一种一步还原沉积石墨烯/苯硼酸复合物用于葡萄糖检测的方法与流程

本发明涉及一种一步还原沉积石墨烯的技术，尤其涉及一种一步还原沉积石墨烯/苯硼酸复合物用于葡萄糖检测的方法。

背景技术：

氧化石墨烯具有大量的羧基可用于共价固定敏感物质，从而实现生化检测，但因较差电学性能限制了其在电化学传感中的应用。石墨烯具有大的比表面积、高的导电性和室温电子迁移率，电化学稳定性好，电荷传递电阻小等优点。氧化石墨烯可以通过化学、电化学、热还原等技术转化成还原氧化石墨烯(兼具石墨烯的性能)，提高其导电性与传感性。此外电化学生物传感的另一重要部分是修饰电极，电化学沉积通过循环电位电化学氧化还原方法，在电极表面可以形成稳定性好功能膜，具有重复性高、鲁棒性好等优点。电化学分析领域常用的传统电极有玻碳电极、金电极、铂电极等，这些电极的主要缺点在于生产成本高，通常需要复杂的前处理过程。而丝网印刷电极作为电化学分析的基础电极，具有能批量生产，可一次性使用，成本较低等优势，更利于便携式电化学生物传感器的开发。本发明通过一步法同步实现还原与沉积石墨烯在印刷电极表面，通过不同的特异性修饰，可实现稳定性好、灵敏度高的生化检测。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种一步法还原沉积石墨烯的技术，尤其涉及一种一步法还原沉积石墨烯/苯硼酸复合物用于葡萄糖检测的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种一步还原沉积石墨烯/苯硼酸复合物用于葡萄糖检测的方法，该方法在阻抗检测系统上实现，所述阻抗检测系统包括：丝网印刷电极测试系统(1)、电化学阻抗测试工作站(13)以及显示器(18)；丝网印刷电极测试系统(1)包含样品池(2)、密封圈(3)、碳工作电极(4)、碳对电极(5)、银/氯化银参比电极(6)、绝缘防水层(7)、导电银层(8)、电极转换插口(9)、对电极接口(10)、工作电极接口(11)、参比电极接口(12)；样品池(2)中空结构，放置于碳工作电极(4)上方，通过密封圈(3)与碳工作电极(4)密封连接；其中对电极接口(10)、工作电极接口(11)、参比电极接口(12)分别与电化学阻抗测试工作站(13)的测试对电极接口(14)、测试工作电极接口(15)、测试参比电极接口(16)通过导线相连。电化学测试工作站(13)则通过电源连接线(17)与显示器(18)相连，实现数据的实时监测；该方法包括以下步骤：

(1)制备丝网印刷电极测试系统(1)，制备碳-碳-银/氯化银三电极，以及外设装置，具体包括以下步骤：

(1.1)选材：聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)作为软性材料基底，电极油墨分别为碳油墨、银油墨、银/氯化银油墨；

(1.2)在PET基底上印刷导电银油墨，形成宽1mm的电极条，作为导电银层(8)，并在120℃烘箱内热固化30min；

(1.3)印刷绝缘油墨覆盖中间导电部分，形成绝缘防水层(7)，并在80℃烘箱内热固化10min；

(1.4)印刷导电碳油墨，分别形成直径5mm的碳工作电极(4)和圆弧状碳对电极(5)，宽度为1mm，并在80℃烘箱内热固化20min；

(1.5)印刷银/氯化银油墨，形成圆弧状银/氯化银参比电极(6)，宽度为1mm，并在80℃烘箱内热固化10min。最后得到的丝网印刷电极面积为18mm*6mm(长*宽)，其中碳工作电极(4)的直径为5mm。

(1.6)在导电银层(8)的末端设置电极转换插口(9)，使得印刷电极的三电极方便的与电化学工作站连接；碳工作电极(4)上方通过密封圈(3)固定中空结构的样品池(2)，保证溶液在固定的电极范围内反应，密封圈(3)一方面用来保证反应液体集中在工作电极中心，一方面防止液体外流，影响检测结果。

(2)氧化石墨烯/苯硼酸复合物合成，具体包括以下子步骤：

(2.1)前置液的配制：配置浓度为1mg/mL的氧化石墨烯3mL，浓度为2mg/mL的EDC(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)1.5mL，浓度为3mg/mL的NHS(N-羟基琥珀亚胺)1.5mL，浓度为1mg/mL的苯硼酸4mL，上述溶剂均为去离子水；

(2.2)氧化石墨烯/苯硼酸复合物合成；取上述配好的氧化石墨烯3mL于一容积为15mL的离心管中，加入1.5mL的EDC，振荡器振荡2min，冰水浴超声1h，使氧化石墨烯中的羧基充分被EDC活化，利于后续复合物合成；取上述配好的苯硼酸4mL加入超声后的溶液中，振荡器振荡2min，加1.5mL的NHS作为脱水缩合的保护剂，再次振荡2min，放入冰箱静至4h，完成复合物制备，最终该复合物总量为10mL。

(3)一步法还原沉积石墨烯/苯硼酸于印刷电极，具体包括以下子步骤：

(3.1)电极活化：取10uL饱和硫酸钠溶液作为电极活化电解液于丝网印刷电极测试系统(1)的样品池(2)中，利用电化学循环伏安法对印刷电极进行活化，电压范围为-1.2V至+1.2V，扫描步径为50mV/s，扫描圈数为10圈，得到经过活化的印刷电极；

(3.2)取5uL步骤(2.2)制备的氧化石墨烯/苯硼酸复合物于丝网印刷电极测试系统(1)的样品池(2)中，再加入5uL饱和硫酸钠溶液作为电解液，利用电化学循环伏安法对活化后的印刷电极进行特异性修饰，电压范围为-1.2V至+1.2V，扫描步径为50mV/s，扫描圈数为40圈，得到修饰了还原氧化石墨烯/苯硼酸的印刷电极；

(4)葡萄糖特异性检测，具体包括以下子步骤：

(4.1)标准溶液制配：配制浓度分别为0.1mM,0.2mM,0.5mM,1.0mM,2.0mM,5.0mM,10.0mM,20.0mM和50mM的葡萄糖标准溶液，溶剂为去离子水；

(4.2)葡萄糖电化学阻抗检测：使用步骤(3.2)得到的修饰了还原氧化石墨烯/苯硼酸的印刷电极，将5uL的0.1mM的葡萄糖标准溶液滴加在丝网印刷电极测试系统(1)的样品池(2)中，利用电化学阻抗检测方法对该浓度下对应的阻抗图谱进行检测；0.2mM,0.5mM,1.0mM,2.0mM,5.0mM,10.0mM,20.0mM和50mM浓度的葡萄糖阻抗检测同上；

(4.3)数据处理：按照等效电路，提取电极表面的转移电阻R_ct的值，对阻值数据进行归一化处理，得到归一化处理结果NIC与葡萄糖浓度的标准曲线；归一化的具体计算公式：NIC＝(Z_a-Z_b)/Z_b，其中Z_a代表葡萄糖溶液测试结果，Z_b代表将去离子水作为待测溶液的空白对照结果；

(4.4)将待测浓度的葡萄糖溶液根据步骤(4.2)得到阻抗图谱，根据步骤(4.3)得到阻值数据的归一化处理，带入步骤(4.3)建立的标准曲线中，得到待测葡萄糖溶液的浓度。

本发明的有益效果是：

1、本发明首次通过一步法同步实现还原与沉积石墨烯在印刷电极表面，利用电化学沉积的方法，具体是通过循环电位电化学氧化还原方法，在电极表面形成稳定性好的功能膜，具有重复性高、鲁棒性好等优点，大大提升了电极修饰的稳定性和灵敏性，简化修饰过程，实现了无毒、绿色、以及高效的修饰过程。

2、氧化石墨烯具有大量的羧基可用于共价固定敏感物质，从而广泛应用于生化检测，但氧化石墨烯因较差电学性能限制了其在电化学传感中的应用；石墨烯具有大的比表面积、高的导电性和室温电子迁移率，电化学稳定性好，电荷传递电阻小等优点，但生物敏感性差。本发明通过绿色环保的电化学还原的方法，实现了还原氧化石墨烯的制备，该制备好的还原氧化石墨烯兼具氧化石墨烯与石墨烯的特性，即有良好的生物敏感性又有高效的电子转移效率，扩展了在电化学测试中的应用。

4、利用一步还原沉积的电化学循环伏安法，制备了重复性好、稳定性高、灵敏度高以及修饰了还原氧化石墨烯/苯硼酸复合物的印刷电极，在不同浓度下的葡萄糖电化学阻抗测试中展现出良好的线性。

5、构建了基于丝网印刷电极的电化学分析，丝网印刷电极具有能批量生产，可一次性使用，成本较低等优势，更利于便携式电化学生物传感器的开发。

6、利用苯硼酸特异性与葡萄糖结合的特性，使用经上述方法制备的还原氧化石墨烯/苯硼酸特异性修饰的印刷电极用于葡萄糖检测，展现良好的稳定性和灵敏性。

7、该方法操作简便、检测稳定性好、通用性强、易于推广使用。

附图说明

图1是本发明所使用的检测系统的结构图；

图2是氧化石墨烯/苯硼酸复合物制备的示意图；

图3是苯硼酸检测葡萄糖的原理示意图；

图4是硫酸钠电解液激活印刷电极的结果图；

图5是氧化石墨烯/苯硼酸复合物在电极表面沉积还原的过程图；

图6是氧化石墨烯/苯硼酸的扫描电镜结果图；

图7是还原氧化石墨烯/苯硼酸的扫描电镜结果图；

图8是还原氧化石墨烯/苯硼酸修饰电极前后的结果对比图；

图9是常用电化学阻抗测试等效电路图；

图10是还原氧化石墨烯/苯硼酸等效电路图；

图11是系统阻抗测试等效电路图；

图12是还原氧化石墨烯/苯硼酸修饰电极后的葡萄糖阻抗检测结果；

图13是还原氧化石墨烯/苯硼酸对应不同浓度下等效阻抗结果图；

图14是还原氧化石墨烯/苯硼酸对应归一化阻抗结果图；

图15是氧化石墨烯/苯硼酸修饰电极后的葡萄糖阻抗检测结果；

图16是氧化石墨烯/苯硼酸对应不同浓度下等效阻抗结果图；

图17是氧化石墨烯/苯硼酸对应归一化阻抗结果图；

图18是还原氧化石墨烯/苯硼酸与氧化石墨烯/苯硼酸修饰电极的对比阻抗谱图；

图19是还原氧化石墨烯/苯硼酸与氧化石墨烯/苯硼酸修饰电极的对比的具体阻抗值统计结果柱状图；

图20是单独还原氧化石墨烯修饰电极测试葡萄糖的结果图；

图21是单独氧化石墨烯修饰电极测糖的归一化阻抗结果；

图22是还原氧化石墨烯/苯硼酸与还原氧化石墨烯修饰电极的对比阻抗值统计结果柱状图；

图23是还原氧化石墨烯/苯硼酸修饰电极用于不同物质的测试的阻抗结果统计柱状图。

图中，丝网印刷电极测试系统1、样品池2、密封圈3、碳工作电极4、碳对电极5、银/氯化银参比电极6、绝缘防水层7、导电银层8、电极转换插口9、对电极接口10、工作电极接口11、参比电极接口12、电化学阻抗测试工作站13、测试对电极接口14、测试工作电极接口15、测试参比电极接口16、电源连接线17、显示器18。

具体实施方式

以下结合附图及具体实施例对本发明作详细描述，但并不是限制本发明。

本发明提供的一种一步还原沉积石墨烯/苯硼酸复合物用于葡萄糖检测的方法，该方法在阻抗检测系统上实现，所述阻抗检测系统包括：丝网印刷电极测试系统(1)、电化学阻抗测试工作站(13)以及显示器(18)；丝网印刷电极测试系统(1)包含样品池(2)、密封圈(3)、碳工作电极(4)、碳对电极(5)、银/氯化银参比电极(6)、绝缘防水层(7)、导电银层(8)、电极转换插口(9)、对电极接口(10)、工作电极接口(11)、参比电极接口(12)；样品池(2)中空结构，放置于碳工作电极(4)上方，通过密封圈(3)与碳工作电极(4)密封连接；其中对电极接口(10)、工作电极接口(11)、参比电极接口(12)分别与电化学阻抗测试工作站(13)的测试对电极接口(14)、测试工作电极接口(15)、测试参比电极接口(16)通过导线相连。电化学测试工作站(13)则通过电源连接线(17)与显示器(18)相连，实现数据的实时监测；该方法包括以下步骤：

(1)制备丝网印刷电极测试系统(1)，制备碳-碳-银/氯化银三电极，以及外设装置，具体包括以下步骤：

(1.1)选材：聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)作为软性材料基底，电极油墨分别为碳油墨、银油墨、银/氯化银油墨；

(1.2)在PET基底上印刷导电银油墨，形成宽1mm的电极条，作为导电银层(8)，并在120℃烘箱内热固化30min；

(1.3)印刷绝缘油墨覆盖中间导电部分，如图1，形成绝缘防水层(7)，并在80℃烘箱内热固化10min；

(1.4)印刷导电碳油墨，如图1，分别形成直径5mm的碳工作电极(4)，和圆弧状碳对电极(5)，宽度为1mm，并在80℃烘箱内热固化20min；

(1.5)印刷银/氯化银油墨，如图1，形成圆弧状银/氯化银参比电极(6)，宽度为1mm，并在80℃烘箱内热固化10min。最后得到的丝网印刷电极面积为18mm*6mm(长*宽)，其中碳工作电极(4)的直径为5mm；

(1.6)在导电银层(8)的末端设置电极转换插口(9)，使得印刷电极的三电极方便的与电化学工作站连接；碳工作电极(4)上方通过密封圈(3)固定中空结构的样品池(2)，保证溶液在固定的电极范围内反应，密封圈(3)一方面用来保证反应液体集中在工作电极中心，一方面防止液体外流，影响检测结果。

(2)氧化石墨烯/苯硼酸复合物合成，具体包括以下子步骤：

(2.1)前置液的配制：配置浓度为1mg/mL的氧化石墨烯3mL,浓度为2mg/mL的EDC(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)1.5mL，浓度为3mg/mL的NHS(N-羟基琥珀亚胺)1.5mL，浓度为1mg/mL的苯硼酸4mL，上述溶剂均为去离子水；浓度配比原则：氧化石墨烯与苯硼酸质量浓度一致，苯硼酸与氧化石墨烯的体积比为4:3，以保证苯硼酸可以与氧化石墨烯的充分结合；EDC与NHS的质量浓度比为2:3，体积比为1:1，以保证氨基、羧基脱水缩合充分反应；EDC的质量浓度与氧化石墨烯的质量浓度之比为2:1，保证羧基活化的充分反应；

(2.2)氧化石墨烯/苯硼酸复合物合成：原理如图2，取上述配好的氧化石墨烯3mL于一容积为15mL的离心管中，加入1.5mL的EDC，振荡器振荡2min，冰水浴超声1h，使氧化石墨烯中的羧基充分被EDC活化，利于后续复合物合成；取上述配好的苯硼酸4mL加入超声后的溶液中，振荡器振荡2min，加1.5mL的NHS作为脱水缩合的保护剂，再次振荡2min，放入冰箱静至4h，完成复合物制备，最终该复合物总量为10mL，苯硼酸测糖的原理如图3。

(3)一步法还原沉积石墨烯/苯硼酸于印刷电极，具体包括以下子步骤：

(3.1)电极活化：取10uL饱和硫酸钠溶液作为电极活化电解液于丝网印刷电极测试系统(1)的样品池(2)中，利用电化学循环伏安法对印刷电极进行活化，电压范围为-1.2V至+1.2V，扫描步径为50mV/s，扫描圈数为10圈，得到经过活化的印刷电极，用于后续电极修饰和测试，结果如图4所示；

(3.2)取5uL步骤(2.2)制备的氧化石墨烯/苯硼酸的复合物于丝网印刷电极测试系统(1)的样品池(2)中，再加入5uL饱和硫酸钠溶液作为电解液，利用电化学循环伏安法对印刷电极进行特异性修饰，电压范围为-1.2V至+1.2V，扫描步径为50mV/s，扫描圈数为40圈，至此得到修饰了还原氧化石墨烯/苯硼酸的印刷电极，结果如图5，相较于图4只有硫酸钠存在的条件可知，0.7V附近出现的电流峰是由于氧化石墨烯的存在而产生的，与此同时可以观察到在0.7V附近处有一明显的还原峰出现，且随着反应的进行，峰电流逐渐减小，说明氧化石墨烯在逐渐被还原成石墨烯；

(3.3)其中印刷电极的对电极接口(10)、工作电极接口(11)、参比电极接口(12)分别接到电化学阻抗测试工作站(13)的测试对电极接口(14)、测试工作电极接口(15)、测试参比电极接口(16)，在显示器(18)中可以实时观察检测结果；

(3.4)为探究一步法电化学还原沉积于物理沉积的效果对比以及还原氧化石墨烯与氧化石墨烯在电子传递中效果对比，5uL的氧化石墨烯/苯硼酸复合物直接滴涂在碳工作电极(4)的表面上，在室温干燥24h，得到氧化石墨烯/苯硼酸修饰了的印刷电极，图6可以看出，还原氧化石墨烯/苯硼酸修饰的电极表面粗糙，更有利于检测物质吸附，相比之下，图7氧化石墨烯/苯硼酸修饰的电极表面比较平整，稳定性差，易产生大块脱落现象，修饰不稳固；如图8所示，修饰后的电极，电阻相较于修饰前大大减小，降低了基础阻抗值，提升了电极检测的灵敏性。

(4)葡萄糖特异性检测，具体包括以下子步骤：

(4.1)标准溶液制配：配制浓度分别为0.1mM,0.2mM,0.5mM,1.0mM,2.0mM,5.0mM,10.0mM,20.0mM和50mM的葡萄糖标准溶液，溶剂为去离子水；

(4.2)葡萄糖电化学阻抗检测：使用步骤(3.2)得到的修饰了还原氧化石墨烯/苯硼酸的印刷电极，将5uL的0.1mM的葡萄糖标准溶液滴加在丝网印刷电极测试系统(1)的样品池(2)中，利用电化学阻抗检测方法对该浓度下对应的阻抗图谱进行检测；0.2mM,0.5mM,1.0mM,2.0mM,5.0mM,10.0mM,20.0mM和50mM浓度的葡萄糖阻抗检测同上；

(4.3)为探究苯硼酸对葡萄糖特异性检测的影响，利用(3.1)中提及的一步法还原沉积修饰电极的方法，单纯取5uL氧化石墨烯溶液，滴加在丝网印刷电极测试系统(1)的样品池(2)中，再加入5uL饱和硫酸钠溶液作为电解液，利用电化学循环伏安法对印刷电极进行特异性修饰，电压范围为-1.2V至+1.2V，扫描步径为50mV/s，扫描圈数为40圈，至此得到单纯修饰了还原氧化石墨烯的印刷电极，并利用该电极，参照(4.2)的检测方法对0.1mM,0.2mM,0.5mM,1.0mM,2.0mM,5.0mM,10.0mM,20.0mM和50mM的葡萄糖标准溶液分别进行测试；阻抗图谱结果如图20所示，数据提取结果如图21所示，可以看出单纯还原氧化石墨烯修饰的电极对葡萄糖的检测并不具有特异性，因此可以排除还原氧化石墨烯对实验结果的影响。

(4.4)葡萄糖特异性检测：配制浓度均为10mM的氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、氯化钙(CaCl₂)、谷氨酸(Glutamic acid)、半胱氨酸(Cysteine)、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、抗坏血酸(Ascorbic acid)、多巴胺(Dopamine)以及尿素(Urea)；使用(3.1)还原氧化石墨烯/苯硼酸修饰好的印刷电极，分别取上述溶液5uL加入加在丝网印刷电极测试系统(1)的样品池(2)中，利用电化学阻抗检测方法对该物质对应的阻抗图谱进行检测；图23的统计结果可以展示出该还原氧化石墨烯/苯硼酸修饰的电极在对葡萄糖的检测具有良好的特异性。

(4.5)数据处理：按照等效电路，提取电极表面的转移电阻R_ct的值，对阻值数据进行归一化处理，得到归一化处理结果NIC与葡萄糖浓度的标准曲线；归一化的具体计算公式：NIC＝(Z_a-Z_b)/Z_b，其中Z_a代表葡萄糖溶液测试结果，Z_b代表将去离子水作为待测溶液的空白对照结果；图9、10、11展示了系统的等效电阻模型；图12为还原氧化石墨烯/苯硼酸修饰好的印刷电极对不同浓度葡萄糖检测的阻抗图谱；图13是提取提取电极表面的“Rct(转移电阻)”的值在不同浓度下的值；

(4.6)将待测浓度的葡萄糖溶液根据步骤(4.2)得到阻抗图谱，根据步骤(4.3)得到阻值数据的归一化处理，带入步骤(4.3)建立的标准曲线中，得到待测葡萄糖溶液的浓度。图14是阻抗归一化结果，可以看出该还原氧化石墨烯/苯硼酸修饰的电极在0.1—50mM浓度范围的葡萄糖检测具有良好的线性，浓度与归一化阻抗处理结果NIC之间的关系式为y＝0.7448x+0.7320，R2＝0.9577，检测下限为0.03mM；图15是氧化石墨烯/苯硼酸未经过一步法还原沉积，而是通过滴涂法修饰印刷电极用于葡萄糖阻抗检测的结果，从图16、和图17可以看出，滴涂法不稳定，在高浓度葡萄糖检测的过程中极易出现大片脱落现象，浓度与归一化阻抗处理结果NIC之间的关系式为y＝0.0586x+0.1225，R2＝0.8737，与图14的结果相比，检测灵敏度低，通过图18的对比可以明显看出，还原氧化石墨烯/苯硼酸修饰的电极相比于氧化石墨烯/苯硼修饰的电极，具有基础阻抗低，检测灵敏度高等优点，具体阻值对比可参看图19的统计结果；待测葡萄糖溶液的归一化处理结果NIC为14.57，带入图14的关系式y＝0.7448x+0.7320中，计算出葡糖糖溶液的浓度为11.58mM，与实际浓度12mM相比误差率为3.5％，小于5％，说明该测试系统具有良好的准确性。