本发明涉及端粒酶活性测试系统。更具体地说，本发明涉及一种基于SPR技术的端粒酶活性测试系统。
背景技术：
端粒酶(telomerase)是一种逆转录酶，是一种真核生物线性染色体末端的能够以端粒DNA为底物，对端粒DNA末端进行重复DNA扩增的一种RNA核糖--蛋白复合体。端粒酶对端粒DNA的扩增能够使得细胞无限分裂而不会自然凋亡，从而导致癌症的发生。目前，在85％以上的癌细胞中发现了端粒酶的过量表达，端粒酶和肿瘤细胞存在高度相关性,它有可能成为抗肿瘤药物的新靶点并成为肿瘤诊断的重要标志物。建立一种高效、快速、灵敏的分析方法对筛选大量临床标本有重要意义。目前端粒酶活性检测的方法基本可以分为非PCR的基本方法和基于PCR的系列方法。端粒酶活性检测的基本方法直接用同位素标记的核苷酸dGTP标记端粒酶的扩增产物，通过凝胶电泳进行分离自显影，该方法由于哺乳动物细胞端粒酶水平较低,这种方法在人体肿瘤中的应用受到限制。Kim最早建立了基于PCR的端粒重复序列扩增法(TRAP)，TRAP法能从104个正常细胞中检出混杂在其中的一个肿瘤细胞的端粒酶活性，因此这种方法大大提高了检测的灵敏度、速度和效果。此后研究人员还在此基础上开发出了TRAP银染法、接近闪烁分析法、TRAP—ELISA法等，这些方法解决了TRAP法中存在的一些问题，能够更好的检测端粒酶活性。但是这些方法都无法避免的需要采用凝胶分离的方法分离最终产物，并通过检测同位素标记或光密度的方法进行最后的定量测定。这些测量方法都很复杂，需要较长的时间，导致成本高昂。
技术实现要素：
作为各种广泛且细致的研究和实验的结果，本发明的发明人已经发现，将基于表面等离子共振(SPR)生物传感芯片应用于端粒酶活性的检测中，可有效简化检测过程，提高检测速度。基于这种发现，完成了本发明。
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种基于SPR技术的端粒酶活性测试系统，其能够配合市场上成熟的SPR仪器，能够实现简单、快速的端粒酶活性检测。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种基于SPR技术的端粒酶活性测试系统，其包括：
试剂盒，其具有10～200mmol/L的缓冲液和8～12mmol/L的dNTP，其中所述缓冲液的pH为7.3；
SPR芯片，其具有玻璃片、覆盖于所述玻璃片上的金属镀膜、连接于所述镀膜的端粒DNA。
利用现有SPR仪器，将上述测试系统应用于端粒酶活性检测的具体测试过程如下：
试剂盒中溶液作为检测过程中的工作液通过蠕动泵进入流通池，通过SPR仪器自带的控温模块控制流通池内的温度为37℃，保证流通池内的端粒酶活性处于最佳状态。待SPR信号响应稳定后，通过加样器加入含有细胞提取物的待测样品进行测试。细胞中的端粒酶能够以芯片上修饰的端粒DNA为底物，以工作液中的dNTP为原料进行扩增，从而使结合在金属镀膜表面的端粒DNA的质量增加。根据SPR工作原理，其共振角的变化与芯片表面质量的改变直接相关，通过检测SPR信号改变情况，就能检测到芯片上修饰的端粒DNA是否有延长，从而对细胞中的端粒酶活性进行定性和定量检测。
优选的是，其中，所述SPR芯片的构建步骤为：
步骤一，将所述玻璃片镀覆一层金属薄膜后，得到第一芯片；
步骤二，将所述第一芯片置于5～15μmol/L的所述端粒DNA溶液中，0～10℃温度条件下保持10～24h，得到第二芯片；
步骤三，将所述第二芯片置于1～3mmol/L的巯基醇类的磷酸缓冲液中封闭2～6h，得到SPR芯片。
优选的是，其中，所述dNTP具有等摩尔比的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，以确保端粒DNA的正确扩增。
优选的是，所述镀膜为金膜或银膜，金属元素的性质各不相同，对SPR光谱也将产生较大的影响。金属材料的选择需要综合考虑其反射率及稳定性，金、银、铜、铝的反射率均较高，但铝和铜的稳定性较差，易被氧化形成氧化层，影响SPR的产生，金和银较为适合。
优选的是，所述镀膜为金膜，其具有更强的化学惰性，确保芯片的长期使用，所述端粒DNA的5’端修饰有巯基，巯基-SH和金Au之间具有较强的相互作用，所述端粒DNA通过巯基连接于金膜可自发的形成有序结构，且稳定性非常高。
优选的是，其中，所述端粒DNA通过三硫代金刚烷衍生物连接于所述金膜，三硫代金刚烷衍生物具有良好的稳定性，通过三个硫对金膜表面进行鳌合，可获得极高的金膜表面包被的稳定性，从而显著提高了端粒DNA与金膜连接的稳定性。
优选的是，其中，所述镀膜的厚度为43～46nm，金属镀膜的厚度直接影响共振深度，直接影响SPR信号的灵敏度。
优选的是，其中，所述巯基醇类选自巯基乙醇、巯基己醇、巯基十一醇的任意一种。
优选的是，其中，所述巯基醇类为巯基乙醇，巯基乙醇优异的还原性可保证最佳的封闭效果，避免非特异性吸附的产生。
优选的是，其中，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液，以保证dNTP的稳定性。
本发明至少包括以下有益效果：
(1)不需要加入放射性同位素或荧光标记物等信号源，提高了安全性，也大大降低了检测的费用；
(2)消除了PCR实验的影响，实现了一步检测，简化了实验过程；
(3)由于不需要对扩增的产物进行分离再检测，极大的提高了检测的速度；
(4)能够做到检测的实时性与可重复性，提高了实验的可靠性。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明一个实例中SPR芯片检测端粒酶活性的简单示意图。
图中：1、金属镀膜，2、带有巯基的端粒DNA，3、端粒酶，4、延长后的端粒DNA。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
图1示出了根据本发明的一种实现方式，SPR芯片的金属镀膜1表面连有一层端粒DNA分子2，待测的端粒酶3能够以芯片上的端粒DNA为底物，以试剂盒中的dNTP为原料进行扩增，使结合在金属镀膜表面的端粒DNA延长，从而质量增加。利用现有的SPR仪器，利用SPR芯片共振角的变化与芯片表面质量改变的直接相关性，可以对细胞中的端粒酶活性进行定性和定量检测。
<实例1>
1)配制试剂盒，其中含有10mmol/L的Tris-HCl缓冲液，溶液pH为7.3，同时缓冲液中还含有等摩尔比例的脱氧单核苷酸(dNTP)用于DNA的合成，dNTP总浓度为8mmol/L；
2)芯片的构建：玻璃片上镀覆一层厚度为43nm的银膜后，置于5μmol/L的修饰有巯基的端粒DNA溶液中0℃孵育10小时，将端粒DNA通过巯基连接于银膜表面，其中，DNA序列如下：5’-SH-AAA AAA AAA AAA TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG。修饰完成后用1mmol/L的巯基乙醇的磷酸缓冲液封闭2小时，最后将制备好的芯片真空干燥，氮气保护封存，能够长期储存，测试时直接使用；
3)使用：将修饰好的芯片放入SPR仪，加入工作液，设定好仪器参数，仪器自带的控温模块控制流通池内的温度为37℃，当基线稳定后，通过六元阀加入细胞提取液，通过监测芯片共振角的变化，能够快速、实时的检测端粒酶活性。
<实例2>
1)配制试剂盒，其中含有200mmol/L的Tris-HCl缓冲液，溶液pH为7.3，同时缓冲液中还含有等摩尔比例的脱氧单核苷酸(dNTP)用于DNA的合成，dNTP总浓度为12mmol/L；
2)芯片的构建：玻璃片上镀覆一层厚度为46nm的金膜后，置于15μmol/L的修饰有三硫代金刚烷衍生物的端粒DNA溶液中10℃孵育24小时，三硫代金刚烷衍生物的结构式如下：
其中，R表示三硫代金刚烷衍生物的功能基团，
端粒DNA的序列为：5’-X-AAA AAA AAA AAA TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG，其中X为三硫代金刚烷衍生物，将端粒DNA通过三巯基连接于金膜表面。修饰完成后用3mmol/L的巯基乙醇的磷酸缓冲液封闭6小时，最后将制备好的芯片真空干燥，氮气保护封存，能够长期储存，测试时直接使用；
3)使用：将修饰好的芯片放入SPR仪，加入工作液，设定好仪器参数，仪器自带的控温模块控制流通池内的温度为37℃，当基线稳定后，通过六元阀加入细胞提取液，通过监测芯片共振角的变化，能够快速、实时的检测端粒酶活性。
<实例3>
1)配制试剂盒，其中含有100mmol/L的Tris-HCl缓冲液，溶液pH为7.3，同时缓冲液中还含有等摩尔比例的脱氧单核苷酸(dNTP)用于DNA的合成，dNTP总浓度为10mmol/L；
2)芯片的构建：玻璃片上镀覆一层厚度为44nm的金膜后，置于10μmol/L的修饰有巯基的端粒DNA溶液中4℃孵育20小时，将端粒DNA通过巯基连接于金膜表面，其中，DNA序列如下：5’-SH-AAA AAA AAA AAA TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG。修饰完成后用2mmol/L的巯基己醇的磷酸缓冲液封闭4小时，最后将制备好的芯片真空干燥，氮气保护封存，能够长期储存，测试时直接使用；
3)使用：将修饰好的芯片放入SPR仪，加入工作液，设定好仪器参数，仪器自带的控温模块控制流通池内的温度为37℃，当基线稳定后，通过六元阀加入细胞提取液，通过监测芯片共振角的变化，能够快速、实时的检测端粒酶活性。
<实例4>
1)配制试剂盒，其中含有50mmol/L的Tris-HCl缓冲液，溶液pH为7.3，同时缓冲液中还含有等摩尔比例的脱氧单核苷酸(dNTP)用于DNA的合成，dNTP总浓度为12mmol/L；
2)芯片的构建：玻璃片上镀覆一层厚度为45nm的金膜后，置于12μmol/L的修饰有三硫代金刚烷衍生物的端粒DNA溶液中7℃孵育14小时，三硫代金刚烷衍生物的结构式如下：
其中，R表示三硫代金刚烷衍生物的功能基团，
端粒DNA的序列为：5’-X-AAA AAA AAA AAA TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG，其中X为三硫代金刚烷衍生物，将端粒DNA通过三巯基连接于金膜表面。修饰完成后用2mmol/L的巯基乙醇的磷酸缓冲液封闭3小时，最后将制备好的芯片真空干燥，氮气保护封存，能够长期储存，测试时直接使用；
3)使用：将修饰好的芯片放入SPR仪，加入工作液，设定好仪器参数，仪器自带的控温模块控制流通池内的温度为37℃，当基线稳定后，通过六元阀加入细胞提取液，通过监测芯片共振角的变化，能够快速、实时的检测端粒酶活性。
<实例5>
1)配制试剂盒，其中含有170mmol/L的Tris-HCl缓冲液，溶液pH为7.3，同时缓冲液中还含有等摩尔比例的脱氧单核苷酸(dNTP)用于DNA的合成，dNTP总浓度为9mmol/L；
2)芯片的构建：玻璃片上镀覆一层厚度为45nm的金膜后，置于7μmol/L的修饰有巯基的端粒DNA溶液中8℃孵育18小时，将端粒DNA通过巯基连接于金膜表面，其中，DNA序列如下：5’-SH-AAA AAA AAA AAA TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG。修饰完成后用3mmol/L的巯基十一醇的磷酸缓冲液封闭3小时，最后将制备好的芯片真空干燥，氮气保护封存，能够长期储存，测试时直接使用；
3)使用：将修饰好的芯片放入SPR仪，加入工作液，设定好仪器参数，仪器自带的控温模块控制流通池内的温度为37℃，当基线稳定后，通过六元阀加入细胞提取液，通过监测芯片共振角的变化，能够快速、实时的检测端粒酶活性。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。