本发明涉及检测
技术领域：
，尤其指一种利用南极假丝酵母源脂肪酶结合超声辅助醇解甘三酯，经过高效液相色谱分离提取、衍生化后利用气相色谱检测富含多不饱和脂肪酸的油脂甘三酯中sn-2位脂肪酸的方法。
背景技术：
：多不饱和脂肪酸(PUFA)指含有两个或两个以上双键且碳链长度为18～22个碳原子的直链脂肪酸。通常分为omega-3和omega-6，在多不饱合脂肪酸分子中，距羧基最远端的双键在倒数第3个碳原子上的称为omega-3；在第六个碳原子上的，则称为omega-6。多不饱和脂肪酸在人体中具有许多特殊的生理功能。其中，DHA和ARA是人体大脑和视神经发育的重要物质，尤其是对提高孕期和婴儿期智力和视力具有重要作用，因此，普遍添加于婴幼儿配方中。此外，EPA和DHA对防治心血管疾病、糖尿病和肿瘤等方面也发挥着积极的功效。目前，深海鱼油、微藻油和微生物油脂是Omega-3和Omega-6系列多不饱和脂肪酸的主要来源。富含多不饱和脂肪酸的油脂中甘三酯是其主要成分，其含量占总脂类的90％以上。甘油三酯是由一分子甘油和三分子脂肪酸通过酯化反应缩合而成的，酰基可位于sn-2和sn-1,3，其化学结构式如下：由于多不饱和脂肪酸来源、脂肪酸种类和含量，碳链长短、双键数目、双键位置的不同而具有不同的理化和流变性质，尤其是多不饱和脂肪酸在甘油三酯中位置分布影响其消化，吸收，代谢及营养价值。富含多不饱和脂肪酸甘三酯的油脂进入人体内，经胰脂酶部分水解生成sn-1,3游离脂肪酸和sn-2单甘酯，与胆盐形成乳糜微粒而被小肠粘膜吸收。然而，两者的代谢途径不同，游离多不饱和脂肪酸一部分被运往肝脏进行β-氧化为机体提供能量，而另一部分游离的长链脂肪酸易与Ca2+和Mg2+形成钙镁皂，引起便秘，同时造成钙质流失，不能发挥其应有的生理功能；而sn-2单甘酯则重新酯化，通过淋巴转运输送至脑部和眼部可以充分发挥其生理功效。因此，准确测定多不饱和脂肪酸在甘三酯中的位置分布是评价其营养价值的重要指标。目前，常用的测定甘三酯中脂肪酸位置分布的方法有胰脂酶水解法和烯丙基溴化镁降解法。胰脂酶水解法是根据胰脂酶的sn-1,3特异性，通过水解甘三酯sn-1,3位上的脂肪酸，对sn-2-单甘酯进行测定，分析脂肪酸的位置分布的一种常用的酶解方法。然而，研究表明胰脂酶无法有效地水解长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)，存在局限性。另一种方法是烯丙基溴化镁降解法，依据格氏降解反应将甘三酯sn-1or3位酯化脂肪酸降解，对生成的sn-1,2orsn-2,3甘二酯进行测定，从而计算出脂肪酸位置分布的一种化学方法。此方法可以避免胰脂酶对脂肪酸的选择性水解，但是，烯丙基溴化镁遇水极易失活，且具有毒性。因此，探索其他适合测定富含LC-PUFA甘三酯的脂肪酸位置分布的方法对有重要的意义。技术实现要素：本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施方式。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或者省略以避免本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。鉴于现有测定多不饱和脂肪酸甘三酯中sn-2位脂肪酸组成的方法、制备方法和应用中存在的问题，提出了本发明。因此，本发明的目的是提供了一种有效测定富含多不饱和脂肪酸油脂的甘三酯中sn-2位脂肪酸组成的方法。为解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：一种测定多不饱和脂肪酸甘三酯中sn-2位脂肪酸组成的方法，其包括，利用脂肪酶Lipozyme435结合超声辅助醇解富含多不饱和脂肪酸甘三酯；将得到的超声辅助酶法醇解产物经高效液相进行分离，得到sn-2单甘油酯并收集；将所得的sn-2单甘油酯进行甲酯化衍生处理，获取衍生物；气相色谱检测所得的衍生产物，测定甘油三酯中sn-2位脂肪酸的组成及含量。作为本发明所述一种测定多不饱和脂肪酸甘三酯中sn-2位脂肪酸组成的方法的优选方案，其中：所述脂肪酶Lipozyme435为利用南极假丝酵母发酵产的sn-1,3特异性脂肪酶。作为本发明所述一种测定多不饱和脂肪酸甘三酯中sn-2位脂肪酸组成的方法的优选方案，其中：所述超声辅助醇解中，超声波功率为200～400W。作为本发明所述一种测定多不饱和脂肪酸甘三酯中sn-2位脂肪酸组成的方法的优选方案，其中：所述高效液相进行分离，其条件为：硅胶柱，柱温：25～45℃；流动相：A柱正己烷:异丙醇＝99:1；B柱异丙醇:正己烷:乙酸＝1:1:0.2；流速0.5～1.5mL/min；进样量50μL。作为本发明所述一种测定多不饱和脂肪酸甘三酯中sn-2位脂肪酸组成的方法的优选方案，其中：在利用脂肪酶Lipozyme435结合超声辅助醇解富含多不饱和脂肪酸甘三酯之后，将得到的超声辅助酶法醇解产物经高效液相进行分离，得到sn-2单甘油酯并收集之前，还包括，先进油酸sn-2单甘油酯标样，记下sn-2单甘油酯的保留时间，作为判定单甘油酯的保留时间以进行高效液相分离。作为本发明所述一种测定多不饱和脂肪酸甘三酯中sn-2位脂肪酸组成的方法的优选方案，其中：所述将所得的sn-2单甘油酯进行甲酯化衍生处理，获取衍生物是将sn-2-甘一酯甲酯化使用氮吹仪将溶剂挥发掉，并向离心管中加入体积比为2:1的正己烷和1.5mol/L的氢氧化钠-甲醇溶液，将混合液混匀1min，5000r/min离心3min，收集上清液得到衍生物。作为本发明所述一种测定多不饱和脂肪酸甘三酯中sn-2位脂肪酸组成的方法的优选方案，其中：所述气相色谱检测所得的衍生产物，其条件为：初始温度80～100℃，保持2-5min，以(5～15)℃/min升至160～200℃，保持2～5min，再以(5～15)℃/min升温至210～230℃；载气为纯度≥99.99％的氮气；载气流速为1.0mL/min；分流比100～50∶1；气化室温度250～300℃；进样体积1.0μL。作为本发明所述一种测定多不饱和脂肪酸甘三酯中sn-2位脂肪酸组成的方法的优选方案，其中：所述测定甘油三酯中sn-2位脂肪酸的组成及含量，其通过脂肪酸甲酯混标的保留时间来鉴定脂肪酸种类，相对含量表示为mol％。本发明首先利用南极假丝酵母源脂肪酶(Lipozyme435)结合超声辅助的醇解反应富含多不饱和脂肪酸甘三酯，该酶在醇解反应中具有很强的sn-1,3特异性，适用于富含多不饱和脂肪酸甘三酯的sn-1,3特异性酶促醇解反应，同时结合超声波辅助提高了醇解反应速率。因此，本发明提供的富含多不饱和脂肪酸甘三酯超声辅助醇解反应及sn-2单甘酯分离和甘三酯sn-2位脂肪酸组成的测定方法，准确度和灵敏度高、重现性好、稳定性强。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：图1为采用本发明测定方法得到的脂肪酸乙酯标品气相图谱图。具体实施方式为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面通过本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。实施例1步骤1、脂肪酶LipozymeRMIM超声辅助醇解寇氏隐甲藻油甘油三酯称取寇氏隐甲藻油0.1g于10mL具塞试管中，加入Lipozyme435脂肪酶10mg，再加入95％乙醇5mL，盖上塞子小心摇动，立即将试管放入超声水浴锅中，功率200W，保持反应15min，取出，加入1mL正己烷，盖上塞子振荡，5000r/min离心5min分离，吸取正己烷层，用0.45μm滤膜过滤到样品瓶中；步骤2、高效液相色谱法分离sn-2单甘油酯利用高效液相-蒸发光检测器色谱(HPLC-ELSD)分离醇解产物中的sn-2-甘一酯和乙酯。HPLC-ELSD分析条件：LiChrospherSi柱，5μm，4.6×250mm，柱温：35℃；流动相：A(正己烷:异丙醇＝99:1):B(异丙醇:正己烷:乙酸＝1:1:0.2)；流速1.0mL/min；进样量50μL；ELSD漂移管温度65℃，空气压力3.0bar。先进一针油酸sn-2单甘油酯标样，记下sn-2单甘油酯的保留时间，再分析处理好的样品。即将到达单甘油酯的保留时间时，打开制备阀门，将洗脱液收集在洗脱液于50mL离心管中；步骤3、sn-2-甘一酯甲酯化使用氮吹仪将溶剂挥发掉，并向离心管中加入1mL正己烷和0.5mL1.5mol/L的氢氧化钠-甲醇溶液，将混合液涡旋混匀1min，5000r/min离心3min，收集上清液；步骤4、气相色谱法测定sn-2位脂肪酸组成及含量吸取上清液于进样瓶中，采用气相色谱-氢火焰离子(GC-FID)检测sn-2位脂肪酸组成，分析条件为：岛津GC-2014气相色谱仪，色谱柱SP-2560，100m×0.25mm，0.20μm毛细管柱，采用程序升温，初始温度80℃，保持4min，以15℃/min升至180℃，保持4min，再以5℃/min升温至215℃；载气为高纯氮气(≥99.99％)；载气流速为1.0mL/min；分流比100～50∶1；气化室温度260℃；FID检测器温度为300℃；进样体积1.0μL。通过脂肪酸甲酯混标的保留时间来鉴定脂肪酸种类，相对含量表示为mol％。实施例2步骤1、脂肪酶LipozymeRMIM超声辅助醇解裂殖壶藻油甘油三酯称取裂殖壶藻油0.2g于10mL具塞试管中，加入Lipozyme435脂肪酶25mg，再加入95％乙醇8mL，盖上塞子小心摇动，立即将试管放入超声水浴锅中，功率300W，保持反应25min，取出，加入1mL正己烷，盖上塞子振荡，5000r/min离心5min分离，吸取正己烷层，用0.45μm滤膜过滤到样品瓶中；步骤2、高效液相色谱法分离sn-2单甘油酯利用高效液相-蒸发光检测器色谱(HPLC-ELSD)分离醇解产物中的sn-2-甘一酯和乙酯。HPLC-ELSD分析条件：LiChrospherSi柱，5μm，4.6×250mm，柱温：35℃；流动相：A(正己烷:异丙醇＝99:1):B(异丙醇:正己烷:乙酸＝1:1:0.2)；流速0.8mL/min；进样量50μL；ELSD漂移管温度65℃，空气压力3.0bar。先进一针油酸sn-2单甘油酯标样，记下sn-2单甘油酯的保留时间，再分析处理好的样品。即将到达单甘油酯的保留时间时，打开制备阀门，将洗脱液收集在洗脱液于50mL离心管中；步骤3、sn-2-甘一酯甲酯化使用氮吹仪将溶剂挥发掉，并向离心管中加入1mL正己烷和0.5mL1.5mol/L的氢氧化钠-甲醇溶液，将混合液涡旋混匀1min，5000r/min离心3min，收集上清液；步骤4、气相色谱法测定sn-2位脂肪酸组成及含量吸取上清液于进样瓶中，采用气相色谱-氢火焰离子(GC-FID)检测sn-2位脂肪酸组成，分析条件为：岛津GC-2014气相色谱仪，色谱柱SP-2560，100m×0.25mm，0.20μm毛细管柱，采用程序升温，初始温度80℃，保持4min，以15℃/min升至180℃，保持4min，再以5℃/min升温至225℃；载气为高纯氮气(≥99.99％)；载气流速为1.0mL/min；分流比100～50∶1；气化室温度260℃；FID检测器温度为300℃；进样体积1.0μL。通过脂肪酸甲酯混标的保留时间来鉴定脂肪酸种类，相对含量表示为mol％。实施例3步骤1、脂肪酶LipozymeRMIM超声辅助醇解吾肯氏壶藻油甘油三酯称取吾肯氏壶藻油0.2g于10mL具塞试管中，加入Lipozyme435脂肪酶20mg，再加入95％乙醇6mL，盖上塞子小心摇动，立即将试管放入超声水浴锅中，功率300W，保持反应25min，取出，加入1mL正己烷，盖上塞子振荡，5000r/min离心5min分离，吸取正己烷层，用0.45μm滤膜过滤到样品瓶中；步骤2、高效液相色谱法分离sn-2单甘油酯利用高效液相-蒸发光检测器色谱(HPLC-ELSD)分离醇解产物中的sn-2-甘一酯和乙酯。HPLC-ELSD分析条件：LiChrospherSi柱，5μm，4.6×250mm，柱温：35℃；流动相：A(正己烷:异丙醇＝99:1):B(异丙醇:正己烷:乙酸＝1:1:0.2)；流速0.8mL/min；进样量50μL；ELSD漂移管温度65℃，空气压力3.0bar。先进一针油酸sn-2单甘油酯标样，记下sn-2单甘油酯的保留时间，再分析处理好的样品。即将到达单甘油酯的保留时间时，打开制备阀门，将洗脱液收集在洗脱液于50mL离心管中；步骤3、sn-2-甘一酯甲酯化使用氮吹仪将溶剂挥发掉，并向离心管中加入1mL正己烷和0.5mL1.5mol/L的氢氧化钠-甲醇溶液，将混合液涡旋混匀1min，5000r/min离心3min，收集上清液；步骤4、气相色谱法测定sn-2位脂肪酸组成及含量吸取上清液于进样瓶中，采用气相色谱-氢火焰离子(GC-FID)检测sn-2位脂肪酸组成，分析条件为：岛津GC-2014气相色谱仪，色谱柱SP-2560，100m×0.25mm，0.20μm毛细管柱，采用程序升温，初始温度80℃，保持4min，以15℃/min升至180℃，保持4min，再以5℃/min升温至225℃；载气为高纯氮气(≥99.99％)；载气流速为1.0mL/min；分流比100～50∶1；气化室温度260℃；FID检测器温度为300℃；进样体积1.0μL。通过脂肪酸甲酯混标的保留时间来鉴定脂肪酸种类，相对含量表示为mol％。实施例4步骤1、脂肪酶LipozymeRMIM超声辅助醇解深海鱼油甘油三酯称取深海鱼油0.2g于10mL具塞试管中，加入Lipozyme435脂肪酶20mg，再加入95％乙醇8mL，盖上塞子小心摇动，立即将试管放入超声水浴锅中，功率360W，保持反应30min，取出，加入1mL正己烷，盖上塞子振荡，5000r/min离心5min分离，吸取正己烷层，用0.45μm滤膜过滤到样品瓶中；步骤2、高效液相色谱法分离sn-2单甘油酯利用高效液相-蒸发光检测器色谱(HPLC-ELSD)分离醇解产物中的sn-2-甘一酯和乙酯。HPLC-ELSD分析条件：LiChrospherSi柱，5μm，4.6×250mm，柱温：35℃；流动相：A(正己烷:异丙醇＝99:1):B(异丙醇:正己烷:乙酸＝1:1:0.2)；流速0.8mL/min；进样量50μL；ELSD漂移管温度65℃，空气压力3.0bar。先进一针油酸sn-2单甘油酯标样，记下sn-2单甘油酯的保留时间，再分析处理好的样品。即将到达单甘油酯的保留时间时，打开制备阀门，将洗脱液收集在洗脱液于50mL离心管中；步骤3、sn-2-甘一酯甲酯化使用氮吹仪将溶剂挥发掉，并向离心管中加入1mL正己烷和0.5mL1.5mol/L的氢氧化钠-甲醇溶液，将混合液涡旋混匀1min，5000r/min离心3min，收集上清液；步骤4、气相色谱法测定sn-2位脂肪酸组成及含量吸取上清液于进样瓶中，采用气相色谱-氢火焰离子(GC-FID)检测sn-2位脂肪酸组成，分析条件为：岛津GC-2014气相色谱仪，色谱柱SP-2560，100m×0.25mm，0.20μm毛细管柱，采用程序升温，初始温度80℃，保持4min，以15℃/min升至180℃，保持4min，再以5℃/min升温至225℃；载气为高纯氮气(≥99.99％)；载气流速为1.0mL/min；分流比100～50∶1；气化室温度260℃；FID检测器温度为260℃；进样体积1.0μL。通过脂肪酸甲酯混标的保留时间来鉴定脂肪酸种类，相对含量表示为mol％。实施例5步骤1、脂肪酶LipozymeRMIM超声辅助醇解高山被孢霉微生物油脂(产EPA和ARA)甘油三酯称取高山被孢霉微生物油脂0.1g于10mL具塞试管中，加入Lipozyme435脂肪酶10mg，再加入95％乙醇5mL，盖上塞子小心摇动，立即将试管放入超声水浴锅中，功率300W，保持反应20min，取出，加入1mL正己烷，盖上塞子振荡，5000r/min离心5min分离，吸取正己烷层，用0.45μm滤膜过滤到样品瓶中；步骤2、高效液相色谱法分离sn-2单甘油酯利用高效液相-蒸发光检测器色谱(HPLC-ELSD)分离醇解产物中的sn-2-甘一酯和乙酯。HPLC-ELSD分析条件：LiChrospherSi柱，5μm，4.6×250mm，柱温：35℃；流动相：A(正己烷:异丙醇＝99:1):B(异丙醇:正己烷:乙酸＝1:1:0.2)；流速0.8mL/min；进样量50μL；ELSD漂移管温度65℃，空气压力3.0bar。先进一针油酸sn-2单甘油酯标样，记下sn-2单甘油酯的保留时间，再分析处理好的样品。即将到达单甘油酯的保留时间时，打开制备阀门，将洗脱液收集在洗脱液于50mL离心管中；步骤3、sn-2-甘一酯甲酯化使用氮吹仪将溶剂挥发掉，并向离心管中加入1mL正己烷和0.5mL1.5mol/L的氢氧化钠-甲醇溶液，将混合液涡旋混匀1min，5000r/min离心3min，收集上清液；步骤4、气相色谱法测定sn-2位脂肪酸组成及含量吸取上清液于进样瓶中，采用气相色谱-氢火焰离子(GC-FID)检测sn-2位脂肪酸组成，分析条件为：岛津GC-2014气相色谱仪，色谱柱SP-2560，100m×0.25mm，0.20μm毛细管柱，采用程序升温，初始温度80℃，保持4min，以15℃/min升至180℃，保持4min，再以5℃/min升温至225℃；载气为高纯氮气(≥99.99％)；载气流速为1.0mL/min；分流比100～50∶1；气化室温度260℃；FID检测器温度为260℃；进样体积1.0μL。通过脂肪酸甲酯混标的保留时间来鉴定脂肪酸种类，相对含量表示为mol％。对比实例：不同脂肪酶醇解鱼油效率对比醇解反应胰脂肪酶催化LipozymeTLIM催化LipozymeRMIM催化反应耗时60min25min20min单甘脂得率％64.56％80.37％86.82％由此可见，本发明酶法醇解是利用脂肪酶的sn-1,3特异性，进行醇解反应测定脂肪酸在甘三酯中位置分布的方法，同时结合超声波技术促进醇解反应效率。当超声波作用在反应体系时，液体内会产生大量的气泡，气泡将随着超声振动而逐渐生长和增大，然后又突然破灭和分裂，分裂后的气泡又连续生长和破灭。这些小气泡急速崩溃时在气泡内产生高温高压，且因气泡周围的液体高速冲入气泡而在气泡附近的液体中产生强烈的局部激波，也形成局部的高温高压。这些结果增加了反应物的活性，促进了原料油醇解反应的发生，从而增强传质过程、加快反应速率。无超声波辅助条件下，酶法醇解反应需要耗时1h，且结果还表明，超声结合酶法醇解法可以降低反应能耗，节省物料。上述说明已经充分揭露了本发明的具体实施方式。需要指出的是，熟悉该领域的技术人员对本发明的具体实施方式所做的任何改动均不脱离本发明的权利要求书的范围。相应地，本发明的权利要求的范围也并不仅仅局限于前述具体实施方式。当前第1页1 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