一种用于同时检测丙酸钠（钙）和双乙酸钠的方法与流程

本发明涉及食品检测领域，尤其涉及一种用于同时检测丙酸钠(钙)和双乙酸钠的方法。

背景技术：

食品添加剂的使用在加工食品和方便食品中的应用已经越来越广泛。加工食品，如蚝油、酱油、鱼露在制作过程中添加防腐剂以抑制微生物生成，维持营养价值和其他特性，进而延长食品保质期。然而，非法添加和过量添加防腐剂会使消费者有过敏反应和慢性中毒风险。因此，《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》(GB 2760—2014)规定了所有防腐剂的最大允许添加浓度。

蚝油、酱油、鱼露是人们餐桌上倍受欢迎的调味品。丙酸钠(钙)、双乙酸钠作为化学防腐剂，被广泛应用于糕点、酱油等食品中。GB 2760—2014中规定，丙酸及其钠盐、钙盐在酱油中的最大允许使用量为2.5g/kg，而蚝油、鱼露中不得使用；双乙酸钠在蚝油、酱油和鱼露中的最大使用量均为2.5g/kg。食品中丙酸的检测方法有气相色谱法和高效液相色谱法等。双乙酸钠的检测方法高效液相色谱法和离子色谱法等。林清河等、吴忠兴等和项林敏等报道了高效液相色谱同时测定糕点中丙酸钠(钙)和双乙酸钠的方法。向文娟等报道了全自动固相萃取(SPE)-HPLC法测定食品中的丙酸钠(钙)和双乙酸钠。朱洪亮等报道了高效液相色谱同时测定食品中丙酸钠(钙)和双乙酸钠的方法。李敏等报道了高效液相色谱法同时测定苍山蒜米中双乙酸钠和丙酸钙含量。2014年9月29日，我国收到了韩国通报的厦门某企业蚝油检测出丙酸的不合格食品信息，我国食品安全国家标准GB2760也规定蚝油中不得使用丙酸，但有关蚝油等食品中丙酸钠(钙)和双乙酸钠含量的检测方法尚未见报道。

GB/T 5009.120—2003、GB/T 23382—2009及GB/T 23383—2009中有关丙酸钠(钙)和双乙酸钠含量检测的蒸馏法均是称取25g样品于500mL蒸馏瓶中，蒸馏至250mL容量瓶中，最终定容体积为250mL。该检测方法需样品量大，定容体积较大，且较为费时。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种快速、简便、准确、实用的可同时用于检测丙酸钠(钙)和双乙酸钠的方法。

为实现上述目的，本发明提供一种用于同时检测丙酸钠(钙)和双乙酸钠的方法，其特征在于，包括以下步骤，

样品处理：准确称取待测样品于凯氏定氮蒸馏装置中，加入1～3mL0.5～3mol/L的磷酸溶液，进行水蒸气蒸馏，蒸馏液经过冷凝后，用比色管作为接收装置，待蒸馏出23.5-24.5mL馏出液时停止接收，用0.5～3mol/L的磷酸溶液调馏出液的pH值至2.7-3.5，加水定容至25ml，摇匀；再经0.22～0.45μm微孔滤膜过滤得到滤过液；调节馏出液的pH值为2.7-3.5，在此pH值范围内，丙酸钠(钙)和双乙酸钠可完全转化为丙酸和乙酸进行检测；

HPLC：将上述所得滤过液进行HPLC；

检测方法：根据丙酸的线性方程y1＝284.58x1+0.210，其中x1为丙酸的质量浓度，y1为丙酸的峰面积；即可计算出样品中丙酸的质量浓度；

根据双乙酸钠的线性方程y2＝236.24x2+0.298，其中x2为双乙酸钠的质量浓度，y2为双乙酸钠的峰面积；即可计算出样品中双乙酸钠的质量浓度。

进一步，所述样品处理中，准确称取待测样品5.00g于凯氏定氮蒸馏装置中。

进一步，所述HPLC的条件为，色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm×5μm或等效色谱柱；柱温：20～40℃；流动相为1.5g/L磷酸二氢铵溶液，溶剂为甲醇和水的混合液，用0.5～3mol/L磷酸溶液调节pH至2.7～3.5；流速：0.5～2mL/min；进样量：10～20μL。

进一步，所述HPLC步骤中，溶剂为体积比5:95～10:90的甲醇和水的混合液。

进一步，所述HPLC步骤中，溶剂为体积比10:90的甲醇和水的混合液。

进一步，所述待测样品为蚝油、酱油或鱼露。

本发明参考国标规定方法，以蚝油、酱油和鱼露为基质，首次采用凯氏定氮蒸馏装置，利用高效液相色谱技术，建立了可同时检测蚝油、酱油和鱼露中丙酸钠(钙)和双乙酸钠的方法，需用样品量仅为5g，定容体积为25mL(样品量大大减少，定容体积也大大减小。因为是水蒸气蒸馏，定容体积减小意味着节约能量和时间)。该方法首次在丙酸钠(钙)和双乙酸钠含量检测中运用凯氏定氮蒸馏装置，快速、简便、准确、实用。

蚝油是一种风味独特的调味品，它具有天然的海产品风味、鲜美浓郁的滋味，而且使用方便，营养丰富，富含Ca、Fe、Zn、Se等微量元素。酱油是人们生活中常用的调味品之一，而且它除了调味作用外，还具有抗氧化等营养保健作用。鱼露富含多种氨基酸以及Cu、Cr、Zn、I等微量元素，不仅有独特的海鲜风味，还有抗氧化、降血压、降低胆固醇等功能特性。蚝油、酱油、鱼露都是人们餐桌上倍受欢迎的调味品，而其中食品添加剂含量的检测和监控是保障食品安全的重要途径。本发明首次结合凯氏定氮蒸馏装置，建立了可同时检测蚝油、酱油和鱼露中丙酸钠(钙)和双乙酸钠含量的高效液相色谱法。

本研究以蚝油、酱油和鱼露为基质，参考国标规定方法，并结合本实验室对分析方法的验证经验，方法学验证指标包括流动相的确定、目标物蒸馏体积的确定、线性方程、定量限、准确度和精密度。本发明比较了不同的流动相，最终选定甲醇-水(10/90，v/v)作为溶剂流动相，双乙酸钠和丙酸钠出峰时间分别为4.91和10.18min，基线平稳，峰型和出峰时间稳定；同时，比较了四种馏出液体积，最终确定馏出液体积为25mL，丙酸钠(钙)和双乙酸钠的回收率可分别达到100.3％和98.2％。本方法的检出限为0.010g/kg，定量限为0.025g/kg；在三种基质中，丙酸钠(钙)(以丙酸计)和双乙酸钠的回收率分别为88.5％～108.3％和86.5％～108.7％，相对标准偏差为2.13％～6.42％和2.02％～6.37％，均能满足丙酸钠(钙)和双乙酸钠的检测需要。

综上所述，本方法极大节约了样本处理时间，基质干扰少，操作简便；方法的线性关系良好、回收率高、定量限低、重复性好；实用性强，可同时适用于蚝油、酱油和鱼露等食品中丙酸钠(钙)和双乙酸钠含量的测定。

附图说明

图1是实施例2中丙酸和双乙酸钠标准品色谱图。

图2是实施例3中丙酸、双乙酸钠馏出液体积与回收率图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

以下实施例所用仪器：Agilent 1260液相色谱仪，配有DAD检测器；德国赛多利斯电子天平，感量0.1mg和0.01g；凯氏定氮蒸馏装置。

以下实施例中的丙酸钠可以被丙酸钙替代。

方法：

样品处理：准确称取试样于凯氏定氮蒸馏装置中，加入1mL 1mol/L的磷酸溶液，进行水蒸气蒸馏，蒸馏液经过冷凝后，用25mL比色管作为接收装置，待蒸馏出约24mL时停止接收，用1mol/L的磷酸溶液调pH值至2.7-3.5左右，加水定容至25ml，摇匀。经0.22μm微孔滤膜过滤后，供HPLC测定。

HPLC：色谱柱：Sapphire C18(250mm×4.6mm×5μm)，柱温：30℃；流动相为1.5g/L磷酸二氢铵溶液(溶剂为甲醇-水的混合液)，用1mol/L磷酸溶液调节pH至2.7～3.5；流速：1mL/min；进样量：10μL。

实施例1：标准混合溶液配制

丙酸钠标准储备液的制备：准确称取1.3g(精确至0.0001g)丙酸钠，用水定容至100mL，配制成相当于含10mg/mL丙酸的丙酸钠标准储备液。

双乙酸钠标准储备液的制备：准确称取1.0g(精确至0.0001g)双乙酸钠，用水定容至100mL，配制成10mg/mL的双乙酸钠标准储备液。

依次吸取0.0125、0.05、0.125、0.5、1.25、2.5mL丙酸钠及双乙酸钠标准储备液于凯氏定氮蒸馏装置，加入1mol/L的磷酸溶液1mL，蒸馏出约24mL时，用1mol/L的磷酸溶液调pH值至3左右，定容至25mL。得到丙酸钠(相当于丙酸)、双乙酸钠的混合工作液浓度分别为0.005、0.02、0.05、0.2、0.5、1.0mg/mL。经过0.22μm微孔滤膜过滤，浓度由低到高进样，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。得到：丙酸的线性方程为y＝284.58x+0.210，双乙酸钠的线性方程为y＝236.24x+0.298。线性方程的线性相关系数均为0.9999。

实施例2：流动相的确定

HPLC条件：

色谱柱：Sapphire C18(250mm×4.6mm×5μm)，柱温：30℃；流动相为1.5g/L磷酸二氢铵溶液(溶剂为以下三种溶剂)，用1mol/L磷酸溶液调节pH至2.7～3.5；流速：1mL/min；进样量：10μL。所述三种溶剂是：水、甲醇-水(10/90，v/v)、甲醇-水(15/85，v/v)。

称取1.5g磷酸氢二铵分别于1L上述三种溶剂中，用1mol/L磷酸溶液调节至pH值至2.7～3.5。分别用这三种流动相来分离丙酸和双乙酸钠。

试验结果表明：使用纯水做流动相，对色谱柱的伤害较大，丙酸的出峰时间较晚，且峰比较宽。使用甲醇-水(15/85，v/v)作为流动相，双乙酸钠的峰出峰时间过早，受基质干扰较大，且由于选用214nm波长作为检测波长，有机相比例过高后基线不平。使用甲醇-水(10/90，v/v)作为溶剂的流动相，结果如图1所示，双乙酸钠和丙酸钠出峰时间分别为4.91和10.18min。基线平稳，峰型和出峰时间稳定。

实施例3：目标物馏出液体积的确定

取市售蚝油空白试样5.00g，其中丙酸及双乙酸钠加标的浓度均为1.0g/kg，空白试样中的丙酸钠(钙)和双乙酸钠，经磷酸酸化转化成丙酸和乙酸，再经过水蒸气蒸馏，冷凝管冷却后，用比色管接收馏出液。本实验对馏出液体积进行了优化：每个蒸馏体积均平行6组试验，见图2。由图2可知，丙酸及双乙酸钠的回收率随着馏出液体积的增加而增大，馏出液体积为10mL时，丙酸钠(钙)和双乙酸钠的平均回收率仅有50.2％(RSD＝3.2％，n＝6)和52.1％(RSD＝4.3％，n＝6)；馏出液体积为15mL时，丙酸钠(钙)和双乙酸钠的平均回收率仅有74.3％(RSD＝2.5％，n＝6)和71.9％(RSD＝4.1％，n＝6)；馏出液体积为20mL时，丙酸钠(钙)和双乙酸钠的平均回收率为92.1％(RSD＝4.1％，n＝6)和94.5％(RSD＝3.1％，n＝6)；当馏出液体积达到25mL时，丙酸钠(钙)和双乙酸钠的回收率平均分别为100.3％(RSD＝2.0％，n＝6)和98.2％(RSD＝2.5％，n＝6)。因此，选取蒸馏体积为25mL为最终定容体积。

实施例4：方法的线性回归方程及定量限

取丙酸钠(钙)(以丙酸计)、双乙酸钠质量浓度0.005、0.02、0.05、0.2、0.5、1.0mg/mL的6个混合标准溶液，按照浓度由低到高依次进样，以各自的质量浓度为横坐标(g/mL)，峰面积为纵坐标，得到线性回归方程，丙酸的线性方程为y＝284.58x+0.210，双乙酸钠的线性方程为y＝236.24x+0.298。线性方程的线性相关系数均为0.9999，丙酸钠(钙)(以丙酸计)、双乙酸钠在0.005～1.000mg/mL的线性范围内呈现良好的线性关系。以3倍信噪比(S/N＝3)对应的目标物浓度为检出限，以10倍信噪比(S/N＝10)对应的目标物浓度作为定量限，获得两种物质的仪器检出限均为0.002mg/mL，仪器定量限均为0.005mg/mL。仪器的检出限和定量限，再乘以定容体积(25mL)，除以样品质量(5.00g)，得到方法的可能检出限为0.010g/kg，可能定量限为0.025g/kg。取阴性样品(即不含有丙酸钠和双乙酸钠的样品)，加入丙酸钠和双乙酸钠，使样品中丙酸钠(以丙酸计)和双乙酸钠的浓度为0.010g/kg，按照实验方法处理样品，测得目标物信号的信噪比大于3。取阴性样品(即不含有丙酸钠和双乙酸钠的样品)，加入丙酸钠和双乙酸钠，使样品中丙酸钠(以丙酸计)和双乙酸钠的浓度为0.025g/kg，按照1.4实验方法处理样品，测得目标物信号的信噪比大于10。从而确定方法的检出限为0.010g/kg，定量限为0.025g/kg。

本实验建立方法与国标方法(GB/T 23382-2009和GB/T 23383-2009)对比如表1所示。本实验建立方法，可同时检测丙酸和双乙酸钠两个项目，而GB/T 23382-2009和GB/T 23383-2009只可分别单独检测丙酸和双乙酸钠项目。本检测方法需要样品量仅为5.00g，最终定容体积为25mL，与国标检测方法相比，所需样品量减少且定容体积减小；同时，单个样品水蒸气耗费时间也缩短至仅需10min。本检测方法的回收率能与国标方法保持一致，均在86.5％以上；方法定量限方面，丙酸由0.10g/kg精确至0.025g/kg，双乙酸钠由0.05g/kg精确至0.025g/kg。

表1 本实验建立方法与国标方法比对表

实施例5：方法的准确度和精密度

分别对蚝油、酱油及鱼露等进行添加回收试验，其中蚝油为阳性样品，丙酸的检出量为0.132g/kg，其余两种为阴性样品。按照优化的色谱条件、本方法的蒸馏方法进行加标回收试验。加标浓度选取3个浓度：最低浓度选取定量限附近浓度0.030g/kg；第二个浓度选取最大允许使用量浓度2.5g/kg；第三个浓度为线性范围外浓度6.0g/kg(定容后的蒸馏溶液稀释一倍后用仪器检测)。称取100g样品3份，分别加入3.9mg丙酸钠和3.0mg双乙酸钠、324.3mg丙酸钠和250.0mg双乙酸钠以及778.4mg丙酸钠和600.0mg双乙酸钠，充分溶解，使样品中丙酸和双乙酸钠的加标浓度为0.030g/kg、2.5g/kg和6.0g/kg。分别准确称取加标试样5.00g(精确到0.01g)于凯氏定氮蒸馏装置中，按照1.4实验方法处理测定，每个浓度重复六次平行实验，准确度和精密度结果见表2。由表2可知，三种基质中，丙酸钠(钙)(以丙酸计)和双乙酸钠的回收率分别为88.5％～108.3％和86.5％～108.7％，相对标准偏差为2.13％～6.42％和2.02％～6.37％。本方法的回收率高，精密度好，能够满足丙酸钠(钙)和双乙酸钠的检测需要。

表2 丙酸钠(钙)(以丙酸计)、双乙酸钠回收率及相对标准偏差(RSD)(n＝6)表

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。