EV71病毒IgA抗体检测试纸条及其应用的制作方法

本发明涉及一种病毒检测试纸条及其应用，具体地涉及一种EV71病毒IgA抗体检测试纸条及其应用。

背景技术：

肠道病毒71型(简称EV71病毒)属小RNA病毒科肠道病毒属，无包膜的单股正链RNA病毒，是引起手足口病(hand-foot-mouth disease，HFMD)的主要病原体之一。EV71病毒可经空气飞沫等途径传播，具高致病性，常导致如无菌性脑膜炎、脑炎、脊髓灰质炎样麻痹及神经源性肺水肿等严重的中枢神经系统并发症，并引起死亡，目前没有有效的治疗药物，主要通过早期诊断及对症治疗的方式。EV71病毒主要感染6岁以下，特别是2-5岁的儿童，该年龄段儿童大多就读幼儿园，因此幼儿园是重点的EV71病毒预防单位，在手足口病流行季节，有必要对幼儿园进行筛查监控，减少EV71病毒在幼儿园的传播。传统的筛查手足口病主要是通过查看口腔疱疹和温度测试的方法排查手足口病，但是临床发现部分手足口患者早期没有明显的手、足、口腔疱疹症状或者发热现象，因此出现了后来的EV71病毒的早期诊断方法。

EV71病毒的早期诊断方法较多，主要涉及组织细胞培养技术、血清学、分子生物学三个领域技术，比较常用的有细胞分离培养、RT-PCR核酸分子检测和血清IgM抗体ELISA检测三种方法，但这些方法均存在一定的缺陷：

细胞分离培养是EV71病毒感染确定的金标准方法，但是由于检测时间长(超过5天)、实验条件要求高、操作人员技术要求高等缺点限制了其临床诊断应用。

RT-PCR核酸分子检测是EV71病毒早期检测方法中灵敏度最高的方法，通过检测患者咽喉部拭子和肛门拭子的EV71病毒判断感染情况，需要专业的技术人员和昂贵的荧光PCR扩增仪，基层医疗部门比较难开展该诊断方法。另外，在采集患者咽喉部细胞时，较容易引起患者不适造成反呕或者呕吐发生，给医务人员工作增加困难，同时也容易增加采样室病毒污染的风险。最后，EV71病毒感染患者后病毒在患者体内流转过程比较复杂，根据病情的发展病毒有时会在咽喉部细胞中可以检测咽拭子得到结果，有时会在肠道中可以通过检测肛拭子得到结果，有时候会同时在咽喉处和肠道中，但有时候病毒均不在咽喉处和肠道中，因此RT-PCR结果经常会有假阴性的结果。

血清学IgM抗体ELISA检测主要通过检测血清中EV71病毒IgM抗体了解患者近期感染病毒的情况，对临床诊治有一定的帮助，但是很多EV71病毒患者是小于6岁的儿童，较多幼童的血管较细，而且对抽血有恐惧感，因此给临床医护人员操作带来一定的难度。另外有相当部分的儿童二次感染EV71病毒，该群体在感染EV71病毒时产生较低浓度的EV71病毒IgM抗体，因此检测血清IgM抗体比较容易得到假阴性的结果。

胶体金免疫分析(Colloidal gold immunoassay，CGIA)产生于20世纪80年代，是继荧光标记、放射同位素标记和酶标记三大标记技术之后发展起来的固相标记免疫检测技术，现已应用到电镜、光镜、凝集试验、免疫印迹、斑点渗滤及免疫层析等方面，其中的胶体金免疫层析技术以其简单快速、特异灵敏、无需辅助试剂和仪器、肉眼观察结果、结果可长期保存等特点，成为当今最快速灵敏方便的免疫学检测技术之一，特别适用于医院、基层单位、野外作业以及时间紧迫的检查和大面积普查。

技术实现要素：

为了克服现有技术存在的问题，本发明提供了一种EV71病毒IgA抗体检测试纸条及其应用，能够实现EV71病毒的快速筛查。

本发明提供了一种EV71病毒IgA抗体检测试纸条，包括样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和背板，所述的硝酸纤维素膜设有EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段检测线和人IgA抗体对照线，所述的标记垫设有抗人IgA抗体-胶体金标记物。

进一步地，所述EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段的氨基酸序列如序列表Seq ID NO.1所示。

进一步地，所述抗人IgA抗体选自羊抗人IgA多克隆抗体、鼠抗人IgA单克隆抗体、兔抗人IgA单克隆抗体或兔抗人IgA多克隆抗体。

进一步地，所述吸水纸、硝酸纤维素膜、标记垫、样品垫依次粘附在所述背板上。

本发明还提供了另外一种EV71病毒IgA抗体检测试纸条，包括样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜、吸水纸、背板，所述的硝酸纤维素膜设有抗人IgA抗体检测线和EV71病毒VP1蛋白抗体对照线，所述的标记垫设有EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段-胶体金标记物。

进一步地，所述EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段的氨基酸序列如序列表Seq ID NO.1所示。

进一步地，所述的抗人IgA抗体选自羊抗人IgA多克隆抗体、鼠抗人IgA单克隆抗体、兔抗人IgA单克隆抗体或兔抗人IgA多克隆抗体；所述的EV71病毒VP1蛋白抗体选自鼠抗EV71病毒VP1蛋白单克隆抗体、人抗EV71病毒VP1蛋白多克隆抗体、兔抗EV71病毒VP1蛋白单克隆抗体、兔抗EV71病毒VP1蛋白多克隆抗体或羊抗EV71病毒VP1蛋白多克隆抗体。

进一步地，所述吸水纸、硝酸纤维素膜、标记垫、样品垫依次粘附在所述背板上。

本发明的EV71病毒IgA抗体检测试纸条可用于唾液中的EV71病毒检测，检测步骤为：取唾液样品，加入样品稀释液中，然后放入所述的EV71病毒IgA抗体检测试纸条进行检测。

进一步地，所述的样品稀释液为含有0.5％牛血清白蛋白、0.2％酪蛋白、1％胰蛋白胨和0.02％叠氮钠的PBS缓冲液。

EV71病毒衣壳由VP1、VP2、VP3和VP4四种蛋白质组成，其中VP1蛋白位于病毒粒子表面，其由297个氨基酸组成，是EV71病毒主要的中和性抗原表位，能刺激机体产生高滴度的保护性中和抗体。当EV71病毒通过口腔侵入人体，开始会在人咽喉处细胞中定植和繁殖，这时人体免疫系统率先启动粘膜免疫对病毒进行免疫攻击，粘膜免疫通过唾液产生病毒特异性的IgA抗体抵抗病毒侵染。

本发明的EV71病毒IgA抗体检测试纸条，通过检测唾液样品中的IgA抗体，能够实现EV71病毒的快速筛查，并能提高检测结果的可靠性，减少假阴性的情况。该检测方法操作简单，结果快速，检测样品的采集无侵入性，避免了传统的采血和采集咽拭子、肛拭子、脑脊液带来的不适和交叉感染。

附图说明

图1为本发明的EV71病毒IgA抗体检测试纸条的结构示意图。

图2唾液采集棒释放唾液样品的方法示意图。

图3为本发明的EV71病毒IgA抗体检测试纸条的检测方法示意图。

图4为本发明的检测试纸条检测EV71病毒IgA抗体的阳性结果示意图。

图5为本发明的检测试纸条检测EV71病毒IgA抗体的阴性结果示意图。

图6为本发明的检测试纸条检测EV71病毒IgA抗体的无效结果示意图。

具体实施方式

为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。

【实施例1】EV71病毒IgA抗体检测试纸条制备(捕获法)

1、原料来源：羊抗人IgA抗体购自Sigma公司，人IgA抗体购自广州市诺思生物科技有限公司。EV71病毒融合蛋白抗原多肽片段的序列如Seq ID NO.1所示，总共58个氨基酸，委托上海吉尔生化公司负责合成，纯度大于98％，冻干保存。胶体金溶液(40nm)购自上海杰一生物技术有限公司。

2、样品垫及标记垫的预处理

样品垫和标记垫均为聚酯膜材料，使用前需用预处理液进行浸泡处理。预处理液为由0.01～0.02mol/L的磷酸盐缓冲液(pH7.0～7.5)、3g/100ml～6g/100ml的非离子表面活性剂、1ml/100ml～4ml/100ml的吐温和5g/100ml～20g/100ml的聚乙二醇6000组成的混合液。将聚酯膜材料在预处理液中浸泡5～24h，取出后于37～45℃抽风烘干，烘干后密封备用。预处理后的样品垫可直接用于试纸条的组装，标记垫需经过标记物的包被处理后用于试纸条的组装。

3、羊抗人IgA抗体-胶体金标记垫的包被处理

(1)羊抗人IgA抗体-胶体金标记物溶液的制备：磁力搅拌下，用0.1M碳酸钾或盐酸溶液调节胶体金溶液的pH值至7.4，按1mg抗体/ml胶体金溶液的比例加入羊抗人IgA抗体，然后加入然后加入与反应体系等体积的0.9％氯化钠溶液，混匀搅拌反应2h，加入终浓度为0.3％的牛血清白蛋白，调节溶液pH至8.5，静置30min。将上述溶液在14000rpm、4℃下离心15min，弃上清液，沉淀物用1/20初始胶体金溶液体积的0.02M pH9.0的硼酸盐缓冲液(硼酸0.1237g，聚乙二醇20000 1g，用超纯水定容至1L，调pH至9.0)重悬后再离心，如此重复洗涤3次，以彻底除去未结合的蛋白质，最终得到羊抗人IgA抗体-胶体金标记物溶液，于4℃保存备用。

(2)羊抗人IgA抗体-胶体金标记垫的包被处理：用Isoflow喷膜仪将制备好的羊抗人IgA抗体-胶体金标记物溶液均匀喷涂在经过步骤2预处理的标记垫上，每1cm喷涂0.03ml羊抗人IgA抗体-胶体金标记物溶液，将喷涂好的标记垫于湿度15％、温度30℃条件下烘干处理12小时以上，烘干后密封备用。

4、硝酸纤维素膜的包被处理

取人IgA抗体用包被液(含1％蔗糖的10mM、pH7.4磷酸盐缓冲液)稀释到1.5mg/ml，然后用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的对照线(C线)；取EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段用包被液(含1％蔗糖的10mM、pH7.4磷酸盐缓冲液)稀释到1.0mg/ml，然后用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(T线)。包被好的硝酸纤维素膜于湿度10-30％、温度20-35℃条件下烘干处理12小时以上，烘干后密封备用。

5、组装、切条

请参阅附图1，附图1为本发明的EV71病毒IgA抗体检测试纸条的结构示意图。将吸水纸4、硝酸纤维素膜3、标记垫2、样品垫1依次粘附在PVC背板5上，然后调整切条机参数进行切条，切成4mm宽度的试纸条。

【实施例2】EV71病毒IgA抗体检测试纸条制备(间接法)

1、原料来源：羊抗人IgA抗体购自Sigma公司，EV71病毒VP1蛋白抗体购自广州市诺思生物科技有限公司。EV71病毒融合蛋白抗原多肽片段的序列如Seq ID NO.1，总共58个氨基酸，委托上海吉尔生化公司负责合成，纯度大于98％，冻干保存。胶体金溶液(40nm)购自上海杰一生物技术有限公司。

2、样品垫及标记垫的预处理

样品垫和标记垫均为聚酯膜材料，使用前需用预处理液进行浸泡处理。预处理液为由0.01～0.02mol/L的磷酸盐缓冲液(pH7.0～7.5)、3g/100ml～6g/100ml的非离子表面活性剂、1ml/100ml～4ml/100ml的吐温和5g/100ml～20g/100ml的聚乙二醇6000组成的混合液。将聚酯膜材料在预处理液中浸泡5～24h，取出后于37～45℃抽风烘干，烘干后密封备用。预处理后的样品垫可直接用于试纸条的组装，标记垫需经过标记物的包被处理后用于试纸条的组装。

3、EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段-胶体金标记垫的包被处理

(1)EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段-胶体金标记物溶液的制备：磁力搅拌下，用0.1M碳酸钾或盐酸溶液调节胶体金溶液的pH值至7.4，按1mg抗体/ml胶体金溶液的比例加入EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段，然后加入与反应体系等体积的0.9％氯化钠溶液，混匀搅拌反应2h，加入终浓度为0.3％的牛血清白蛋白，调节溶液pH至8.5，静置30min。将上述溶液在14000rpm、4℃下离心15min，弃上清液，沉淀物用1/20初始胶体金溶液体积的0.02M pH9.0的硼酸盐缓冲液(硼酸0.1237g，聚乙二醇20000 1g，用超纯水定容至1L，调pH至9.0)重悬后再离心，如此重复洗涤3次，以彻底除去未结合的蛋白质，最终得到EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段-胶体金标记物溶液，于4℃保存备用。

(2)EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段-胶体金标记垫的包被处理：用Isoflow喷膜仪将制备好的EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段-胶体金标记物溶液均匀喷涂在经过步骤2预处理的标记垫上，每1cm喷涂0.03ml EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段-胶体金标记物溶液，将喷涂好的标记垫于湿度15％、温度30℃条件下烘干处理12小时以上，烘干后密封备用。

4、硝酸纤维素膜的包被处理

取EV71病毒VP1蛋白抗体用包被液(含1％蔗糖的10mM、pH7.4磷酸盐缓冲液)稀释到1.5mg/ml，然后用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的对照线(C线)；取羊抗人IgA抗体用包被液(含1％蔗糖的10mM、pH7.4磷酸盐缓冲液)稀释到1.0mg/ml，然后用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(T线)。包被好的硝酸纤维素膜于湿度10-30％、温度20-35℃条件下烘干处理12小时以上，烘干后密封备用。

5、组装、切条

请参阅附图1，附图1为本发明的EV71病毒IgA抗体检测试纸条的结构示意图。将吸水纸4、硝酸纤维素膜3、结合垫2、样品垫1依次粘附在PVC背板5上，然后调整切条机参数进行切条，切成4mm宽度的试纸条。

【实施例3】EV71病毒IgA抗体的检测(捕获法)

请参阅附图2，附图2唾液采集棒释放唾液样品的方法示意图。本发明通过唾液采集棒22在患者口腔中吸附唾液样品，将前述采集棒放置到装有1-2ml样品稀释液23(含有0.5％牛血清白蛋白、0.2％酪蛋白、1％胰蛋白胨和0.02％叠氮钠的PBS缓冲液)的样品管21中，充分搅拌，挤压采集棒的棉签头液体，弃去采集棒。

请参阅附图3，图3为本发明的EV71病毒IgA抗体检测试纸条的检测方法示意图。取【实施例1】制备的EV71病毒IgA抗体检测试纸条放入上述装有唾液样品的样品管21中，样品垫端接触唾液样品，放置15-30分钟，然后肉眼观察结果。

检测原理：由于毛细管作用，唾液样品从样品垫端向吸水纸端流动，途经载有羊抗人IgA抗体-胶体金标记物的标记垫后，将该胶体金标记物完全复溶成游离态。如果唾液样品中含有EV71病毒IgA抗体，会与游离的羊抗人IgA抗体-胶体金标记物结合，形成胶体金-羊抗人IgA抗体-IgA抗体复合物，该复合物上行到硝酸纤维素膜的检测线(T线)处，再与其上包被的EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段特异结合，呈现红色条带(附图4)，多余的游离胶体金-羊抗人IgA抗体继续上行到硝酸纤维素膜的对照线(C线)处，与其上包被的人IgA抗体特异性结合，形成胶体金-羊抗人IgA抗体-人IgA抗体复合物，呈现红色条带(附图4)。如果样品中不含有EV71病毒IgA抗体，游离的羊抗人IgA抗体-胶体金标记物会越过检测线(T线)，继续上行到硝酸纤维素膜的对照线(C线)处，与其上包被的人IgA抗体特异性结合，形成胶体金-羊抗人IgA抗体-人IgA抗体复合物，呈现红色条带(附图5)。如果硝酸纤维素膜的对照线(C线)处没有形成红色条带，说明试纸条失效，结果不可靠(附图6)。

检测结果判定：如果检测试纸条同时出现检测线(T线)和对照线(C线)，说明样品呈阳性，含有IgA抗体，即预示有EV71病毒感染(附图4)；如果只出现对照线(C线)，说明样品呈阴性(附图5)，不含IgA抗体，即预示没有EV71病毒感染；如果没有出现任何线或者只出现检测线(T线)，说明此试纸条无效(附图6)。

【实施例4】EV71病毒IgA抗体的检测(间接法)

请参阅附图2，附图2唾液采集棒释放唾液样品的方法示意图。本发明通过唾液采集棒22在患者口腔中吸附唾液样品，将前述采集棒放置到装有1-2ml样品稀释液23(含有0.5％牛血清白蛋白、0.2％酪蛋白、1％胰蛋白胨和0.02％叠氮钠的PBS缓冲液)的样品管21中，充分搅拌，挤压采集棒的棉签头液体，弃去采集棒。

请参阅附图3，图3为本发明的EV71病毒IgA抗体检测试纸条的检测方法示意图。取【实施例1】制备的EV71病毒IgA抗体检测试纸条放入上述装有唾液样品的样品管21中，样品垫端接触唾液样品，放置15-30分钟，然后肉眼观察结果。

检测原理：由于毛细管作用，唾液样品从样品垫端向吸水纸端流动，途经载有EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段-胶体金标记物的标记垫后，将该胶体金标记物完全复溶成游离态。如果唾液样品中含有EV71病毒IgA抗体，会与游离的EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段-胶体金标记物结合，形成胶体金-EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段-IgA抗体复合物，该复合物上行到硝酸纤维素膜的检测线(T线)处，再与其上包被的羊抗人IgA抗体特异结合，形成胶体金-EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段-IgA抗体-羊抗人IgA抗体复合物，呈现红色条带(附图4)，多余的游离胶体金-EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段继续上行到硝酸纤维素膜的对照线(C线)，与其上包被的EV71病毒VP1蛋白抗体特异性结合，形成胶体金-EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段-EV71病毒VP1蛋白抗体复合物，呈现红色条带(附图4)。如果样品中不含有EV71病毒IgA抗体，游离的EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段-胶体金标记物会越过检测线(T线)，继续上行到硝酸纤维素膜的对照线(C线)，与其上包被的EV71病毒VP1蛋白抗体特异性结合，形成胶体金-EV71病毒VP1蛋白抗原多肽片段-EV71病毒VP1蛋白抗体复合物，呈现红色条带(附图5)。如果硝酸纤维素膜的对照线(C线)没有形成红色条带，说明试纸条失效，结果不可靠(附图6)。

检测结果判定：如果检测试纸条同时出现检测线(T线)和对照线(C线)，说明样品呈阳性，含有IgA抗体，即预示有EV71病毒感染(附图4)；如果只出现对照线(C线)，说明样品呈阴性，不含IgA抗体，即预示没有EV71病毒感染(附图5)；如果没有出现任何线或者只出现检测线(T线)，说明此试纸条无效(附图6)。

【实施例5】本发明EV71病毒IgA抗体检测试纸条方法与荧光PCR方法结果对比

选取实验样品88例，分别采集患者的唾液样品和咽拭子样品，分别用EV71病毒IgA抗体检测试纸条方法与荧光PCR方法进行测试，结果如表1：

表1本发明的EV71病毒IgA抗体检测试纸条方法与荧光PCR方法比较结果

本发明EV71病毒IgA抗体检测试纸条方法与荧光PCR方法比较，灵敏度达到97.50％，特异性87.50％，对EV71病毒筛查具备实际应用价值。

【实施例6】本发明EV71病毒IgA抗体检测试纸条方法与血清IgM抗体检测方法结果对比

选取样品88例，分别采集患者的唾液样品和血液样品，分别用EV71病毒IgA抗体检测试纸条方法与血清IgM抗体检测方法进行测试，结果如表2：

表2本发明的EV71病毒IgA抗体检测试纸条方法与荧光PCR方法比较结果

本发明EV71病毒IgA抗体检测试纸条方法与血清IgM抗体检测方法比较，灵敏度达到95.00％，特异性89.58％，对EV71病毒筛查具备实际应用价值。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序 列 表

<110> 广州瑞辉生物医疗科技有限公司

<120> EV71病毒IgA抗体检测试纸条及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 58

<212> PRT

<213> 氨基酸序列

<400> 1

Ser Arg Glu Ser Leu Ala Trp Gln Thr Ala Thr Asn Pro Ser Val

5 10 15

Phe Val Lys Leu Ser Asp Pro Pro Ala Gln Val Ser Val Pro Phe

20 25 30

Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro

35 40 45

Thr Phe Gly Glu His Lys Gln Glu Lys Asp Leu Glu Tyr

50 55