一种基于荧光免疫层析技术的定量检测计算方法与流程

本发明涉及免疫层析检测领域，具体涉及一种基于荧光免疫层析技术的定量检测计算方法。

背景技术：

随着社会运行的节奏越来越快，无论是疾病疫情的现场检测、食品中有毒有害物质的现场快速检测，还是急诊及ICU的紧急情况抢救患者的临床检测、灾难医学的紧急情况检测抢救中，以及事故现场的酒精、药物浓度检测中；都急需一种检测快速、携带便捷、操作方便的现场快速检测技术。但传统的快速检测技术由于普遍存在可测量范围窄、不稳定等缺陷，无法很好的满足定量快速检测的要求。

现场快速检测（Point Of Care Testing, POCT）是体外诊断（IVD）的一个新兴细分行业，是在采样现场即刻进行分析，省去标本在实验室检验师的复杂处理程序，快速得到检验结果的一种新方法。POCT以“患者为中心”，是实现对病人个性化服务的最佳载体。其凭借简单、快捷和低成本等优势，在临床获得广泛应用，是IVD行业重要的发展方向和增长最快的领域。POCT相比传统的检验医学，可以省去诸多标本预处理、样本送检、繁琐的设备检测、数据处理及传输流程等步骤，直接快速的得到可靠的结果，为医生的进一步施救赢得宝贵的时间。

其中，荧光免疫层析检测技术是POCT的一种新兴检测技术。荧光免疫层析检测系统硬件部分主要由一个光电探测器和检测板组成。检测板使用的是层析法，将一定浓度的待测物样本滴加到样本垫上，样本溶液通过层析作用向前移动，溶解检测线上固化的标记物后与之发生特异性反应形成免疫复合物，复合物在检测线和控制线上富集，附着的反应物含量与待测物浓度成正比；其中，标记物在一定波长的激发光照射下，会产生一定波长的荧光。光电探测器检测到该荧光的光信号，转换成对应的数据信息，并通过相应的软件算法处理，得到待测物对应的光强特征值（检测线/控制线的值）；最后，通过光强特征值与待测物浓度标准曲线，可检测待测物的浓度。

但是，荧光分析属于微弱信号的检测范畴，一般仪器设计中，获取信号的方法以提高仪器的增益或放大倍数为主，并且之后的算法处理中没有针对性的过滤各种噪声、干扰。但对荧光定量检测仪而言，检测到的信号可能不是来自于待检测的荧光物质，而是来自试剂条背景荧光、外界杂散光的干扰；另外，电子电路噪声干扰、机械振动干扰、试剂条生产工艺的干扰等都会影响到荧光强度的测量。荧光免疫试剂条检测线很窄，仅为一条细线；当待测物浓度不高时，试剂条检测线的荧光信号很弱，由于背景荧光、电路噪声、以及外界各种干扰都会降低输入信号的信噪比。这些信号会与有用信号混合，甚至会淹没所需的荧光信号，降低仪器的灵敏度。现有的荧光免疫层析技术之后的算法处理中一般没有针对性的对噪声干扰做过滤操作，导致荧光免疫层析检测的误差较大，检测值的可信度减少，进而降低了荧光免疫层析技术的应用面。

因此，本方案在这种背景下，提出了一整套较为完善的技术方案，来实现在检测计算待测物浓度的过程中，还能够过滤掉各种噪声、信号干扰，提供较为精确的检测结果。

技术实现要素：

本发明的目的是解决上述现有技术的不足，提供了一种在采样现场即刻进行分析，省去标本在实验室检验师的复杂处理程序，快速得到检测结果的新方案。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种基于荧光免疫层析技术的定量检测计算方法，包括以下步骤：将滴加有待测样本溶液的荧光免疫试纸条插入荧光免疫分析仪中，依次经过LED光源照射、滤光片滤光处理、光电探测器检测、电信号处理、AD转换处理、滤波算法处理、基线拟合、寻峰处理、计算T/C面积比值、计算浓度的过程，从而通过计算的浓度结果进行判断。

优选地，所述滤波算法处理采取滑动窗口平均滤波算法。

优选地，所述基线拟合选用最小二乘法拟合。

优选地，所述计算T/C面积比值是在基线拟合后的T、C峰左右各M个点范围内求面积，再计算T/C面积比值。

优选地，包括以下步骤：

（1）在荧光免疫试剂条上滴加待测样本溶液，静置一段时间后，插入荧光免疫分析仪中进行检测；

（2）针对试剂条中荧光标记物的光谱，选择合适的LED光源，启动LED光源照射试剂条；

（3）针对荧光标记物的激发光波长和荧光波长，选择对应的激发光滤光片和荧光滤光片，滤除背景光、杂散光的干扰；

（4）利用光电探测器将检测到的荧光信号转换成电信号；

（5）对光电探测器获取的微弱电流信号进一步处理，先通过I/V转换电路将电流信号转化为电压信号，再通过带通滤波放大电路进行放大，增大信噪比；然后通过检波电路以获取高精度的放大后的电信号；

（6）通过高精度的AD转换器，将采集处理放大后的电信号，即模拟信号转化成数字信号，并把每个检测点的数字信号按照顺序拼成一条采样曲线，即原始检测数据；

（7）将原始检测数据采取滑动窗口平均滤波算法过滤各种噪声和干扰，衰减高频信号，去除大部分的毛刺信号；

（8）针对滤波后的数据，选用最小二乘法拟合滤除基线漂移；

（9）在基线拟合后的曲线上进行寻峰处理，即确定出T峰（对应检测线）和C峰（对应控制线）的位置；

（10）在基线拟合后的T、C峰左右各M个点范围内求面积，计算T/C面积比值，得到光强特征值；

（11）根据T/C光强特征值与浓度标准曲线，计算出T/C比值对应的样本浓度值；

（12）对计算的浓度结果进行判断。

优选地，所述的光电探测器为光电二极管。

本发明的有益效果在于：

本发明中，LED光源的内在特征有利于荧光免疫分析仪的便携化、稳定、长时间测量；并且LED光源的耗电非常低、热量低、寿命长。针对试剂条中荧光标记物的光谱，选择合适的LED光源，照射试剂条时能够获取较高的荧光强度，减少温度变化，进而降低温度对检测结果的干扰。

本发明针对荧光标记物的激发光波长和荧光波长，选择对应的激发光滤光片和荧光滤光片，来获取理想波长的激发光和荧光；能够有效地滤除背景光、杂散光的干扰。

本发明选择光电二极管作为光电探测器，其成本低、响应快、使用寿命更长；并且具有高稳定性、低暗电流、高灵敏度等优点。LED光源、滤光片、光电二极管、以及光路结构组成的光学系统被密封在光学暗箱中，可降低杂散光的干扰。

本发明在将模拟信号转化成数字信号的处理过程中，采用高精度的AD转换器，并且具有转化速度快、功耗低的优点。

本发明针对原始检测数据中的噪声大都是随机信号的特点，采取滑动窗口平均滤波算法，可以很好的衰减高频信号，对数据起到平滑作用，去除大部分的毛刺信号，可以在最大限度抑制噪声的同时保存有用信号，从而提高信噪比。

本发明选用最小二乘法拟合来滤除基线漂移，可以有效减少噪声干扰以及基线漂移对分析结果造成的影响。

本发明未选择T、C峰的光强值作为待测物浓度的参考点，而是为了进一步消除随机噪声，选择在基线拟合后的T、C峰左右各M个点范围内求面积的方法，得到光强特征值；其中，M值的大小可以根据试剂条的实际情况设置。采用在同一状态下两者的比值----T/C面积比值作为最终结果判断，进一步减少了噪声干扰，保证了测量精度。

本发明中，浓度标准曲线是根据试剂条在研发生产环节中测量出的大量实验数据，采用曲线拟合算法、基于这些实验数据计算出一条标准曲线。

本方法基于荧光免疫层析技术，提出设计了一整套完善的快速定量检测方案；实现了在检测计算待测物浓度的过程中，还能够过滤掉各种噪声、信号干扰，提供较为精确的检测结果。该方案具有高精度、高稳定性、低功耗的优点，很好的满足了用户快速定量检测的需求。

附图说明

图1为本发明检测方法的流程示意图；

图2为本发明具体实施方式中原始曲线图；

图3为本发明具体实施方式中滑动窗口平均滤波后的曲线图；

图4为本发明具体实施方式中基线拟合后的曲线图；

图5为本发明具体实施方式中寻峰后的曲线图；

图6为本发明具体实施方式中计算峰面积示意图；

图7为本发明具体实施方式中试剂条对应的标准曲线图。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述，以下实施例仅是对本发明进行说明而非对其加以限定。

本发明所述的一种基于荧光免疫层析技术的定量检测计算方法，如图1所示，包括如下步骤：

1、试剂条加样

在荧光免疫试剂条上滴至少40微升的待测样本溶液，静置15分钟后，插入仪器中开始检测。

2、仪器内的硬件处理流程如下：

（1）LED光源照射试剂条上的试纸窗口，试剂条上的荧光物质的激发波长主要集中在365nm左右，受激发后荧光的波长集中在613nm左右。因此，本方案选用365nm波长的LED光源。开始检测试剂条的时候，LED光源首先向试剂条的试纸窗口照射激发光。LED光源的内在特征有利于荧光免疫分析仪的便携化、稳定、长时间测量；并且LED光源的耗电非常低、热量低、寿命长。针对试剂条中荧光标记物的光谱，选择合适的LED光源，照射试剂条时能够获取较高的荧光强度，减少温度变化，进而降低温度对检测结果的干扰。

（2）滤光处理：针对荧光标记物的激发光波长和荧光波长，选择对应的激发光滤光片和荧光滤光片，来获取理想波长的激发光和荧光。LED光源发出光后，首先通过在LED光源前端的激发光滤光片（通过光波长是365±20nm），过滤掉可能存在的其他波长的激发光；激发光照射到试剂条，试纸上的荧光物质受激发产生荧光；荧光通过在光电探测器的前端的荧光滤光片（通过光波长是610±20nm），有效地滤除背景光、杂散光的干扰；以保证后续的光电探测器能够获取有用的荧光信号。

（3）光电探测器检测：本方案选择光电二极管作为光电探测器将获取到的荧光信号转换成电信号，其成本低，响应快，使用寿命更长；并且具有高稳定性、低暗电流、高灵敏度等优点。LED光源、滤光片、光电二极管、以及光路结构组成的光学系统被密封在光学暗箱中，以降低杂散光的干扰。检测过程中，仪器内部的电机带动试剂条匀速直线运动，由于试剂条上荧光物质的分布是变化的，光电探测器在试纸的每个检测点上获取的荧光信号也是变化的。

（4）电信号处理：对光电探测器获取的微弱电流信号进一步的处理；首先，通过I/V转换电路将电流信号转化为电压信号，再通过带通滤波放大电路进行放大，增大信噪比；然后通过检波电路以获取高精度的放大后的电信号（仍然是模拟信号）。

（5）AD转换处理：通过高精度的AD转换器，其具有转化速度快、功耗低的优点，把之前处理获取的模拟信号转化成数字信号；并把每个检测点的数字信号按照顺序传递给仪器的客户端软件，拼成一条采样曲线（即：原始检测数据，如图2），以便进一步的算法处理。

3、滤波处理：主要是对硬件模块传递过来的原始检测数据，进行滤波计算处理；用于进一步滤除实际检测过程中，存在的暗电流、杂散光、试剂条的背景荧光噪声、电流噪声、光子噪声、电机的电磁噪声、等等。本方案针对上述噪声大都是随机信号的特点，采取滑动窗口平均滤波算法，可以很好的衰减高频信号，对数据起到平滑作用，去除大部分的毛刺信号，可以在最大限度抑制噪声的同时保存有用信号，从而提高信噪比。滤波后的曲线如图3。

4、基线拟合处理：对滤波后的数据需要进一步的去除基线的处理操作。在实际检测过程中由于温度变化、试剂条荧光物浓度不均匀等各种噪声原因，曲线会出现严重漂移，严重影响浓度值的计算。需要通过基线拟合算法来解决；经过综合考虑本系统选用最小二乘法拟合来滤除基线漂移，可以有效减少噪声干扰以及基线漂移对分析结果造成的影响。基线拟合后的曲线如图4。

5、寻峰处理：对基线拟合后的曲线，还需要进一步的寻峰处理，即寻找T峰和C峰的位置。本方案采用在特定的波峰范围内，寻找最大值的方法获取T峰（对应检测线）和C峰（对应控制线）。寻峰后的曲线如图5。

6、计算面积：即计算T/C面积比值；理论上可以选择T、C峰的光强值作为待测物浓度的参考点，但是为了进一步消除随机噪声，本方案选择在基线拟合后的T、C峰左右各M个点范围内求面积的方法，得到光强特征值；针对本试剂条的峰特点，M值设置为35（峰面积取值范围如图6）。计算得到的T峰面积为：3217878，C峰面积为：14013014。在实际测量过程中总会存在各种不稳定因素，包括点击的震动、光源不稳定、试剂条荧光信号衰减等，导致T与C面积值整体的波动，所以采用在同一状态下两者的比值----T/C面积比值作为最终结果判断，进一步减少了噪声干扰，保证了测量精度。计算得T/C值为：0.229635。

7、计算浓度：即根据T/C光强特征值与浓度标准曲线；每批次的试剂条都会在出厂前标定标准曲线，本实验的试剂条对应的标准曲线点为：（0，0.041317）（1.5，0.056911）（6.25，0.214792）（12.5，0.399957）（25，0.72784）（50，1.225726）（100，2.188615）（200，3.749999）（浓度单位为：μg/L）标准曲线如图7。将第6步中计算得到T/C值0.229635带入本标准曲线，计算得到的待测样本浓度是：6.2617μg/L。而实验中使用的待测样本溶液的实际浓度是6.25μg/L，本试剂条的误差仅为0.19%，误差范围很小，检测精度很高。

以上所述实施方式仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。