一种流式细胞仪层流稳定性评估方法与流程

本发明涉及微球测速统计分析领域，具体涉及流式细胞仪的流动室内层流稳定性评估领域。

背景技术：

流式细胞仪是一种对悬液中处于高速、直线流动的单细胞或其他颗粒，通过检测散射光信号和(或)荧光信号，实现高速逐一多参数定量分析的临床检验分析仪器。其中，液路系统的主要目的是使包含被测样品(细胞或微球)的样本液在鞘液的包裹下，形成稳定的层流，从而达到获取单细胞流的目的。液路系统的稳定性将直接影响细胞/微球通过流动室检测区域的位置及时间，进而影响相应散射光及荧光信号的信号强度及光脉冲持续时间。对液路系统稳定性进行评估，尤其是对细胞/微球通过流动室检测区域时的速度稳定性进行评估，可以实现对整台仪器稳定性的快速预判。

目前，流式细胞仪液路系统稳定性的判定方法主要有压力法和脉冲信号特征分析法。压力法是指通过对液路系统中最关键的样本液压力和鞘液压力进行观测，并且针对不同的检测速率要求，两者变化幅度在一定范围之内就可判定液路系统稳定。但是，压力法是对作用于样本液和鞘液的气体压力进行检测，而不是直接对液体流速进行检测，所以无法衡量后续进样结构及管路对层流及细胞/微球速度的影响。脉冲信号特征分析法是指通过数据采集模块对细胞经过流动室检测区域时产生的散射光及荧光信号进行检测，利用得到的脉冲宽度的稳定性来表征细胞速度的稳定性。该方法需要完成细胞/微球的散射光激发、收集、光电转换、脉冲处理和参数提取等一系列操作，涉及到光路系统、电子电路处理系统，从而增加了测量过程的不确定因素，无法真实反映细胞/微球在流动室内的流动情况。

高精度的流场特性分析方法主要是粒子图像测速法(Particl image velocimetry,PIV),其速度测量依赖于散布在流场中的示踪粒子，通过测量示踪粒子在已知很短时间间隔内的位移来间接地测量流场的瞬时速度分布，并可提供丰富的流场空间结构以及流动特性。然而，PIV技术用于液体流场分析所使用的微球尺寸与流式细胞仪检测样本尺寸相近，从而无法利用多示踪粒子对流动室内层流及单细胞流的流动特性进行分析。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种流式细胞仪层流稳定性评估方法，所述方法包括以下步骤：1)利用高速显微图像采集系统对流动室内微球的90°Mie散射光进行检测；2)利用灰色聚类分析方法对采集到的大量图像中光强/拖尾长度不足、正常、衍射及重叠等情况进行聚类分析，获得标准的正常拖尾图像，具体实现步骤如下：设有n个观测对象，m个评估指标，s个不同的灰类，则每个观测对象有m个特征数据需要观测，可得序列如式(1)所示：

X₁＝(x₁(1),x₁(2),…,x₁(n))

X₂＝(x₂(1),x₂(2),…,x₂(n))

……

X_m＝(x_m(1),x_m(2),…,x_m(n)) (1)

确定灰类1,2,…,s的中心点λ₁,λ₂,...,λ_s，将各个指标的取值范围也相应地划分为s个灰类；将灰类向不同方向进行延拓，考虑增加0灰类和s+1灰类，并确定其中心点λ₀和λ_s+1，从而得到新的中心点序列：λ₀,λ₁,λ₂,...,λ_s,λ_s+1，连接点(λ_k,1)与第k-1个小灰类的中心点(λ_k-1,0)，连接点(λ_l,1)与第l+1个小灰类的中心点(λ_l+1,0)，得到j指标关于k灰类的梯形白化权函数对于指标j的一个观测值x，可由

计算出其属于灰类k(k＝1,2,…s)的隶属度计算对象i(i＝1,2,…,n)关于灰类k的综合聚类系数

其中，为j指标k子类白化权函数，η_j为指标j在综合聚类中的权重，

由判断对象i属于灰类k*；

3)利用中点法确定拖尾边界，并计算相应的微球流速；4)利用微球流速的稳定性表征流式细胞仪液路系统的稳定性。

优选地，所述步骤2)中进行聚类分析的指标按照如下方式确定：

分别对图像中光强/拖尾长度不足、正常、衍射及重叠这四类图像中每一行像素点的灰度值求和，得到横向灰度总和曲线；对横向灰度总和曲线求解一阶导数；设定正负向阈值，并对阈值范围内的极值点个数进行统计，有效极值点个数作为聚类分析的指标；

分别对图像中光强/拖尾长度不足、正常、衍射及重叠这四类图像中每一列像素点的灰度值求和，得到纵向灰度总和曲线；对纵向灰度总和曲线求解一阶导数；设定正负向阈值，并对曲线经过正负阈值的次数进行统计，与正负阈值的交点个数可作为聚类分析的指标。

优选地，所述步骤3)中微球流速由公式v＝l/t求得，其中l为微球拖尾长度，t为相机曝光时间。

优选地，所述步骤4)还包括由公式计算标准差，利用拖尾长度的平均值对微球速度进行表征，并利用拖尾长度的标准差对微球速度的稳定性进行评估。

应当理解，前述大体的描述和后续详尽的描述均为示例性说明和解释，并不应当用作对本发明所要求保护内容的限制。

附图说明

参考随附的附图，本发明更多的目的、功能和优点将通过本发明实施方式的如下描述得以阐明，其中：

图1为高速图像采集微球测速原理图；

图2为微球拖尾图像；

图3为横向灰度总和曲线：图3(a)正常灰类；图3(b)长度不足灰类；图3(c)重叠灰类；

图4为横向灰度总和导数曲线：图4(a)正常灰类；图4(b)长度不足灰类；图4(c)重叠灰类；

图5纵向灰度总和曲线：图5(a)正常灰类；图5(b)长度不足灰类；图5(c)重叠灰类；

图6为纵向灰度总和导数曲线：图6(a)正常灰类；图6(b)长度不足灰类；图6(c)重叠灰类；

图7为列元素灰度值上升沿曲线图；

图8为列元素灰度值下降沿曲线图。

具体实施方式

通过参考示范性实施例，本发明的目的和功能以及用于实现这些目的和功能的方法将得以阐明。然而，本发明并不受限于以下所公开的示范性实施例；可以通过不同形式来对其加以实现。说明书的实质仅仅是帮助相关领域技术人员综合理解本发明的具体细节。

在下文中，将参考附图描述本发明的实施例。在附图中，相同的附图标记代表相同或类似的部件，或者相同或类似的步骤。

本发明提供了一种流式细胞仪的流动室内层流稳定性评估的方法，该方法利用高速显微图像采集系统对流动室内微球的90°Mie散射光进行检测，并利用灰色聚类分析方法对采集到的大量图像中光强/拖尾长度不足、正常、衍射及重叠等情况进行聚类分析，获得标准的正常拖尾图像。然后，利用中点法确定拖尾边界，并计算相应的微球流速。最后，利用微球流速的稳定性表征流式细胞仪液路系统的稳定性。

本发明选取90°侧向散射光作为观测对象可以避免激发光源的直射光干扰，并且去除传统显微图像采集的背景光源，从而减小背景光信息同时提高图像的对比度。当微球经过流动室激光激发区域时，通过改变高速相机的曝光时间可以对微球的拖尾图像进行采集，进而获得微球的流速。基于90°Mie散射的高速图像采集微球测速方法示意图如图1所示。

由于流式细胞仪每秒钟可以对数万个细胞进行检测，同时高速相机的曝光瞬间微球在流动室内的位置具有随机性，所以采集到的微球拖尾图像一般包括空白、正常、长度不足和重叠4种情况，如图2所示。

本发明采用基于梯形白化权函数的聚类分析方法对微球拖尾图像进行分类，其具体实现步骤如下：

设有n个观测对象，m个评估指标，s个不同的灰类。则每个观测对象有m个特征数据需要观测，可得序列如式(1)所示：

X₁＝(x₁(1),x₁(2),…,x₁(n))

X₂＝(x₂(1),x₂(2),…,x₂(n))

… …

X_m＝(x_m(1),x_m(2),…,x_m(n)) (1)

确定灰类1,2,…,s的中心点λ₁,λ₂,...,λ_s，将各个指标的取值范围也相应地划分为s个灰类。将灰类向不同方向进行延拓，考虑增加0灰类和s+1灰类，并确定其中心点λ₀和λ_s+1，从而得到新的中心点序列：λ₀,λ₁,λ₂,...,λ_s,λ_s+1，连接点(λ_k,1)与第k-1个小灰类的中心点(λ_k-1,0),连接点(λ_l,1)与第l+1个小灰类的中心点(λ_l+1,0)，得到j指标关于k灰类的梯形白化权函数对于指标j的一个观测值x，可由

计算出其属于灰类k(k＝1,2,…s)的隶属度计算对象i(i＝1,2,…,n)关于灰类k的综合聚类系数

其中，为j指标k子类白化权函数，η_j为指标j在综合聚类中的权重。

由判断对象i属于灰类k*。

本发明的一个实施例中激发光选用波长为605nm的激光二极管，功率为80mW；显微物镜为日本Sigma Koki公司的SPAHL-50,数值孔径为0.42，放大倍率50，工作距离20.5mm；图像采集系统使用Dantec公司的Q450高速图像采集系统，配套的高速CMOS相机为Vision research公司的V310,最大分辨率1280×800，最高速度为50万fps，最小快门时间1us，单个像素点的几何尺寸为20μm×20μm；检测样品使用Beckman Coulter公司的标准质控微球Flow-Check Pro Fluoro-spheres A69183，微球直径为20±1μm。曝光时间设置为40μm，利用流式细胞仪执行上样操作。层流状态稳定后开始进行图像采集，采样帧率设置为3300帧/s，采样图片总数设置为12000。

分别对4类图像中每一行像素点的灰度值求和，得到横向灰度总和曲线如图3所示。设定灰度值阈值为35，对阈值以上行的个数进行统计可作为聚类分析的指标。不足灰类由于在纵向存在灰度值渐变过程，其横向灰度总和曲线中上升沿为缓慢变化；正常灰类无纵向灰度渐变过程，故上升沿及下降沿变化较快；重叠灰类在纵向无渐变过程，但存在多条拖尾重叠的现象，故其上升沿与下降沿个数均大于1。对图3中曲线求解一阶导数，如图4所示。设定正向阈值为55，负向阈值为-50，并对阈值范围内的极值点个数进行统计。即当极值点的幅值大于55或小于-55时，作为有效极值点进行统计。不足、正常、重叠的有效极值点个数分别为1，2，4。有效极值点个数可作为聚类分析的指标。

如果不足灰类的拖尾长度严重不足或灰度值不足，可能造成有效极值点个数为0；重叠灰类有多种可能性，并且重叠灰类的拖尾数量、重叠位置、重叠方式等不确定，重叠灰类的有效极值点个数可以是大于2的其他整数。

同理，分别对4类图像中每一列像素点的灰度值求和，得到纵向灰度总和曲线如图5所示。设定灰度值阈值为200，对阈值以上列的个数进行统计可作为聚类分析的指标。不足灰类由于在纵向存在灰度值渐变过程，其纵向灰度总和的峰值较小；重叠灰类在纵向完全重叠的几率较低，故灰度值不为0的列数比正常情况要多。对图5中曲线求解一阶导数，如图6所示。设定正向阈值为150，负向阈值为-250，并对曲线经过正负阈值的次数进行统计。正常灰类的拖尾图像灰度分布相对均匀，故其纵向灰度总和一阶导数曲线具有单调增减特性，在正负阈值附近不存在抖动，与正负阈值的交点为4个。不足和重叠灰类的拖尾图像灰度分布存在渐变或跳变，在正负阈值附近存在抖动，故交点数不小于4。与正负阈值的交点个数可作为聚类分析的指标。

微球速度由公式v＝l/t求得，其中l为微球拖尾长度，t为相机曝光时间。为了保证对液路系统稳定性的准确评估，需要对拖尾灰度值的上升和下降过程进行分析，合理选择拖尾边界，减小微球拖尾长度的计算误差。

对正常图像的灰度值进行列求和，并以灰度值总和最大值为中心对称选择5列像素点。选取的5列像素点灰度值上升过程如图7所示。从图7可以看出，该5列元素在第303行之前的灰度值只有微小抖动，并基本保持平稳。从第304列到第309列，灰度值快速上升，并呈线性变化。同理，5列像素点灰度值的下降过程如图8所示。选取的5列像素点灰度值在第420列之前基本保持平稳，从第421列到第428列灰度值快速下降，并呈线性变化。

基于各列像素点灰度值快速线性变化的特性，本发明选用中点法对拖尾的边界进行确定。中点法是指选取灰度值与边缘变化过程的平均值最接近的像素点作为拖尾边界。以图7、8为例，上升过程5列像素点的灰度平均值为36.5、36.5、34、33.1和35与第307行像素点的灰度值(38、37、35、34和35)最接近，故将第307行作为拖尾的起始边界点；下降过程5列像素点的灰度平均值为33.2、31.7、31.2、31.4和27.4与第307行像素点的灰度值(32、30、30、31和27)最接近，故将第424行作为拖尾的起始边界点。

利用中点法确定正常图像的拖尾边界，计算拖尾长度所占像素点个数的平均值为116.9个，由公式计算标准差σ＝1.7。由于无法获取流动室内微球速度的真值，故可利用拖尾长度的平均值对微球速度进行表征，并利用拖尾长度的标准差对微球速度的稳定性进行评估，进而完成对流式细胞仪层流稳定性的评估。

结合这里披露的本发明的说明和实践，本发明的其他实施例对于本领域技术人员都是易于想到和理解的。说明和实施例仅被认为是示例性的，本发明的真正范围和主旨均由权利要求所限定。