一种血清的制备方法与流程

本发明涉及体外诊断医学检验领域。具体地说，本发明涉及一种血清的制备方法。

背景技术：

血清是血液凝固析出的淡黄色透明液体。如将血液自血管内抽出，放入试管中，不加抗凝剂，则凝血反应被激活，血液迅速凝固，形成胶冻。凝血块收缩，其周围所析出之淡黄色透明液体即为血清，也可于凝血后经离心取得。在凝血过程中，纤维蛋白原转变成纤维蛋白块，所以血清中无纤维蛋白原，这一点是与血浆最大的区别。而在凝血反应中，血小板释放出许多物质，各凝血因子也都发生了变化。这些成分都留在血清中并继续发生变化，如凝血酶原变成凝血酶，并随血清存放时间逐渐减少以至消失。这些也都是与血浆区别之处。但大量未参加凝血反应的物质则与血浆基本相同。为避免抗凝剂的干扰，血液中许多化学成分的分析，都以血清为样品。

血浆的各种化学成分常在一定范围内不断地变动，其中以葡萄糖、蛋白质、脂肪和激素等的浓度最易受营养状况和机体活动情况的影响，而无机盐浓度的变动范围较小。血清与血浆的区别，主要在于血清不含纤维蛋白原，纤维蛋白原能转换成纤维蛋白，具有凝血作用。

在体外诊断试剂行业，血清和血浆是体外诊断试剂生产的初级及重要的原料之一，常用于校准品、稀释液的配制以及内部参考品的建立。其中血清由于其清澈杂质较少，干扰较小等因素，是两者中的首选。但血清的获取量较少，无法满足大体积的需求。而血浆的供应量虽大，但是干扰性较强，且大量的纤维蛋白容易有絮状沉淀，会影响产品质量。此外，本领域制备血清的方法往往存在得率低、操作繁琐、仍存在纤维蛋白絮状沉淀等缺点。

因此，本领域急需操作简便，得率高，将血浆转化为血清的制备方法，所得到的血清中纤维蛋白充分去除，并且对待测物影响较小。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种血清制备方法，该方法制备的血清的得率高，制备工艺简单，易于重复，且对于待测物无影响，测值回收率好。

本发明的另一目的在于提供本发明方法所制得血清以及包含这种血清的检测试剂盒。

在第一方面，本发明提供一种血清的制备方法，所述方法包括在血浆中添加经氯化钙激活的凝血酶溶液，从而制得血清。

在具体的实施方式中，所述方法包括以下步骤：

(1)将冻存血浆平衡至室温，过滤；

(2)孵育后，在血浆中添加经氯化钙激活的凝血酶溶液，混匀；

(3)将处理后的血浆平衡至室温，然后冻存；

(4)取出再次平衡至室温，离心，过滤后，制得血清。

在优选的实施方式中，步骤(3)中将处理后的血浆平衡至室温，然后在-15℃以下保存。

在优选的实施方式中，步骤(1)中的过滤是将平衡至室温的血浆经医用纱布过滤，收集滤液。

在具体的实施方式中，步骤(2)所述的孵育是在37℃孵育15～60分钟；优选地，孵育为30分钟。

在具体的实施方式中，所述凝血酶溶液的浓度为50～200U/mL；优选地，浓度为75-125U/mL；最优选地，浓度为100U/mL。

在具体的实施方式中，所述经氯化钙激活的凝血酶溶液是将1000U/mL凝血酶溶液和1M CaCl₂溶液按照1:4～1:19的比例混合，反应30分钟后制得；优选地，将1000U/mL凝血酶溶液和1M CaCl₂溶液按照1:9的比例混合。

在具体的实施方式中，步骤(3)所述的处理后的血浆平衡至室温的时间为60～180分钟；优选地，平衡时间为120分钟。

在具体的实施方式中，步骤(4)中离心转速为4000rpm，过滤孔径为0.8μm。

在优选的实施方式中，步骤(4)还包括在制得的血清中添加质量分数为0.1％的Proclin 300。

在优选的实施方式中，所述制备方法制得的血清的得率达到80％以上，优选85％以上，更优选90％以上；总蛋白回收率达到93％以上，优选95％以上，更优选97％以上。

在第二方面，本发明提供一种血清，所述血清通过本发明第一方面所述的制备方法制备得到。

在优选的实施方式中，所制备的血清的得率达到87％以上，优选90％以上，更优选93％以上；总蛋白回收率达到93％以上，优选95％以上，更优选97％以上。

在第三方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒装有本发明第二方面所述的血清或本发明第一方面所述的制备方法制备的血清。

在优选的实施方式中，所述血清用作检测试剂盒中的校准品、稀释液、质控品或内部参考品。

在第四方面，本发明提供本发明第一方面所述的制备方法制备的血清或本发明第二方面所述的血清在制备检测试剂盒中的用途。

在优选的实施方式中，所述血清用作检测试剂盒中的校准品、稀释液、质控品或内部参考品。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了通过本发明方法从不同血浆制备血清后，待测物的回收率、总蛋白浓度的比较。

具体实施方式

在研发实践中，本发明人发现直接采用血浆作为体外诊断试剂的校准品、稀释液及参考品时，其稳定性不佳，且由于血浆中纤维蛋白的影响，往往形成絮状沉淀，造成质量问题；此外，直接采用血浆，其抗凝剂对待测物的测定形成干扰。而现有的制备血清的方法存在得率低、操作繁琐、需要反复冻融等缺点，并且制得的血清中仍有纤维蛋白絮状沉淀存在。发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现，在血浆中添加经氯化钙激活的凝血酶溶液并且控制凝血酶的用量，所制备的血清的得率较高，作为体外诊断试剂校准品、稀释液及参考品对后续检测的干扰小，测值回收率好，并且该制备工艺简单，易于重复，具有较大的工艺放大及推广前景，能广泛应用于体外诊断领域。在此基础上完成了本发明。

本发明的血清的制备方法以及制备得到的血清

基于以上发现，本发明首先提供一种血清的制备方法，所述方法通过在血浆中添加经氯化钙激活的凝血酶溶液而制得血清。

基于本发明的教导以及本领域的常规技术手段，本领域技术人员可以想到本发明的血清制备方法的各种具体实现方式。例如，可以将冻存血浆平衡至室温，过滤，孵育后，在血浆中添加经氯化钙激活的凝血酶溶液，混匀；将处理后的血浆平衡至室温，冻存；取出再次平衡至室温，离心，过滤后，即制得所述血清。

在具体的实施方式中，本发明的血清制备方法包括以下步骤：

(1)将冻存血浆平衡至室温，过滤；

(2)孵育后，在血浆中添加经氯化钙激活的凝血酶溶液，混匀；

(3)将处理后的血浆平衡至室温，然后冻存，例如在；

(4)取出再次平衡至室温，离心，过滤后，制得血清。

本领域技术人员可以基于本发明的教导以及本领域的常规要求确定本发明方法的一些细节。例如，步骤(1)的过滤是将平衡至室温的血浆经医用纱布过滤，收集滤液；步骤(2)所述的孵育是在37℃孵育15～60分钟；优选地，孵育为30分钟；步骤(3)中，可以将处理后的血浆平衡至室温，然后在-15℃以下保存；

本发明人发现，凝血酶溶液的用量对于通过本发明方法获得高质量的血清也有影响。在具体的实施方式中，所述凝血酶溶液的浓度为50～200U/mL；优选地，浓度为75-125U/mL；最优选地，浓度为100U/mL。在优选的实施方式中，所述经氯化钙激活的凝血酶溶液是将1000U/mL凝血酶溶液和1M CaCl₂溶液按照1:4～1:19的比例混合，反应30分钟后制得；优选地，将1000U/mL凝血酶溶液和1M CaCl₂溶液按照1:9的比例混合。

在优选的实施方式中，所述处理后的血浆平衡至室温的时间为60～180分钟；更优选，平衡时间为120分钟。

在优选的实施方式中，所述步骤(4)中离心转速为4000rpm，过滤孔径为0.8μm。在另一优选的实施方式中，所述步骤(4)还包括在制得的血清中添加质量分数为0.1％的Proclin 300。在另一优选的实施方式中，所述步骤(4)还包括在制得血清后将其在2～8℃保存。

相比于现有技术，本发明的血清制备方法能够制备得到具备优异特性的血清，例如，得率高，总蛋白回收率高等等。而具有如此优异特性的血清是现有技术无法获得的。在具体的实施方式中，本发明制备方法制得的血清的得率达到80％以上，优选85％以上，更优选90％以上；总蛋白回收率达到93％以上，优选95％以上，更优选97％以上。

本领域技术人员公知，血清可以在试剂盒中用作校准品、稀释液、质控品或内部参考品。因此，本发明制备方法制得的血清的可以用于各种检测试剂盒中，从而提高这些检测试剂盒的性能。

本发明的优点

1)本发明制备的血清的得率高，一般可达到80％以上；

2)本发明制备的血清，对待测物的测定无影响，且重复性好；

3)本发明制备的血清经反复冻融后，依旧维持澄清透明，无絮状沉淀析出；

4)本发明的血清制备方法的工艺重复性好，操作简单。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例

材料

血浆来自通化市红十字会中心血站

凝血酶购自于Sigma，

二水氯化钙购自于国药试剂，

双缩脲试剂盒购自于Sigma，

Proclin 300购自于Amersco。

实施例1.血清的制备

1)将冻存血浆200ml放置于室温，使其完全融化，平衡至室温；

2)将200ml血浆通过8层医用纱布，记录过滤体积V₁；

3)将14.7g的二水氯化钙溶于纯化水中，制得1M CaCl₂溶液；

4)在0.5mL 1000U/mL的凝血酶溶液中加入4.5mL 1M CaCl₂溶液，混匀，室温反应30分钟，制得激活凝血酶溶液；

5)在V₁mL的血浆中按照1:100的比例加入0.01V₁mL激活凝血酶溶液，混匀，37℃孵育30分钟；

6)将血浆置于室温平衡120分钟；

7)将平衡后的血浆置于-15℃以下保存至少48小时；

8)将血浆置于室温平衡4小时，4000rpm离心30分钟，取上清；

9)将上清液过0.8μm滤膜过滤，取滤液，过滤后的体积为V₂；

10)按照0.1％的体积比加入Proclin 300，混匀；

11)置于2～8℃保存，制得血清。

实施例2.所制得血清的物理性状比较

利用实施例1所得的血清，对外观进行观察，同时通过双缩脲试剂盒测定制备前后的总蛋白含量，结果如下表所示：

从上表可以看出，本发明制得的血清，能够去除纤维蛋白，使得液体澄清透明，无沉淀，其得率也达到了91.50％，液体损失较小。通过处理前后血浆和血清的蛋白含量的测定，其总蛋白含量的分别为75.68mg/mL和71.44mg/mL，两者差异不大，其基本的物理性状较为理想。

实施例3.血清制备工艺的重复性

利用实施例1所述的方法，对10份不同的血浆进行处理，考察得率情况。同时通过双缩脲试剂盒测定制备前后的总蛋白含量，乙型肝炎病毒表面抗体检测试剂盒测定anti-HBs，评价其处理前后总蛋白和待测物回收率，结果如下表所示：

从上表可以看出，通过比较处理前后的10份不同血浆和血清的得率为87.63％～96.34％，总蛋白回收率为92.99％～97.93％，anti-HBs测值回收率93.00％～100.97％。从结果看，血清对于总蛋白含量及anti-HBs的测值无明显影响，且制备平均得率达到了90％，效果良好。

实施例4.含有本发明血清的乙型肝炎病毒表面抗体试剂盒性能结果

1)最低检测限：本试剂盒的最低检测限不高于2mIU/mL。

测定空白样本20次，计算20次测定结果均值(M)和标准差(SD)，M+2SD对应的浓度即为试剂盒的最低检测限。

2)准确度：本试剂盒的回收率在85％～115％之间。

3)重复性：本试剂盒的相对变异系数(CV)≤8％。

4)线性范围：本试剂盒的线性范围为2～1000mIU/mL。

将接近线性范围上限的高值样本进行系列稀释，计算实测值与理论稀释度之间的线性相关系数r，结果应大于或等于0.9900。

5)批间差：本试剂盒批间的相对变异系数(CV)≤15％。

6)稳定性：本试剂盒2～8℃保存12个月，试剂盒的性能仍稳定。

实施例5.含有本发明血清的超敏感C-反应蛋白定量测定试剂盒(免疫比浊法)性能结果

1)试剂空白：波长340nm左右处，试剂空白吸光度应≤1.8A。

2)准确度：测定结果在所使用质控品的允许范围内。

3)精密度：：批内变异系数cv≤10％；批间相对极差≤15％。

4)线性范围：在样本浓度1.0-10mg/l范围内，相关系数r≥0.990。在样本浓度1.0-5.0mg/l范围内，线性绝对偏差应不超过±0.75mg/l。在样本浓度5-10mg/l范围内，线性相对偏差应不超过±15％。

5)分析灵敏度：测试浓度为(2.0±0.5)mg/L的样本，将测试结果换算成浓度为2.0mg/L的样本时，吸光度差值(△A)应≥0.01A。

6)校准品准确度：用试剂盒内待检校准品及上级工作校准品分别校准试剂，然后测定质控品，两者对同一质控品的测定结果之间的相对偏差应在±15％的范围内。

7)校准品均一性：CV瓶间≤15％。

8)稳定性：校准品在2℃-8℃遮光储存至有效期末，试剂盒的性能仍稳定。

实施例6.含有本发明血清的心肌质控品性能结果

1)外观：块状冻干品，复溶后为澄明溶液。

2)准确度：质控品的检测值在各项目的允许范围内。

3)均一性：质控品瓶间CV≤5％。

4)复溶稳定性：质控品复溶后放置于2℃～8℃7天和-20℃1个月，质控品靶值仍然稳定。

5)效期稳定性：质控品2～8℃保存12个月，质控品靶值仍然稳定。

6)生物安全性：检测质控品中HBsAg、抗HIV1/2，抗HCV，抗TP，结果为阴性。

对比例1.

本发明人根据现有技术中的常规方法，在血浆中直接加入氯化钙来制得血清。对所制得的血清重复以上实施例2-3，结果如下表所示。

从以上结果可以看出，对比例的得率、测值回收率和总蛋白回收率均比实施例低。因此，现有技术中的常规方法无法制得本发明的高质量血清。

对比例2.

本发明人重复了实施例1，区别在于将凝血酶溶液直接加入血浆，然后再加入氯化钙溶液。对所制得的血清重复以上实施例2-3，结果如下表所示。

从以上结果可以看出，对比例的得率、测值回收率和总蛋白回收率均比实施例低。

综上所述，以上对比例证明，现有技术中直接向血浆中加入氯化钙无法制得高质量的血清；即便增加凝血酶的用量，依旧无法制得高质量的血清。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。