乳及乳制品中抗氧化剂的超高效液相色谱‑四级杆静电场轨道离子阱质谱筛查方法与流程

本发明属于食品安全检测技术领域，特别涉及一种乳及乳制品中抗氧化剂的超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱筛查方法。

背景技术：

抗氧化剂为一种常用食品添加剂，有合成抗氧化剂和天然抗氧化剂之分。在乳及乳制品中添加适量的抗氧化剂，起到延缓乳脂肪变质，提高色泽与营养物质稳定性，延长储存期等作用。应用于乳及乳制品中的抗氧化剂主要有合成抗氧化剂叔丁基对羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)、没食子酸酯(PG)、特丁基对苯二酚(TBHQ)和天然性抗氧化剂荭草素(Orientin)、甘草甙(Liquiritin)、迷迭香酸(Rosmarinic acid)、齐墩果酸(Oleanic acid)等，均属于酚类抗氧化剂，苯环上的π电子云与氧原子上不成对单电子作用产生共轭作用，使得各成对电子部分分布于苯环上而并不固定在氧原子上，自由基能降低，形成稳定结构，不再引发自由基链式反应，起到抗氧化作用。

但是，某些抗氧化剂的不适当补充会诱发疾病，甚至增加人和动物的死亡几率，其有毒自由基在低浓度时可能产生毒物兴奋效应。另外，补充过量的抗氧化剂会淬灭这些对健康起到积极作用的自由基。因此，有必要对抗氧化剂的使用进行控制和监测。

然而，目前用于乳及乳制品中外源性风险物质的高通量、快速检测方法较少，前处理操作复杂，材料与设备成本高，仅限于几种或一类化合物的快速检测。乳及乳制品中外源性风险物质的高通量、快速筛查已成发展趋势。本发明针对上述现状，建立了抗氧化剂色谱质谱联用高通量、快速筛查分析方法。

技术实现要素：

本发明针对上述现状，提供了一种乳及乳制品中抗氧化剂的超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱筛查方法，该方法的主要优势为分辨率高、定性与定量结果准确、灵敏度高、质量精度高等，可应用于复杂基质的分析。

本发明是通过下述的技术方案来实现的：

一种乳及乳制品中抗氧化剂的超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱筛查方法，包括以下步骤：

1)利用QuEChERS方法对乳及乳制品的被测物样品进行提取和净化，得到被测物样品的测试溶液；

2)运用超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱仪对被测物样品进行筛查，采用电喷雾离子源和Full MS/dd-MS²，Full MS/vDIA，Full MS/AIF三种扫描模式，得到被测物样品完整的一级与二级质谱图；

3)通过软件对获得的一级与二级质谱图进行处理，提取出被测物样品中抗氧化剂化合物信息；

4)将抗氧化剂标准谱库中的抗氧化剂化合物信息与被测物样品的化合物信息进行比对，通过分析标准物质的色谱质谱信息进行最终判定结构与定量乳及乳制品中抗氧化剂的组成。

作为本发明的进一步改进，步骤1)具体为：分别称取乳及乳制品试样于具塞聚苯丙烯离心管中，加入体积比为1:99乙酸-乙腈混合溶液，涡旋混合后加入无水硫酸镁、陶瓷均质石、无水乙酸钠，涡旋后，振荡提取，然后将离心管置于离心机，离心处理后，移取上层溶液于预先加有C18、PSA及无水硫酸镁的离心管中，涡旋后以10000r/min离心，上层溶液经0.22μm有机系微孔膜过滤，取滤液至进样小瓶中，加入甲醇及8mmol/L甲酸铵水溶液。

作为本发明的进一步改进，步骤2)具体为：通过超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱的全扫描模式获得一级质谱图，提取离子流图进行定量，通过可变的数据非依赖采集vDIA模式扫描得到二级质谱图。

作为本发明的进一步改进，步骤3)具体为：通过分析二级质谱图得到的碎裂片段数据，初步判断该物质归属类别，继而对该保留时间色谱峰的其他片段信息进行分析，包括质荷比、片段丰度比与同位素丰度比，从而推断出该物质结构和元素组成。

作为本发明的进一步改进，步骤4)中的标准谱库是按照以下步骤建立的：

1)配制抗氧化剂标准品的标准溶液；

2)运用超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱仪对抗氧化剂标准品的标准溶液进行筛查，采用电喷雾离子源和Full MS/dd-MS²，Full MS/vDIA，Full MS/AIF扫描模式，得到标准溶液完整的一级与二级质谱图；

3)通过软件对获得的一级与二级质谱图进行处理，提取出标准溶液的信息，建立抗氧化剂的标准谱库。

作为本发明的进一步改进，超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱仪的色谱条件为：

色谱柱：Accucore C-18aQ预柱，10mm×2.1mm，1.9μm，Hypersil Gold aQ C-18柱，100mm×2.1mm，1.9μm；柱温：35℃；流动相：A为体积百分数0.1％甲酸与4mmol/L甲酸铵的水溶液，流动相B为体积百分数0.1％甲酸与4mmol/L甲酸铵的甲醇溶液；

梯度洗脱程序：0min，100％A；1min，100％A；7min，0％A；12min，0％A；13min，100％A；13-15min，100％A；流速为300μL/min；进样量5-10μL；碰撞气：氩气；

电喷雾离子化离子源：单一正模式或负模式；鞘气流速：18-19L/min；鞘气压力：275Kpa；辅助气流速：3-4L/min；毛细管电压：负离子模式3000V，正离子模式3500V；离子源温度：230-250℃；毛细管温度：320-330℃。

作为本发明的进一步改进，超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱仪的质谱条件为：

采用Full MS/vDIA扫描模式，一级质谱扫描分辨率为70000FWHM；自动增益控制目标值设定为一百万；最大注入时间250ms；容许的质量误差范围为5ppm；动态背景扣除10.0s；

二级质谱扫描参数：扫描时间：0-15min；分辨率：17500FWHM；自动增益控制的目标值定为五十万；最大注入时间120ms；112.80116-487.97169为第一个vDIA，隔离窗口范围设为25.0Da，Loop Count16；550.50011-850.63654为第二个vDIA，动态背景扣除10.0s，隔离窗口范围设为100.0Da，Loop Count16；碰撞能量分别为17.5eV；35.0eV；52.5eV。

相对于现有技术，本发明具有以下优点：

本发明先通过QuEChERS方法对乳及乳制品样品进行提取和净化，然后采用超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱法检测乳及乳制品中抗氧化剂，最后通过标准谱库进行比对，最终判定结构与定量乳及乳制品中抗氧化剂的组成。本发明的筛选方法，可以一次性定量、定性检测多种物质(32种抗氧化剂)，并且具有操作简单，精度高、分辨率高、定性与定量结果准确、灵敏度高、质量精度高等优势，可应用于复杂基质的分析。尤其是，Q-Orbitrap(超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱仪)的分辨率高，在确保痕量化合物灵敏度下，分辨率可达7万；质量精度高，可以使用外标法，无需内标，长时间的质量精度不下降；灵敏度高，检测离子回旋共振的频率，并不需要额外的检测器；动态范围宽，达五个数量级；具有快速正负切换扫描模式，极大节省分析时间，提高分析通量；稳定性高，只需一周校正一次；定量能力高，可以和三重四极杆相比较；质量范围广，可进行多肽分析；另外，Q-Orbitrap的仪器操作简便，运行成本低，可应用于复杂基质的分析。结果表明：32种抗氧化剂在线性范围内具有良好的线性关系，相关系数均大于0.99，高(4×CCβ)、中(2×CCβ)、低(1×CCβ)三个添加水平下，基质的加标回收率达到87％-109％，重复实验6次，其相对标准偏差为0.3％-6.4％。确定限(CCα)和检测容量(CCβ)分别为0.0001μg/kg-3.6μg/kg与0.0012μg/kg-6μg/kg。

利用优化后的QuEChERS方法对乳及乳制品样品进行提取和净化，简单快捷，效率高，可以有效的排除其中杂质对后续检测的干扰。

【附图说明】

图1为同分异构体熊果酸(Ursolic acid)与齐墩果酸(Oleanic acid)全扫描与二级碎裂片段比对(加标浓度50mg kg^-1)；

图2为没食子酸丙酯(Propyl gallate)的提取流离子图。

【具体实施方式】

本发明提供了一种乳及乳制品中抗氧化剂的超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱筛查方法，其特征在于：该方法所用到的设备包括超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱仪。包括以下步骤：

首先，利用已优化的QuEChERS方法对乳及乳制品样品进行提取和净化；

其次，运用超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱(Q-Orbitrap)进行筛查，采用电喷雾离子源(ESI)和全扫描/数据依赖采集(Full MS/dd-MS²)，全扫描/可变的数据非依赖采集(Full MS/vDIA)，全扫描/全离子碎裂采集(Full MS/AIF)三种扫描模式，得到完整的一级与二级质谱图。

再次，运用Exact Finder 2.5软件对获得的一级与二级质谱图进行处理，提取出化合物信息。

最后，将已建立抗氧化剂谱库中的信息与被测物的信息进行比对，包括提取流色谱的保留时间，分子离子峰与其碎裂离子峰丰度比，分子离子峰与碎裂离子峰的精确质量数，分子离子峰与同位素离子峰丰度比，确证乳及乳制品中抗氧化剂的组成。

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细阐述，但本发明不限于该实施例。为了使公众对本发明有彻底的了解，在以下本发明优选实施例中详细说明具体的细节。

1.色谱质谱分析条件

主要仪器：美国Thermo Fisher Scientific公司的超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱，配有电喷雾离子源(ESI)。

(1)色谱条件

色谱柱：Accucore C-18aQ预柱(10mm×2.1mm，1.9μm，美国Thermo Fisher Scientific公司)，Hypersil Gold aQ C-18柱(100mm×2.1mm，1.9μm，美国Thermo Fisher Scientific公司)；柱温：35℃；流动相：A为0.1％(v/v)甲酸与4mmol/L甲酸铵水溶液，流动相B为0.1％(v/v)甲酸与4mmol/L甲酸铵甲醇溶液。梯度洗脱程序：0min，100％A；1min，100％A；7min，0％A；12min，0％A；13min，100％A，13-15min，100％A；流速为300μL/min；进样量5μL；碰撞气：高纯氩气(纯度≥99.999％)。电喷雾离子化(ESI)离子源：单一正模式或负模式；鞘气流速：18L/min；鞘气压力：275Kpa；辅助气流速：3L/min；毛细管电压：负离子模式3000V，正离子模式3500V；离子源温度：50℃；毛细管温度：320℃。

(2)质谱条件

采用Full MS/vDIA扫描模式。一级质谱扫描分辨率为70000FWHM；自动增益控制目标值设定为一百万；最大注入时间250ms；容许的质量误差范围为5ppm；动态背景扣除10.0s。

二级质谱扫描参数：扫描时间：0-15min；分辨率：17500FWHM；自动增益控制的目标值定为五十万；最大注入时间120ms；112.80116-487.97169为第一个vDIA，隔离窗口范围设为25.0Da，Loop Count16；550.50011-850.63654为第二个vDIA，动态背景扣除10.0s，隔离窗口范围设为100.0Da，L oop Count16。碰撞能量分别为17.5eV；35.0eV；52.5eV。

表1列出了32种抗氧化剂标准物质的电离模式与保留时间等信息；表2列出了32种抗氧化剂标准数据库部分内容。

表1 32种抗氧化剂标准物质信息

表2 32种抗氧化剂超高效液相色谱/四级杆-轨道离子阱质谱参数

2.溶液配制

(1)标准溶液的配制

分别称取适量的抗氧化剂标准品10mg(精确至0.1mg)，置于10mL于容量瓶内，依据标准物质在不同溶剂(甲醇、乙腈和甲苯)中溶解度与测定需要，选用合适的溶剂溶解，定容至10mL，配制成单一化合物标准储备液，于-20℃避光保存。移取单一化合物标准储备液于100mL容量瓶中，用甲醇-水溶液(1:1，v/v)稀释并定容至刻度，配制相应浓度的标准物质混合工作溶液。混标工作液于棕色密闭瓶-20℃避光保存。

(2)基质匹配溶液的配制

移取12份各5mL乳及乳制品空白样品(实验前测定)提取液于10mL容量瓶中，运用真空氮气吹干仪吹至近干，分别加入1000μg/L的抗氧化剂标准品混合溶液10μL、20μL、40μL、80μL、100μL、200μL、400μL、800μL、1000μL、2000μL、4000μL、5000μL于容量瓶中，各加入甲醇5mL，用8mmol/L甲酸铵水溶液稀释并定容至刻度，配制成1μg/L、2μg/L、4μg/L、8μg/L、10μg/L、20μg/L、40μg/L、80μg/L、100μg/L、200μg/L、400μg/L、500μg/L相应的基质匹配标准溶液。基质匹配标准溶液应现用现配。

3.样品的前处理

分别称取混匀巴氏杀菌乳、超高温瞬时灭菌乳、含乳饮料与发酵乳试样各15g(精确至0.01g)，于50mL具塞聚苯丙烯离心管中。加入10mL乙酸-乙腈(1:99，v/v)混合溶液，涡旋混合30s后加入6.0g无水硫酸镁(经马弗炉500℃灼烧4h，放置于干燥器中)、陶瓷均质石、1.52g无水乙酸钠，涡旋30s，振荡提取1min，将离心管置于离心机，4℃，以10000r/min离心5min，移取上层溶液8mL于预先加有404mg C18、410mgPSA及1.2g无水硫酸镁的离心管中，高速涡旋30s，以10000r/min离心5min，离心温度设置为4℃，上层溶液经0.22μm有机系微孔膜过滤，取200μL滤液至2mL进样小瓶中，加入300μL甲醇及500μL 8mmol/L甲酸铵水溶液。供超高效液相色谱-四级杆-轨道离子阱质谱进行测定。

4.分析结果

(1)方法的建立

运用超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱进行筛查，采用电喷雾离子源和Full MS/dd-MS²，Full MS/vDIA，Full MS/AIF扫描模式，通过超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱的全扫描模式获得一级谱图，提取离子流图进行定量，通过可变的数据非依赖采集vDIA模式扫描得到二级谱图。二级扫描在全扫描的基础上得到了更具针对性的碎裂片段数据，即可初步判断该物质归属类别，继而对该保留时间色谱峰的其他片段信息进行分析，包括质荷比、片段丰度比与同位素丰度比，从而推断出该物质结构和元素组成。将该物质推断的片段断裂途径与已建立的抗氧化剂标准信息谱库中归属类的其他化合物断裂途径比对，判断该化合物的分子式与结构式，通过分析标准物质的色谱质谱信息进行最终判定与定量。

(2)方法学验证

a方法的标准曲线、线性范围及相关系数

配制32种抗氧化剂系列混合标准物质溶液，浓度为0.1μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、2μg/kg、4μg/kg、8μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、40μg/kg、80μg/kg、100μg/kg、200μg/kg、400μg/kg、500μg/kg。结果表明，检测方法中32种抗氧化剂在其相应的浓度范围内，相关系数(r²)均大于0.99，呈良好的线性关系。

b方法的定量下限、加标回收率与精密度

CCα的测定采用校准曲线法，CCα等于能观察到响应时纵坐标轴上的浓度值加对应的重现性标准偏差的2.33倍。CCβ为CCα的值加CCα取值时重现性标准偏差的1.64倍。确定限(CCα)和检测容量(CCβ)分别为0.0001μg/kg-3.6μg/kg与0.0012μg/kg-6μg/kg。

精密度通过统计6次平行实验回收率结果的相对标准偏差得到，将待测物提取净化后，运用四级杆-轨道离子阱质谱检测，计算32种抗氧化剂的平均回收率与相对标准偏差。回收率与相对标准偏差结果分别为87％-109％和0.3％-6.4％，所建立的方法准确性和精密度良好。下述表3列出了巴氏杀菌乳中抗氧化剂的方法学参数。

表3巴氏杀菌乳中抗氧化剂的线性范围、确定限、检测容量、相关系数、平均回收率及精密度(n＝6)

本发明考察了Hypersil Gold系列中C18、C8和aQ3种不同选择性的超高效液相色谱柱(100mm×2.1mm，1.9μm)，最终选择了Accucore C-18aQ预柱，Hypersil Gold aQ C-18柱。

(3)阳性样品筛查定量结果

表4阳性样品筛查定量结果(n＝6)

注：No.3为巴氏杀菌乳样品。

图1可以看出，齐墩果酸(Oleanic acid)与熊果酸(Ursolic acid)保留时间分别为8.37min与8.39min，分子离子质荷比均为457.36762。碎裂片段相同，但丰度比不同，可以通过质荷比为203.17937与297.25735两个碎裂片段的响应强度相对丰度比进行区别与确证。图2为以没食子酸丙酯(Propyl gallate)的提取流离子图，色谱峰呈高斯分布，无拖尾与前伸，故定量准确。

本发明在实验中采用一针进样方式完成筛查过程中的筛选、确证、定量以满足高通量、快速分析的监控要求。筛选过程中，峰面积阈值设定为可变的数据非依赖采集扫描模式对分子离子峰碎裂阈值的响应强度8.3×10⁴，信噪比设定为国家标准中乳及乳制品中相关外源性物质质谱法测定的定量限规定值10，勾选已建立的乳及乳制品中抗氧化剂标准数据库，保留时间提取窗口设定为保留时间±3倍保留时间漂移标准偏差。提取色谱峰质荷比允许最大质量偏差设定为3ppm。当运用设定的保留时间与质荷比质量偏差提取窗口提取到响应强度大于等于8.3×10⁴色谱峰时，样品初步判断为阳性样品，进行下一步确证工作，若在上述条件下没有提取到色谱峰，初步判断样品为阴性。将初步判断为阴性的样品进行特征断裂片段的提取与分析，对未知目标物质进行筛查分析，进而得出结论。确证工作主要通过同位素离子峰信息与二级碎裂片段丰度比两个方面进行，并解决了同分异构体色谱共流出的确证难点，将具有M+1特征的¹³C，与具有M+2特征的³⁴S、⁸¹Br、³⁷Cl的同位素离子峰丰度比应用于确证步骤。

目前对于乳及乳制品中抗氧化剂高通量快速筛查技术的研究仍为空白。用于乳及乳制品中抗氧化剂残留的高通量、快速检测方法较少，前处理操作复杂，材料与设备成本高，仅限于几种或一类化合物的快速检测，多残留快速分析时往往根据化合物的结构特点将化合物分组后检测。近年来，QuEChERS广谱提取方法的应用和通过仪器联用使得乳及乳制品中外源性风险物质筛查分析技术迅速发展。本文针对上述现状，运用高分辨质谱四级杆静电场轨道离子阱质谱，并结合化学计量学对QuEChERS前处理条件优化与定量数据分析，针对与人们生活息息相关的巴氏杀菌乳、超高温瞬时灭菌乳、稀奶油、发酵乳与婴幼儿配方乳粉，建立了外源性风险物质色谱质谱联用高通量、快速筛查分析方法。

以乳及乳制品复杂基质为模型，建立了外源性风险物质已知目标物质筛查分析方法。以系统的方法学参数考察方案-欧盟标准2002/657/EC与SANCO/12571/2013，对运用超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱，建立的乳及乳制品中抗氧化剂的筛查分析方法进行考核，所有库内潜在目标化合物在线性范围内具有良好的线性关系，相关系数均大于0.99，高、中、低三个添加水平下，回收率达到87％-109％，重复实验6次，其相对标准偏差为0.3％-6.4％。确定限(CCα)和检测容量(CCβ)分别为0.0001μg/kg-3.6μg/kg与0.0012μg/kg-6μg/kg，优于中国、日本、美国和欧盟等国家和有关国际组织规定的限量要求，灵敏度与精确度较国标方法提高5倍以上。

以上仅为本发明的较佳实施例，并非仅限于此范围，凡依本发明专利范围的内容所做的等效变化和修饰，都应为本发明的技术范畴。