一种测定血浆中5,6‑二氢‑7,8‑二甲基‑4,5‑二氧‑4‑氢‑吡喃喹啉‑2‑羧酸浓度的方法与流程

本发明属于药物分析技术领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种测定血浆中5，6-二氢-7，8-二甲基-4，5-二氧-4-氢-吡喃喹啉-2-羧酸浓度的方法。

背景技术：

瑞吡司特是抗变态反应药，在体内能迅速脱脂化为活性代谢产物5，6-二氢-7，8-二甲基-4，5-二氧-4-氢-吡喃喹啉-2-羧酸(亦称MY-1250)，通过MY-1250抑制组胺、过敏性慢反应物质、血小板激活因子等化学介质的释放而发挥抗哮喘作用。支气管哮喘患者口服瑞吡司特，能抑制抗原引起的肺功能下降和皮肤过敏反应，临床上主要用于支气管哮喘的预防和治疗。目前关于人体口服瑞吡司特片或颗粒后血浆中活性代谢产物MY-1250的测定方法没有文献报道。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提供了一种测定血浆中5，6-二氢-7，8-二甲基-4，5-二氧-4-氢-吡喃喹啉-2-羧酸浓度的方法。

本发明采用的技术方案是：

一种测定血浆中5，6-二氢-7，8-二甲基-4，5-二氧-4-氢-吡喃喹啉-2-羧酸浓度的方法，其特征在于，血浆样品经预处理后经液质联用系统检测其浓度，具体方法包括如下步骤：

(1)血浆样品预处理：取血浆样品，加入盐酸溶液酸化，加入内标左乙拉西坦溶液，加入甲醇沉淀蛋白，高速离心，吸取上清液，加入去离子水，混匀后进样；

(2)将步骤(1)预处理后的血浆样品进行液相色谱分离；

色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse C18，4.6×100mm，3.5μm；流动相：甲醇和水相，水相为6mmoL·L^-1醋酸铵水溶液，水相中 按照体积比含有0.02％氨水；

梯度洗脱：0-8.5min，水相与甲醇的体积比为75∶25；8.6-9.6min，水相与甲醇的体积比为5∶95；9.7-13.0min，水相与甲醇的体积比为75∶25；柱温为35℃；流速为800μL·min^-1；进样量：50μL；

(3)质谱测定：

条件包括：

离子源：电喷雾离子化电离源ESI；离子检测方式：多反应监测；离子极性：正离子；离子源电压IS：4500V；离子源温度TEM：750℃；碰撞气CAD：8L·min^-1；气帘气CUR：35L·min^-1；离子源Gas1：65L·min^-1；离子源Gas2：70L·min^-1；检测对象的离子选择通道：MY-1250，[M+H]+，m/z 286.1/198.2，DP106，EP10，CE47，CXP15；内标左乙拉西坦，[M+H]+，m/z 171.3/126.2，DP27，EP6，CE40，CXP10；

(4)计算：采用内标法，以5，6-二氢-7，8-二甲基-4，5-二氧-4-氢-吡喃喹啉-2-羧酸和内标左乙拉西坦的峰面积比值代入标准曲线方程计算5，6-二氢-7，8-二甲基-4，5-二氧-4-氢-吡喃喹啉-2-羧酸浓度。

优选的，步骤(1)中，于1.5mL塑料离心管中精密加入血浆样品600μL，精密加入12μL盐酸溶液(5mol·L^-1)，精密吸取酸化后的受试者血浆样本204μL，精密加入内标400ng·mL^-1左乙拉西坦溶液50μL，旋涡10s，加入600μL甲醇沉淀蛋白，涡旋1min，于15000rpm、4℃离心5min。吸取400μL上清液至进样瓶中，加入800μL水，涡旋混匀，进样测定。

优选的，所述的血浆为口服瑞吡司特片或颗粒后的血浆。

优选的，所述血浆为人或动物的血浆。

需要指出的是：其中，所述的血浆为口服瑞吡司特片或颗粒后的血浆。本发明方法重点是保护口服瑞吡司特片或颗粒后，血浆内MY-1250的检测方法，从而为研究MY-1250的体内代谢奠定基础。

有益效果：本发明方法与现有技术相比，具有如下优势：

(1)预处理方法简便：血浆样品酸化后，有机溶剂沉淀蛋白，适用 于常规测定。

(2)专属性强：采用Agilent ZORBAX Eclipse C18(4.6×100mm，3.5μm)色谱柱作为固定相；甲醇和水相(6mmoL·L^-1醋酸铵水溶液，含0.02％氨水(％))作为流动相，梯度洗脱：0-8.5min，水相∶甲醇(75∶25)；8.6-9.6min，水相∶甲醇(5∶95)；9.7-13.0min，水相∶甲醇(75∶25)；MY-1250保留时间为7.9min左右；内标左乙拉西坦保留时间为3.05min左右，13分钟完成测定，内源性物质不干扰二者的测定。

(3)灵敏度高：血浆最低定量限为2ng·mL^-1。

(4)本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为MY-1250的临床血药物浓度测定提供依据，服务于新药研究开发及临床应用。本方法的血浆标准曲线线性范围为2～1500ng·mL^-1，批内和批间精密度RSD均小于10％。

附图说明

图1为质谱图。

其中，A为人空白血浆的质谱图，B为人空白血浆加入标准品后的质谱图，C为人空腹口服瑞吡司特片150mg后2h血浆样品的质谱图。

注：图中MY-1250[M+H]+，m/z 286.1/198.2，保留时间为7.9min左右；内标I.S.[M+H]+，m/z 171.3/126.2，保留时间为3.05min左右。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

实施例1：人血浆中MY-1250浓度的测定。

一、实验材料与仪器

MY-1250对照品：由河南辅仁堂制药有限公司提供，批号： 20140501D；左乙拉西坦对照品：由浙江华海药业股份有限公司提供，批号：201308-2；试验用水：超纯水；甲醇：色谱纯(Merck Company)；氨水、醋酸铵：分析纯(国药集团化学试剂有限公司)；盐酸：分析纯(上海凌峰化学试剂有限公司)。

API 4000 LC/MS/MS联用仪(美国应用生物系统公司)，色谱工作站：Analyst 1.6；梅特勒XS 105DU电子天平(瑞士梅特勒公司)；Eppendorf Centrifuge 5424R高速低温离心机(德国Eppendorf公司)；KDC-2042型低速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；Millipore Drict-Q5超纯水机(法国Millipore公司)。

二、液质条件

1.液相色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse C18，4.6×100mm，3.5μm；流动相：甲醇和水相，水相为6mmoL·L^-1醋酸铵水溶液，水相中按照体积比含有0.02％氨水；

梯度洗脱：0-8.5min，水相与甲醇的体积比为75∶25；8.6-9.6min，水相与甲醇的体积比为5∶95；9.7-13.0min，水相与甲醇的体积比为75∶25；柱温为35℃；流速为800μL·min^-1；进样量：50μL；

2.质谱条件

离子源：电喷雾离子化电离源ESI；离子检测方式：多反应监测(MRM)；离子极性：正离子；离子源电压IS：4500V；离子源温度TEM：750℃；碰撞气CAD：8L·min^-1；气帘气CUR：35L·min^-1；离子源Gas1：65L·min^-1；离子源Gas2：70L·min^-1；检测对象的离子选择通道：MY-1250，[M+H]+，m/z 286.1/198.2，DP106，EP10，CE47，CXP15；内标左乙拉西坦，[M+H]+，m/z 171.3/126.2，DP27，EP6，CE40，CXP1o。

三、实验过程：

1.MY-1250标准溶液的配制：

称取适量MY-1250对照品(相当于含10mg MY-1250)，置于100 mL容量瓶中，先加入少量甲醇溶解，再加入1moL·L^-1NH4AC溶液4mL，混匀溶解后，用甲醇定容至刻度，混匀得到含0.1mg·mL^-1MY-1250标准曲线储备液，再以甲醇依次稀释，配成浓度分别为0.04、0.1、0.2、0.6、2、6、20、30μg·mL^-1的MY-1250标准工作液。

2.人血浆样品的处理：

5名健康男性受试者空腹服用瑞吡司特片150mg，用250mL温开水送服；于给药后2h采集外周静脉血3ml，注入肝素管内，离心(4000r·min^-1，5min)，吸取受试者血浆样本600μL，加入12μL盐酸溶液(5mol·L^-1)，涡旋混匀后，吸取预处理后的受试者血浆样本204μL，并加入50μL内标工作液，涡旋混匀后加入600μL甲醇沉淀蛋白，涡旋1min，于15000rpm、4℃离心5min。吸取400μL上清液至进样瓶中，加入800μL水，涡旋混匀，吸取混匀液50μL进样(见图1-C)，计算MY-1250和内标峰面积的比值f1，代入标准曲线计算浓度。

3.专属性：

取没有给予过瑞吡司特片的人空白血浆200μL于1.5mL塑料离心管中，加入50μL甲醇和4μL盐酸溶液(5mol·L^-1)，涡旋混匀后加入610μL甲醇沉淀蛋白，涡旋1min，于15000rpm、4℃离心5min。吸取400μL上清液至进样瓶中，加入800μL水，涡旋混匀，吸取混匀液50μL进样(见图1-A)。

取1.5mL塑料离心管精密加入MY-1250标准溶液(1.6μg·mL^-1)10μL，加入空白血浆200μL，涡旋混匀，加入4μL盐酸溶液(5mol·L^-1)和50μL 0.4μg·mL^-1内标工作液，涡旋混匀后加入600μL甲醇沉淀蛋白，涡旋1min，于15000rpm、4℃离心5min。吸取400μL上清液至进样瓶中，加入800μL水，涡旋混匀(见图1-B)。

结果显示，在本实验所采用的LC-MS-MS条件下，血浆样品无杂峰对检测组分造成干扰，MY-1250保留时间在7.9min左右，内标左乙拉西坦保留时间在3.05min左右。MY-1250和内标互不干扰，峰形良好，基线平稳。

4.线性试验

人血浆标准曲线：分别吸取10μL MY-1250的标准曲线工作液至1.5mL塑料离心管中，并加入空白血浆200μL，涡旋混匀，制备成相当于含MY-1250浓度为2、5、10、30、100、300、1000、1500ng·mL^-1的标准曲线血浆样本。按“血浆样品预处理”项下操作。计算MY-1250峰面积As和内标峰面积Ai的比值f(f＝As/Ai)，以峰面积比值f对血药浓度C作回归计算。以平均比值f对血药浓度C作回归计算，得回归方程：f＝0.00824×C+0.000784(r＝0.9987，权重系数w＝1/C＊C)，MY-1250血浆浓度在2～1500ng·mL^-1范围内线性关系良好。最低定量限为2ng·mL^-1。

5.准确度和精密度

按照人血浆标准曲线方法配制含MY-1250浓度为4、80、1200ng·mL^-1的低、中、高的血浆样品，按“血浆样品预处理”处理方法分别处理。连续做3批，每批每个浓度各做6份样品，计算MY-1250峰面积As和内标峰面积Ai的比值f，代入每批的血浆标准曲线中求得MY-1250实测浓度，由实测浓度计算批内、批间精密度和相对标准偏差(RSD)，实测浓度与加入浓度的比值即为准确度。结果显示，批内和批间精密度RSD均小于10％，准确度符合要求。

6.测定结果

上述给予过瑞吡司特片150mg后2h的5名健康男性受试者血浆中MY-1250含量分别为154.3、84.24、123.9、257.5、30.67ng·mL^-1。

实施例2：人血浆中MY-1250浓度的测定

参照实施例1，5名健康女性受试者空腹服用瑞吡司特片150mg，用250mL温开水送服；于给药后4h采集外周静脉血3mL，注入肝素管内，离心(4000r·min^-1，5min)，吸取受试者血浆样本600μL，加入12μL盐酸溶液(5mol·L^-1)，涡旋混匀后，制备血浆。含药血浆样品处理及测定条件相同，结果空腹口服瑞吡司特片150mg后4h的5名健康女性受试者血浆中MY-1250含量分别为50.24、52.71、41.2、 26.12、43.45ng·mL^-1。

实施例3：人血浆中MY-1250浓度的测定

参照实施例1，5名健康男性受试者空腹服用瑞吡司特颗粒50mg/袋×3袋，用250mL温开水冲服；于给药后2h采集外周静脉血3mL，注入肝素管内，离心(4000r·min^-1，5min)，吸取受试者血浆样本600μL，加入12μL盐酸溶液(5mol·L^-1)，涡旋混匀后，制备血浆。含药血浆样品处理及测定条件相同，结果空腹口服瑞吡司特颗粒150mg后2h的5名健康男性受试者血浆中MY-1250含量分别为49.26、107.6、56.76、100.7、124.5ng·mL^-1。

对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。