一种谷胱甘肽稳定的金纳米簇在检测半胱氨酸和赖氨酸含量中的应用的制作方法

本发明属于氨基酸检测领域，具体涉及一种谷胱甘肽稳定的金纳米簇检测半胱氨酸和赖氨酸含量中的应用。

背景技术：

氨基酸是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，人体内20种氨基酸具有各自不同的功能，相互促进并相互影响。如果人体缺乏任何一种必需氨基酸，就可导致生理功能异常，影响抗体代谢的正常进行，最后导致疾病。由于氨基酸缺乏和代谢障碍所引起的疾病涉及免疫、神经系统、心脑血管、肾脏、代谢、糖尿病等各类疾病，影响人体生长发育、营养健康、肌肉骨骼生长、激素分泌、解毒功能等各个健康环节。半胱氨酸是一种具有生理功能的氨基酸，是组成蛋白质的20多种氨基酸中惟一具有还原性基团巯基(-sh)的氨基酸，巯基能与与ag⁺、hg²⁺、cu²⁺、pb²⁺等重金属离子结合，与有毒的芳香族化合物缩合而发挥解毒作用，还具有抗氧化功能同时清除体内自由基。赖氨酸是人体必需氨基酸之一，一种不可缺少的营养物质。能促进机体发育、增强免疫功能，并有提高中枢神经组织功能的作用。目前被广泛应用于医药、食品和饲料工业等。因此，检测半胱氨酸和赖氨酸含量对临床医学诊断、食品检验和工业生产等都具有重要意义。

目前测量半胱氨酸、赖氨酸含量的方法主要有光度分析法、高效液相色谱-质谱法、毛细管电泳法、流动注射法等。半胱氨酸、赖氨酸的检测通常受到反应时间长、反应条件如ph值酸碱性、操作复杂、灵敏度和选择性低的影响。寻找新的高灵敏、高选择性、简便、快速并且能够同时检测检测半胱氨酸和赖氨酸含量的新方法具有重要的研究意义。

技术实现要素：

发明目的：鉴于以上半胱氨酸、赖氨酸含量的检测方法目前存在的问题，本发明提供一种谷胱甘肽稳定的金纳米簇检测半胱氨酸和赖氨酸含量中的应用，制备该谷胱甘肽稳定的金纳米簇的方法简便、绿色、温和，检测方法具有高选择性、高灵敏度、简便、易行等特性。

本发明的技术方案：

谷胱甘肽稳定的金纳米簇作为荧光探针和比率荧光探针在检测半胱氨酸含量中的应用。

谷胱甘肽稳定的金纳米簇作为荧光探针和比率荧光探针在检测赖氨酸含量中的应用。

谷胱甘肽稳定的金纳米簇作为荧光探针和比率荧光探针在同时检测半胱氨酸和赖氨酸含量中的应用。

谷胱甘肽稳定的金纳米簇检测半胱氨酸含量的方法，包括以下步骤：

步骤(a1)：在402nm波长光的激发下，测定谷胱甘肽稳定的金纳米簇在570nm波长处的荧光强度，记为i0；

步骤(a2)：向步骤(a1)所述谷胱甘肽稳定的金纳米簇中加入不同浓度待测样品半胱氨酸后，测定含有不同浓度半胱氨酸的谷胱甘肽稳定的金纳米簇在402nm波长光激发下，在570nm波长处的荧光强度，记为i570，根据加入不同浓度半胱氨酸后，荧光强度的变化值，计算出加入半胱氨酸前后谷胱甘肽稳定的金纳米簇荧光强度的变化值与半胱氨酸浓度的线性关系；步骤(a3)：将待测样品加入谷胱甘肽稳定的金纳米簇中，测试其加入前后在402nm波长光的激发下，在570nm波长处的荧光强度的变化值，根据步骤(a2)得到的线性关系，计算出加入半胱氨酸的质量或浓度。

步骤(a2)具体的测定过程如下：取300μl制备的谷胱甘肽稳定的金纳米簇样品，加入到离心管中，然后加入适量体积的半胱氨酸工作溶液，用双蒸水稀释至3ml，混合均匀，进行测定。在402nm波长光的激发下，测试其荧光光谱，仪器的狭缝宽度均设定为5nm，实验发现在570nm波长处有最大发射峰。加入半胱氨酸后，测试样品引起探针荧光的变化，记录在该最大发射峰位置的荧光强度，表示为：δi＝i570–i0,其中，i0和i570分别为谷胱甘肽稳定的金纳米簇自身及加入半胱氨酸后的荧光强度。

谷胱甘肽稳定的金纳米簇检测赖氨酸含量的方法，包括以下步骤：

步骤(b1)：在402nm波长光的激发下，测定谷胱甘肽稳定的金纳米簇在570nm波长处的荧光强度，记为i0；

步骤(b2)：向步骤(b1)所述谷胱甘肽稳定的金纳米簇中加入不同浓度待测样品赖氨酸后，测定含有不同浓度赖氨酸的谷胱甘肽稳定的金纳米簇在402nm波长光激发下，在473nm波长处的荧光强度，记为i473，在570nm波长处的荧光强度，记为i570，根据加入不同浓度赖氨酸后，荧光强度的变化值，计算出加入赖氨酸前后谷胱甘肽稳定的金纳米簇在473nm与570nm处荧光强度比值(记为i473/i570)的变化值与赖氨酸浓度的线性关系；

步骤(b3)：将待测样品加入谷胱甘肽稳定的金纳米簇中，测试其加入前后在402nm波长光的激发下，在473nm和570nm波长处的荧光强度的变化值，根据步骤(b2)得到的线性关系，计算出加入赖氨酸的质量或浓度。

步骤(b2)具体的测定过程如下：取300μl制备的谷胱甘肽稳定的金纳米簇样品，加入到离心管中，然后加入适量体积的赖氨酸工作溶液，用双蒸水稀释至3ml，混合均匀，进行测定。在402nm波长光的激发下，测试其荧光光谱，仪器的狭缝宽度均设定为5nm，实验发现分别在473nm和570nm波长处有两个荧光发射峰。加入赖氨酸后，测试样品引起探针荧光的变化，记录在473nm和570nm波长处发射峰位置的荧光强度比值，表示为：i473/i570,其中，i473和i570分别为谷胱甘肽稳定的金纳米簇加入赖氨酸后新发射峰荧光强度以及谷胱甘肽稳定的金纳米簇原有的发射峰荧光强度。

谷胱甘肽稳定的金纳米簇同时检测半胱氨酸和赖氨酸含量的方法，包括以下步骤：

步骤(c1)：在402nm波长光的激发下，测定谷胱甘肽稳定的金纳米簇在570nm波长处的荧光强度，记为i0；

步骤(c2)：在步骤(c1)所述谷胱甘肽稳定的金纳米簇中分别加入两种不同浓度待测样品半胱氨酸和赖氨酸后，测定含有不同浓度半胱氨酸和赖氨酸的谷胱甘肽稳定的金纳米簇在402nm波长光激发下，分别在570nm和473nm波长处的荧光强度，在570nm波长处的荧光强度，记为i570，在473nm波长处的荧光强度，记为i473。根据加入不同浓度半胱氨酸后，荧光强度在570nm处荧光强度(记为i570)的变化值，计算出加入半胱氨酸前后谷胱甘肽稳定的金纳米簇荧光强度的变化值与半胱氨酸浓度的线性关系；根据加入不同浓度赖氨酸后，荧光强度的变化值，计算出加入赖氨酸前后谷胱甘肽稳定的金纳米簇在473nm处荧光强度(记为i473)的变化值与赖氨酸浓度的线性关系；

步骤(c3)：将待测样品加入谷胱甘肽稳定的金纳米簇中，测试其加入前后在402nm波长光的激发下，在473nm和570nm波长处的荧光强度的变化值，根据步骤(c2)得到的线性关系，分别计算出加入半胱氨酸和赖氨酸的质量或浓度。

步骤(c2)具体的测定过程如下：

取300μl制备的谷胱甘肽稳定的金纳米簇样品，加入到离心管中，然后加入适量体积的半胱氨酸和赖氨酸工作溶液，用双蒸水稀释至3ml，混合均匀，进行测定。在402nm波长光的激发下，测试其荧光光谱，仪器的狭缝宽度均设定为5nm，实验发现分别在473nm和570nm波长处有两个荧光发射峰。加入待测样品后引起探针荧光的变化，记录在473nm和570nm波长处发射峰位置的荧光强度，表示为：i473、i570,其中，i473和i570分别为谷胱甘肽稳定的金纳米簇加入赖氨酸后新发射峰荧光强度和加入半胱氨酸后的荧光强度。

一种谷胱甘肽稳定的金纳米簇的制备方法，以谷胱甘肽为模板，具体包括如下步骤：将新制备的谷胱甘肽水溶液和四氯金酸水溶液按浓度比为1:1、体积比为1:1的比例在剧烈搅拌下混合，然后将混合物在光照条件下反应2-5天，得到浅黄色溶液，离心，上清液通过渗析膜纯化，制备得到谷胱甘肽稳定的金纳米簇。

所述光照条件下反应的反应温度为25-35℃。

所述制备方法制备得到的谷胱甘肽稳定的金纳米簇，呈现球形颗粒，分布均匀，具有良好的单分散性，纳米颗粒平均直径约为2.2nm左右，尺寸均一，具有稳定的荧光特性。

有益效果：

1、本发明的谷胱甘肽稳定的金纳米簇制备方法简便、绿色、温和，制备得到的谷胱甘肽稳定的金纳米簇对半胱氨酸和赖氨酸的检测具有高选择性、高灵敏度、简便、易行等特性。

2、本发明提供的检测方法可以应用到多种领域的测定，包括食品、药品和动物饲料半胱氨酸和赖氨酸含量的检测中。

3、本发明提供的检测方法的建立可以为半胱氨酸和赖氨酸的高灵敏、快速检测提供新思路。

附图说明

图1为实施例1制得的谷胱甘肽稳定的金纳米簇的紫外可见吸收光谱、荧光激发光谱以及荧光发射光谱；

图2为实施例1制得的谷胱甘肽稳定的金纳米簇的透射电镜图；

图3为谷胱甘肽稳定的金纳米簇加入半胱氨酸和加入赖氨酸后的荧光发射光谱；

图4a为谷胱甘肽稳定的金纳米簇荧光强度随加入半胱氨酸浓度变化值的关系(标准曲线)；

图4b为谷胱甘肽稳定的金纳米簇荧光强度随加入赖氨酸浓度变化值的关系(标准曲线)。

具体实施方式：

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。本发明中，利用谷胱甘肽稳定的金纳米簇测定半胱氨酸和赖氨酸的过程是基于谷胱甘肽为模板及还原剂，在中性条件下，谷胱甘肽中半胱氨酸的巯基与au³⁺作用将其还原为零价金，同时作为模板对形成的谷胱甘肽稳定的金纳米簇起到稳定作用。当加入半胱氨酸时，半胱氨酸可以通过巯基与谷胱甘肽稳定的金纳米簇结合降低其表面缺陷使得谷胱甘肽稳定的金纳米簇的荧光增强；当加入赖氨酸时，赖氨酸聚集并结合到谷胱甘肽稳定的金纳米簇表面使其产生新的荧光发射峰。

下述实施例中所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量测定实验，均为三次重复实验，结果取平均值。

实施例1谷胱甘肽稳定的金纳米簇的制备及表征

1、以谷胱甘肽为模板的金纳米簇(gsh-auncs)的制备

以谷胱甘肽为模板合成具有荧光特性的金纳米簇：荧光金纳米簇的合成是根据文献报道的方法[参见：chenw.b.，tux.j.,guox.q.chem.commun.,2009,1736–1738.]，做了一些改进，过程如下：首先，将新制备的谷胱甘肽水溶液(5mm，10ml)和四氯金酸水溶液(5mm,10ml)在剧烈搅拌下混合，然后将该混合物反应2～5天，得到产物为浅黄色溶液。本实验中，反应物原料浓度比为1:1，反应条件为：反应温度30℃，反应环境为日光光照或日光灯光照条件，改进后，合成时间缩短为2～5天，制备出的谷胱甘肽稳定的金纳米簇尺寸均一，具有稳定的荧光特性。将产物在转速15000rpm下离心20分钟，上清液通过渗析膜(截留分子量12000da)进一步纯化，制备的谷胱甘肽稳定的金纳米簇在4℃条件下避光保存备用。

2、以谷胱甘肽为模板的金纳米簇的表征

采用荧光光谱仪(jascofp-6500)对gsh-auncs的荧光性进行表征。将gsh-auncs与磷酸盐缓冲溶液(50mmpbs,ph7.0)按1:1稀释，取3ml于四面透光的比色皿中，设置荧光仪的激发波长402nm，狭缝宽度5nm，在波长范围480-680nm内扫描记录荧光光谱。取10μlgsh-auncs溶液于离心管中，稀释至3ml，加入比色皿中待测，另一比色皿中加入3ml超纯水作为校正样品，使用紫外-可见光谱仪(uv-2450)在200-800nm波长范围内对样品进行扫描。

实验测得gsh-auncs的荧光光谱和紫外-可见光谱，如图1所示，gsh-auncs的激发波长为402nm，发射波长为570nm，且有较大的斯托克斯位移(168nm)。

本实验制备的gsh-auncs呈现球形颗粒，如图2所示，且分布均匀，具有良好的单分散性。纳米颗粒平均直径约为2.2nm左右。

实施例2谷胱甘肽稳定的金纳米簇荧光探针检测半胱氨酸

本实施例将详细阐述如何利用实施例1中制备得到的谷胱甘肽模板的金纳米簇检测半胱氨酸的过程。

利用制备得到的荧光谷胱甘肽稳定的金纳米簇探针检测半胱氨酸具体步骤：取300μl制备的谷胱甘肽稳定的金纳米簇样品，加入到离心管中，然后加入一系列浓度的半胱氨酸工作溶液，分别检测不同浓度半胱氨酸对谷胱甘肽稳定的金纳米簇探针的荧光信号的影响(终浓度为0、5、10、15、20、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、300μm)。用双蒸水稀释到终体积为3ml，混合均匀，进行测定。在402nm波长光的激发下，测试谷胱甘肽稳定的金纳米簇的荧光光谱，仪器的狭缝宽度设定为5nm，检测570nm波长处的发射峰荧光强度。测试加入半胱氨酸后样品的荧光信号，记录在该最大发射峰位置的荧光强度，表示为：δi＝i570–i0,其中，i0和i570分别为谷胱甘肽稳定的金纳米簇自身及加入半胱氨酸后的荧光强度。实验重复3次，结果取其平均值。

结果显示，实施例1中制备的谷胱甘肽模板的谷胱甘肽稳定的金纳米簇荧光探针，加入半胱氨酸后，探针的荧光信号出现荧光增强现象，详见图3和图4a，且随着半胱氨酸浓度的增加，探针荧光信号强度随之增强，在1-165μm浓度范围内，半胱氨酸浓度与探针的荧光强度呈现出良好的线性关系，其检出限为50nm。

实施例3谷胱甘肽稳定的金纳米簇比率荧光探针检测赖氨酸

本实施例将详细阐述如何利用实施例1中制备得到的谷胱甘肽模板的金纳米簇检测赖氨酸的过程。

利用制备得到的谷胱甘肽稳定的金纳米簇比率荧光探针检测赖氨酸具体步骤：取300μl制备的谷胱甘肽稳定的金纳米簇样品，加入到离心管中，然后加入一系列浓度的赖氨酸工作溶液，分别检测不同浓度赖氨酸对谷胱甘肽稳定的金纳米簇探针的荧光信号的影响(终浓度为0、2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、22.5、25μm)。用双蒸水稀释到终体积为3ml，混合均匀，进行测定。在402nm波长光的激发下，测试谷胱甘肽稳定的金纳米簇的荧光光谱，仪器的狭缝宽度设定为5nm，实验发现分别在473nm和570nm波长处有两个荧光发射峰。加入赖氨酸后，测试样品引起探针荧光的变化，记录在473nm和570nm波长处发射峰位置的荧光强度比值，表示为：i473/i570,其中，i473和i570分别为谷胱甘肽稳定的金纳米簇加入赖氨酸后新发射峰荧光强度以及谷胱甘肽稳定的金纳米簇原有的发射峰荧光强度。实验重复3次，结果取其平均值。

结果显示，实施例1中制备的谷胱甘肽模板的金纳米簇比率荧光探针，加入赖氨酸后，在同样的激发波长402nm激发下，探针在473nm处产生新的发射峰，且荧光信号出现荧光增强现象，原本谷胱甘肽稳定的金纳米簇570nm处的发射峰变化不大，仅有轻微的减弱，详见图3和图4b，随着赖氨酸浓度的增加，探针473nm处荧光信号强度随之增强，根据473nm和570nm波长处发射峰位置的荧光强度比值间的关系，在0.02-5μm浓度范围内，赖氨酸浓度与比率荧光探针的荧光比值呈现出良好的线性关系，其检出限为2nm。由此可以看出，根据实施例1得到的谷胱甘肽稳定的金纳米簇比率荧光探针，通过测量探针两个不同波长处的荧光变化，以其比值作为信号参量，不受光源强度波动和仪器灵敏度的影响。与传统比率荧光探针相比，无需引入额外的荧光染料或其他荧光纳米材料，节约成本、绿色环保，本实验提供了一种简便、高准确性和高灵敏度的新型谷胱甘肽稳定的金纳米簇比率荧光探针，并提供了一种谷胱甘肽稳定的金纳米簇比率荧光探针检测赖氨酸的新方法。

实施例4谷胱甘肽稳定的金纳米簇荧光探针同时检测半胱氨酸和赖氨酸

本实施例将详细阐述如何利用实施例1中制备得到的谷胱甘肽模板的金纳米簇同时检测半胱氨酸和赖氨酸的过程。

利用制备得到的谷胱甘肽稳定的金纳米簇比率荧光探针同时检测半胱氨酸和赖氨酸具体步骤：取300μl制备的谷胱甘肽稳定的金纳米簇样品，加入到离心管中，然后加入一系列浓度的半胱氨酸和赖氨酸工作溶液，其步骤同实施例2和实施例3，分别检测不同浓度半胱氨酸和赖氨酸对谷胱甘肽稳定的金纳米簇探针的荧光信号的影响。在402nm波长光的激发下，测试谷胱甘肽稳定的金纳米簇分别在473nm和570nm波长处的荧光光谱。加入半胱氨酸和赖氨酸后，测试样品引起探针荧光的变化，记录在473nm和570nm波长处发射峰位置的荧光强度，表示为：i473、i570,其中，i473和i570分别为谷胱甘肽稳定的金纳米簇加入赖氨酸后新发射峰荧光强度和加入半胱氨酸后的荧光强度。实验重复3次，结果取其平均值。

结果显示，谷胱甘肽稳定的金纳米簇荧光探针，加入两种氨基酸后，在同样的激发波长402nm激发下，探针在473nm处产生新的发射峰，且473nm和570nm处荧光信号均出现荧光增强现象，随着半胱氨酸和赖氨酸浓度的增加，探针473nm和570nm处荧光信号强度随之增强。本实验中，473nm处荧强度光增强归因于赖氨酸的加入，随着赖氨酸浓度的增加，探针473nm处荧光信号强度随之增强；570nm处荧强度光增强归因于半胱氨酸的加入，随着半胱氨酸浓度的增加，探针570nm处荧光信号强度随之增强。两个不同波长处的荧光变化互不干扰，可以同时检测两种氨基酸，本实验提供了一种高选择性、高灵敏度的新型谷胱甘肽稳定的金纳米簇荧光探针，并提供了一种谷胱甘肽稳定的金纳米簇荧光探针同时检测半胱氨酸和赖氨酸的新方法。将待测样品加入谷胱甘肽稳定的金纳米簇中，测试其加入前后在402nm波长光的激发下，在473nm和570nm波长处的荧光强度的变化值，根据分别得到的线性关系，计算出加入半胱氨酸和赖氨酸的浓度。该方法具有高选择性、高灵敏度、简便、易行等特点。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书其等效物界定。