N-亚硝胺的测定方法，属于烟草化学检验技术领域。

背景技术：

N-亚硝胺是一类在结构上含有-N-NO的多种化合物的总称，根据物理性质的差异可将其分为挥发性N-亚硝胺和非挥发性N-亚硝胺。其中，挥发性N-亚硝胺是一类受到广泛关注的致癌物质，不仅是霍夫曼清单和美国食品药品监督管理局“烟草制品及烟气中有害及潜在有害物质名单”中的重要物质，也是国际癌症研究机构“无烟气烟草制品中28种有害物质”名单中的重要成分。因此，准确分析烟草制品成分及释放物中的挥发性N-亚硝胺含量，对评价烟草、烟草制品以及保障烟草制品消费安全具有重要意义。

最早建立的烟叶及烟气中挥发性N-亚硝胺的检测方法为：样品经水提取后用二氯甲烷萃取，有机相过氧化铝固相萃取柱净化，净化液浓缩后再经气相色谱-热能分析联用仪分离检测。后来建立的烟草基质中挥发性N-亚硝胺的测定方法均是在该方法的基础上改良而来。但是上述方法均要进行液液萃取、固相萃取净化、净化液浓缩等操作，样品前处理步骤繁琐，不利于大量样品的快速分析。此外，热能分析仪虽是分析挥发性N-亚硝胺的专属型检测器，但其仍存在前处理时间长、效率低等问题。

气相色谱-串联质谱以其强大的色谱分离能力、良好的选择性和灵敏度，在复杂样品痕量物质的分析中展现出强大的优势，在食品、化妆品中挥发性N-亚硝胺的分析中取得了广泛的应用。公布号CN105353068A的发明专利公开了一种烟草及无烟气烟草制品中挥发性N-亚硝胺的GC-MS/MS分析测定方法，包括：准确称取磨成粉末的烟叶样品或无烟气烟草制品样品，加入碱性二氯甲烷和内标溶液，振荡后加入无水硫酸镁，振荡，再加入N-丙基乙二胺和石墨碳，振荡后离心，取上清液氮吹浓缩，最后用GC-MS/MS测定浓缩液中挥发性N-亚硝胺(包括NDMA、NPYR、NPIP、NMEA、NDEA、NMBA、NDPA、NMOR和NDBA)的含量。该方法将基质分散固相萃取引入烟草及无烟气烟草制品挥发性N-亚硝胺的前处理操作中，能实现对基质的净化，检测灵敏度高、重现性好。但是该方法仅用于烟草及无烟气烟草制品中挥发性N-亚硝胺的测定，并不涉及烟草制品释放物中挥发性N-亚硝胺成分的测定，并且前处理操作中除水和净化分两步完成，不利于简化操作，而检测灵敏度也有待提高。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种烟草、烟草制品及烟气中挥发性N-亚硝胺的测定方法。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

烟草、烟草制品及烟气中挥发性N-亚硝胺的测定方法，包括样品的前处理步骤，具体为：在样品提取液中加入石墨化炭黑、N-丙基乙二胺键合硅胶、无水硫酸镁和氯化钠吸附剂，净化后离心、过滤，即得待测溶液。

对于烟草及烟草制品，样品提取液的制备步骤为：在浸有样品的碱液中加入二氯甲烷，提取后分离出有机相，过滤，即得。所述碱液可采用氢氧化钠水溶液，浓度为0.1～5mol/L，用量为1mL/g样品。二氯甲烷的用量为8～12mL/g样品。提取可采用超声提取的方式，超声功率280～700W，频率20～40kHz，时间不少于10min，优选为20min。分离可采用静置、离心的方式，离心转速5000～10000rpm，时间不少于3min，优选为5min。过滤需采用有机相滤膜，如0.22μm或0.45μm的尼龙膜。

对于烟草制品释放物(即烟气)，样品提取液的制备步骤为：将捕集有烟气粒相物的滤片与二氯甲烷混合，提取后过滤，即得。所述二氯甲烷的用量为：捕集有5支卷烟主流烟气总粒相物的滤片对应加入不少于10mL的二氯甲烷，优选为15mL。提取可采用超声提取的方式，超声功率280～700W，频率20～40kHz，时间不少于10min，优选为20min。过滤需采用有机相滤膜，如0.22μm或0.45μm的尼龙膜。

所述吸附剂中石墨化炭黑(GCB)、N-丙基乙二胺键合硅胶(PSA)、无水硫酸镁(MgSO₄)、氯化钠(NaCl)的质量比为3:2.5:14:5。每1mL样品提取液对应加入5～200mg吸附剂，优选加入120～130mg吸附剂。

所述净化可采用漩涡振荡的方式，如在转速500～2500rpm下振荡不少于1min，优选为10min。

烟草、烟草制品及烟气中挥发性N-亚硝胺的测定方法，还包括挥发性N-亚硝胺的测定步骤，具体为：取待测溶液进行气相色谱-串联质谱分析，对照标准曲线得到待测溶液中挥发性N-亚硝胺的含量，经计算得到样品中挥发性N-亚硝胺的含量。

所述挥发性N-亚硝胺包括NDMA、NDPA、NPYR、NMOR和NPIP。对应的，气相色谱-串联质谱分析的条件为：色谱柱：DB-35ms，30m×0.25mm×0.25μm，色谱柱升温程序：初始温度60℃，先以4℃/min的速率升温至120℃，再以40℃/min的速率升温至280℃，保持10min；进样方式：不分流进样；载气：高纯氦气，流速：1.0mL/min；进样口温度：280℃；接口温度：280℃，离子源温度：200℃；质谱电离源：EI源；电离电压：70eV；溶剂延迟时间：3min；碰撞气：氩气；监测模式：多反应监测。

所述多反应监测中NDMA、NDPA、NPYR、NMOR、NPIP的定量离子对依次为74.0>44.1、130.0>113.2、100.0>55.1、116.0>86.1和114.0>84.2，相应的碰撞电压依次为7.0、4.0、7.0、4.0和7.0eV；NDMA、NDPA、NPYR、NMOR、NPIP的定性离子对依次为74.0>42.1、130.0>43.1、100.0>43.1、116.0>56.1和114.0>42.1，相应的碰撞电压依次为16.0、16.0、10.0、16.0和16.0eV。

所述标准曲线的制备步骤为：以挥发性N-亚硝胺标准品为溶质，二氯甲烷为溶剂，配制系列浓度的混合标准溶液，经气相色谱-串联质谱分析后，以峰面积对应物质浓度作回归分析，即得各目标分析物的标准曲线。

本发明的有益效果：

本发明中样品前处理操作简单、快捷，杂质及干扰物的去除效率高，处理时间短。吸附剂石墨化炭黑、N-丙基乙二胺键合硅胶、无水硫酸镁和氯化钠对样品提取液具有良好的除水和净化效果，能有效去除杂质及干扰物，提高测定方法的准确度和精密度，同时将除水、净化两步操作合二为一，简化了前处理过程。

本发明采用气相色谱-串联质谱法定性、定量分析烟草、烟草制品及烟气中挥发性N-亚硝胺，检测灵敏度高，准确性和重复性好，操作简单且快速高效。通过优化质谱分析中多反应监测参数(包括定性、定量离子对和碰撞能量等)，检测的灵敏度提高，并且该方法的相对回收率介于82.4％～112.4％之间，日内及日间精密度分别小于9.1％和8.2％。

附图说明

图1为NDMA的多反应参数优化结果图；

图2为NDPA的多反应参数优化结果图；

图3为NPYR的多反应参数优化结果图；

图4为NMOR的多反应参数优化结果图

图5为NPIP的多反应参数优化结果图；

图6为混合标准溶液4的色谱图；

图7为中浓度加标样品的典型色谱图；

图8为不同质量吸附剂净化后待测溶液的紫外-可见吸收光谱图。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

无烟气烟草制品中挥发性N-亚硝胺的测定方法，包括以下步骤：

1)样品的前处理

样品提取液的制备：称取1.0g口含型(无烟气)烟草制品(精确至0.1mg)，置入15mL具塞离心管中，准确加入1.0mL浓度1.0mol/L的氢氧化钠溶液，充分浸润后加入10mL二氯甲烷，置于超声波发生器(购自昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ-700DB)上超声提取20min，超声功率700W，频率40kHz，静置5min后，置于离心机上离心5min，离心转速10000rpm，取下层清液(即有机相)过0.22μm尼龙膜，即得样品提取液。

样品提取液的除水和净化：取1mL滤液移至含有15mg GCB、12.5mg PSA、70mg MgSO₄和25mg NaCl的15mL具塞离心管中(GCB、PSA均购自维泰克科技(武汉)有限公司)，置于振荡器上振荡10min，转速1000rpm，再置于离心机上离心5min，离心转速10000rpm，取上清液过0.22μm尼龙膜，滤液即为待测溶液。

2)挥发性N-亚硝胺的测定

混合标准溶液的配制：以五种挥发性N-亚硝胺(NDMA、NDPA、NPYR、NMOR和NPIP)为溶质，二氯甲烷为溶剂，配制系列浓度的混合标准溶液，具体见下表1。

表1混合标准溶液的浓度表

标准曲线的制作：取混合标准溶液进行气相色谱-串联质谱分析，分析条件为：(岛津三重四级杆型气相色谱质谱联用仪，型号：GCMS-TQ8030)，色谱柱：DB-35ms，30m×0.25mm×0.25μm，色谱柱升温程序：初始温度60℃，先以4℃/min的速率升温至120℃，再以40℃/min的速率升温至280℃，保持10min；进样方式：不分流进样；载气：高纯氦气，流速：1.0mL/min；进样口温度：280℃；接口温度：280℃，离子源温度：200℃；质谱电离源：EI源；电离电压：70eV；溶剂延迟时间：3min；碰撞气：氩气；监测模式：多反应监测，参数见下表2，优化结果图见图1～5(图1中74.0>44.1的最大响应值为1313，74.0>42.1的最大响应值为664；图2中130.0>113.2的最大响应值为994，130.0>43.1的最大响应值为793；图3中100.0>55.1的最大响应值为738，100.0>43.1的最大响应值为720；图4中116.0>86.1的最大响应值为1941，116.0>56.1的最大响应值为1607；图5中114.0>84.2的最大响应值为712，114.0>84.2的最大响应值为581)；程序运行结束，以峰面积对应物质浓度作回归分析，即得各目标分析物的标准曲线，参数见下表3，混合标准溶液4的色谱图见图6。

表2多反应监测模式的参数设计

表3各目标分析物对应的标准曲线、定量限和检测限

注：检测限和定量限分别是信噪比(S/N)3和10时对应的浓度。

样品中挥发性N-亚硝胺的测定：取上述待测溶液进行气相色谱-串联质谱分析，分析条件同上，将测得的各物质峰面积代入下式1中，经计算得到样品中目标分析物的含量，其中NPIP的含量为40.2ng/g，其他物质均未检出。

式1：

式中，m为样品中目标分析物的含量，ng/g或ng/支；x为目标分析物的峰面积；a为标准曲线的斜率，b为标准曲线的截距；V为样品提取液的体积，mL；n为样品质量或烟支数，g或支。

实施例2

卷烟主流烟气中挥发性N-亚硝胺的测定方法，包括以下步骤：

1)样品的前处理

样品提取液的制备：按照GB/T 19609-2004、ISO 4387:2000的规定，用直线型吸烟机抽吸5支，将捕集有主流烟气总粒相物的滤片置于容器中，加入15mL二氯甲烷，置于超声波发生器(同实施例1)上超声提取20min，超声功率700W，频率40kHz，提取液过0.22μm尼龙膜，即得样品提取液。

样品提取液的除水和净化：取1mL滤液移至含有15mg GCB、12.5mg PSA、70mg MgSO₄和25mg NaCl的15mL具塞离心管中，置于振荡器上振荡10min，转速1000rpm，再置于离心机上离心5min，离心转速10000rpm，取上清液过0.22μm尼龙膜，滤液即为待测溶液。

2)挥发性N-亚硝胺的测定

样品中挥发性N-亚硝胺的测定：取上述待测溶液进行气相色谱-串联质谱分析，分析条件同实施例1，将测得的各物质峰面积代入式1中，经计算得到样品中目标分析物的含量，其中NDMA的含量为35.4ng/支，NPYR的含量为69.0ng/支，其他物质未检出。

在本发明其他的实施例中，超声提取、漩涡振荡的条件均可适当调整。

试验例

1)精密度及加标回收测试

为考察上述测定方法的重现性，在实施例1的待测样品中加入一定量的混合标准溶液，配制成低、中、高三种浓度的样品(低、中、高浓度对应的值分别为各目标分析物线性范围最低值的2、10和40倍)，中浓度样品的典型色谱图见图7。从图7可以看出，在优化的分析条件下，目标分析物与干扰物分离良好，干扰物不影响目标分析物的定量。

以一天内配制的5个样品进行测定，计算不同浓度下的日内相对标准偏差；以连续4天配制的样品进行测定，计算不同浓度下的日间相对标准偏差；将分析所得的峰面积代入标准曲线中，计算得到待测溶液中目标分析物的含量，并与实际添加量相比得到相对回收率，结果见下表4。从表4可以看出，目标分析物在不同浓度下的日内及日间精密度分别小于9.1％和8.2％，说明该方法具有较好的重现性。同时，不同浓度下目标分析物的相对回收率介于82.4％～112.4％之间，说明该方法的准确性好，可以满足日常分析要求。

表4精密度及加标回收测试结果

2)吸附剂用量的优化

将不同质量的吸附剂加入样品提取液中，净化后溶液的紫外-可见吸收光谱图见图8。从图8可以看出，吸附剂对样品提取液具有较好的除水和净化效果，且随着吸附剂用量的增加，净化效果逐步升高。综合考虑净化效果和吸附剂用量，吸附剂的优选用量为120～130mg/mL提取液。