可实现牛β‑酪蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒及测定方法与流程

本发明涉及一种可实现牛β-酪蛋白鉴定及绝对定量的检测试剂盒及测定方法，属于检验测定技术领域。

背景技术：

β-酪蛋白(β-casein)是酪蛋白中含量仅次于α-酪蛋白的重要组分，它占酪蛋白的22％以上，占奶中总蛋白量25％以上。具有防治骨质疏松与佝偻病，促进动物体外受精，调节血压，治疗缺铁性贫血、缺镁性神经炎等多种生理功效，尤其是其促进常量元素(Ca、Mg)与微量元素(Fe、Zn、Cu、Cr、Ni、Co、Mn、Se)高效吸收的功能特性使其具有“矿物质载体”的美誉，它可以和金属离子，特别是钙离子结合形成可溶性复合物，一方面有效避免了钙在小肠中性或微碱性环境中形成沉淀，另一方面还可在没有V_D参与的条件下使钙被肠壁细胞吸收，是最有效的促钙吸收因子之一。

目前，国内外检测牛β-酪蛋白的主要方法有ELISA法、凯氏定氮法、双缩尿法、Folin-酚试剂法、紫外吸收法、考马斯亮蓝法、荧光光度法、共振光散射法、电化学法、高效液相色谱法和毛细管电泳法。其中ELISA试剂盒具有检测特异性高的优点，但由于检测方法易污染、背景值高的缺点，常使检测灵敏度降低。凯氏定氮法、双缩尿法、Folin-酚试剂法和考马斯亮蓝法均是采用分光光度法测定，与紫外吸收法、荧光光度法、共振光散射法、电化学法相同，均具有检测专属性、灵敏度和准确度低的缺点。高效液相色谱法和毛细管电泳法虽有较高准确度，但常易受到分子量大小接近的蛋白干扰，使检测特异性、灵敏度降低，并且检测时间较长，不适合痕/微量牛β-酪蛋白的检测。

技术实现要素：

技术问题：本发明的目的是提供一种牛β-酪蛋白检测试剂盒，给出一种采用本试剂盒可以克服现有技术缺点的牛β-酪蛋白的鉴定和含量测定的方法。该试剂盒给出了检测牛β-酪蛋白的标准物质和对含β-酪蛋白样品进行酶解反应的反应试剂。可将标准物质和/或酶解反应产物(或含内标物质)注入(超)高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪中进行牛β-酪蛋白含量测定。本发明提供了一种专属性强、精密度高、结果准确可靠、操作简便，可用于样品中牛β-酪蛋白含量测定的一种检测试剂盒及检测方法。

技术方案：

一种可实现牛β-酪蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒，其特征在于：包括标准物质：

标准物质包括特征肽段及其内标肽段，肽段序列为：

使用方式如下：

(1)、所述标准物质的特征肽段单独使用或者与其他特征肽段配成两种混合特征肽段使用；

(2)、所述标准物质的内标肽段单独使用或者与其他特征肽段配成两种混合内标肽段使用；

(3)、所述标准物质的特征肽段与其内标肽段配成的混合内标物质，单独使用或与另外一种混合内标物质同时使用；

(4)、内标肽段与其他内标肽段混合使用。

该试剂盒还包括反应试剂：

反应试剂，由以下成分组成：

所述标准物质配成单剂或双剂。

所述胰蛋白酶为序列级胰蛋白酶、胰蛋白酶中的至少一种。

所述反应试剂配成单剂。

1)标准物质

①用以实现本发明试剂盒的标准物质是标准特征肽段，是单一标准物质，或配成双混合标准物质，使用其中的一种或多种；

单一标准物质I

特征肽段1 EMPFPK

单一标准物质II

特征肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

双混合标准物质

特征肽段1 EMPFPK

特征肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

②用以实现本发明试剂盒的内标肽段是单一内标肽段，或配成多混合内标肽段，使用其中的一种或多种；

单一内标肽段I

内标肽段1 EMPFPK

单一内标肽段II

内标肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

双混合内标肽段

内标肽段1 EMPFPK

内标肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

③将上述特征肽段与其内标肽段联合使用，更有利于牛β-酪蛋白的定量检测，是单一内标物质，或配成多混合内标物质，使用其中的一种或多种；

单一内标物质I

特征肽段1 EMPFPK

内标肽段1 EMPFPK

单一内标物质II

特征肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

内标肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

单一内标物质III

特征肽段1 EMPFPK

内标肽段1 EMPFPK

特征肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

单一内标物质IV

特征肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

内标肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

特征肽段1 EMPFPK

双混合内标物质

④标准物质是单剂、或是双剂，根据上述方法自由组合或选择其中的一种或多种。

利用上述的可实现牛β-酪蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒所实施的牛β-酪蛋白含量测定方法，其特征在于：该方法步骤如下：

(1)将待测样品加入碳酸氢铵，涡旋，加入二硫苏糖醇，温育振荡，再加入碘乙酰胺，温育振荡，放置至室温后，再加入胰蛋白酶，温育振荡，最后加入甲酸终止反应；

(2)将标准物质和(1)步骤中最终酶解产物分别注入高效液相色谱-串联四极杆质谱仪中检测或将混合内标物质和(1)步骤中含内标肽段的最终酶解产物分别注入高效液相色谱-三重四极杆质谱仪中检测，检测后通过m/z和tR进行定性，色谱峰峰面积变化测算出牛β-酪蛋白的绝对含量；

温度控制在25～60℃范围，温育时间控制在0.5～12h，振荡频率控制在800～2500rmp，涡旋时间控制在2～10min，室温控制在18-22℃范围；

胰蛋白酶与被测样品总蛋白量比例控制在1/1到1/100。

所述步骤(2)为：将一种或两种特征肽段和(1)步骤中最终酶解产物分别注入(超)高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪中检测，或将一种或两种混合内标物质和(1)步骤中含一种或两种内标肽段的最终酶解产物分别注入(超)高效液相色谱-三重四极杆质谱仪中检测，通过m/z和t_R进行定性，色谱峰峰面积变化测算出牛β-酪蛋白的含量。

有益效果：本发明提供的检测试剂盒及检测方法能对样品中牛β-酪蛋白进行准确灵敏的定性和绝对定量，具有特异性强、灵敏度高、结果准确、操作简便等优点。

本发明包括标准物质(由特征肽段及其内标肽段组成)和酶解反应试剂；采用(超)高效液相色谱-三重四极杆质谱仪进行检测，能快速、精确、灵敏的对微/痕量的牛β-酪蛋白进行绝对定量。该方法具有操作简便、特异性强、灵敏度和准确度高的特点，检测时间在7min之内完成。

目前，尚未开发出测定牛β-酪蛋白含量的特征肽段及其内标肽段和酶解反应试剂的试剂盒。本发明成功的弥补了生物/化学检测领域的不足，能准确地对含微/痕量牛β-酪蛋白的样品进行定性鉴别和绝对定量，具有特异性强、操作简便、灵敏度和准确度高的优点。

附图说明

图1为特征肽段1的二级质谱图(m/z＝374.6)；

图2为特征肽段2的二级质谱图(m/z＝1093.5)；

具体实施方式

通过以下实施例进一步说明本发明，但本发明的权利要求不仅限于实施例。

本发明包括牛β-酪蛋白检测试剂盒和含量测定方法两部分。

牛β-酪蛋白检测试剂盒由标准物质和反应试剂两部分组成：

1)标准物质

①用以实现本发明试剂盒的标准物质是标准特征肽段，可以是单一标准物质，或配成双混合标准物质，可使用其中的一种或多种。

单一标准物质I

特征肽段1 EMPFPK

单一标准物质II

特征肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

双混合标准物质

特征肽段1 EMPFPK

特征肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

②用以实现本发明试剂盒的内标肽段(任一或多个氨基酸上的C、H、O或/和N被同位素标记)，可以是单一内标肽段，或配成多混合内标肽段，可使用其中的一种或多种。

单一内标肽段I

内标肽段1 EMPFPK

单一内标肽段II

内标肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

双混合内标肽段

内标肽段1 EMPFPK

内标肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

③将上述特征肽段与其内标肽段联合使用，以下简称“内标物质”，更有利于牛β-酪蛋白的定量检测。可以是单一内标物质，或配成多混合内标物质，可使用其中的一种或多种。

单一内标物质I

特征肽段1 EMPFPK

内标肽段1 EMPFPK

单一内标物质II

特征肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

内标肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

单一内标物质III

特征肽段1 EMPFPK

内标肽段1 EMPFPK

特征肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

单一内标物质IV

特征肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

内标肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

特征肽段1 EMPFPK

双混合内标物质

④用以实现本发明方法的牛β-酪蛋白检测试剂盒中的标准物质可以是单剂、也可以是双剂，可根据上述方法自由组合或选择其中的一种或多种。

2)反应试剂，用以实现本发明方法的反应试剂是单剂，包括：

本发明测定牛β-酪蛋白含量的步骤如下：

(1)将样品加入碳酸氢铵，振荡混匀，加入二硫苏糖醇，温育振荡，再加入碘乙酰胺，温育振荡，放置至室温后，再加入胰蛋白酶，温育振荡，最后加入甲酸终止反应。

(2)将标准物质(或内标物质)和最终酶解产物(或含内标肽段)分别注入(超)高效液相色谱-串联质谱仪中检测，通过m/z和t_R进行定性鉴别，色谱峰峰面积变化测算出样品中牛β-酪蛋白的含量。

通常步骤(1)温度控制在25～60℃范围，温育时间控制在0.5～12h，振荡频率控制在800～2500rmp。胰蛋白酶与被测样品总蛋白量比例控制在1/1到1/100，涡旋时间控制在2～10min。

所述步骤(2)将特征肽段(一种或两种)和最终酶解产物分别注入(超)高效液相色谱-串三重四极杆质谱仪中检测，或将混合内标物质(一种或两种)和最终酶解产物(含一种或两种内标肽段)分别注入(超)高效液相色谱-三重四极杆质谱仪中检测，通过m/z和t_R进行定性鉴别，色谱峰峰面积变化，采用内标法或外标法测算出样品中牛β-酪蛋白的含量。

实施例1：

样品：牛奶

双混合内标物质

双混合内标肽段

内标肽段1 EMPFPK

内标肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

(1)样品的制备：取牛奶0.5ml，加入1ml细胞裂解液，超声提取5min，精密吸取400μL匀浆液，加入1.6ml甲醇，离心(2000rpm)，弃取上清液，残渣加入双混合内标肽段，加150mmol/L碳酸氢铵溶液900μL，涡旋(800rmp)5min，加入100mmol/L二硫苏糖醇溶液400μL，60℃温育振荡(1000rmp)50min，放置至室温后，加入100mmol/L碘代乙酰胺溶液400μL，30℃温育振荡(1000rmp)40min，加入1mg/ml胰蛋白酶溶液200μL，50℃温育振荡(1000rmp)60min，放置至室温后，加入10％甲酸水溶液900μL，终止反应，冷冻干燥，得到最终酶解产物。

(2)将双混合内标物质和最终酶解产物分别注入(超)高效液相色谱-三重四极杆质谱仪中检测。特征肽段1的检出限为2ng，特征肽段2的检出限为10ng，相对标准偏差小于2.13％，回收率为95.3％～99.1％(n＝6)。

实施例2：

样品：牛奶酪

单一内标物质II

特征肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

内标肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

单一内标肽段II：

内标肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

(1)样品的制备：取牛奶酪100mg，加入1ml细胞裂解液，超声破碎1min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL匀浆液，加入1.6ml甲醇，离心(2000rpm)，弃取上清液，残渣加入内标肽段2，加入100mmol/L碳酸氢铵溶液800μL，涡旋(1000rmp)2min，加入150mmol/L二硫苏糖醇溶液300μL，65℃温育振荡(1200rmp)30min，放置至室温后，加入100mmol/L碘代乙酰胺溶液500μL，30℃温育振荡(1200rmp)40min，加入200μg/ml胰蛋白酶溶液800μL，55℃振荡(1500rmp)温育50min，放置至室温后，加入15％甲酸水溶液300μL，终止反应，冷冻干燥，得到最终酶解产物。

(2)将单一内标物质II和最终酶解产物分别注入(超)高效液相色谱-三重四极杆质谱仪中检测，检出限为8ng，相对标准偏差小于2.04％，回收率为95.8％～101.0％(n＝6)。

实施例3：

样品：牛奶粉

单一标准物质II

特征肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

1)样品的制备：取牛奶粉50mg，加入1ml细胞裂解液，超声提取5min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL匀浆液，加入1.6ml甲醇，离心(2000rpm)，弃取上清液，残渣加入100mmol/L碳酸氢铵溶液850μL，涡旋(1000rmp)5min，加入250mmol/L二硫苏糖醇溶液100μL，60℃温育振荡(1200rmp)60min后，加入100mmol/L碘代乙酰胺溶液500μL，30℃温育振荡(1000rmp)40min，加入500μg/ml胰蛋白酶溶液600μL，35℃温育振荡(1500rmp)12h，放置至室温后，加入10％甲酸水溶液400μL，终止反应，冷冻干燥，得到最终酶解产物。

2)将单一标准物质II和最终酶解产物分别注入(超)高效液相色谱-三重四极杆质谱仪中检测，检出限为10ng，相对标准偏差小于2.54％，回收率为96.3％～99.8％(n＝6)。

实施例4：

样品：酸牛奶

单一内标物质I

特征肽段1 EMPFPK

内标肽段1 EMPFPK

单一内标物质I

内标肽段1 EMPFPK

1)样品的制备：取酸牛奶0.5ml，加入1ml细胞裂解液，超声提取5min，精密吸取400μL匀浆液，加入1.6ml甲醇，离心(2000rpm)，弃取上清液，残渣加入内标肽段1，加入100mmol/L碳酸氢铵溶液800μL，涡旋(800rmp)10min，加入1000mmol/L二硫苏糖醇溶液30μL，70℃温育振荡(2000rmp)3h，放置至室温后，加入100mmol/L碘代乙酰胺溶液500μL，25℃温育振荡(2000rmp)30min，加入1mg/ml胰蛋白酶溶液200μL，25℃振荡(1500rmp)过夜，加入5％甲酸水溶液500μL，终止反应，冷冻干燥，得到最终酶解产物。

2)将单一内标物质I和最终酶解产物分别注入(超)高效液相色谱-三重四极杆质谱仪中检测，特征肽段1的检出限为2ng，相对标准偏差小于3.11％，回收率为96.1％～98.1％(n＝6)。

实施例5：

样品：市售牛奶片

单一内标物质III

特征肽段1 EMPFPK

内标肽段1 EMPFPK

特征肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

单一内标物质I

内标肽段1 EMPFPK

1)样品的制备：取牛奶片500mg，加入1ml细胞裂解液，超声处理1min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL匀浆液，加入1.6ml甲醇，离心(2000rpm)，弃取上清液，残渣加入100mmol/L碳酸氢铵溶液900μL，涡旋(1000rmp)6min，加入100mmol/L二硫苏糖醇溶液400μL，60℃温育振荡(1200rmp)60min温后，加入1000mmol/L碘代乙酰胺溶液400μL，30℃温育振荡(1000rmp)50min，加入1mg/ml胰蛋白酶溶液400μL，45℃温育振荡(1800rmp)3h，放置至室温后，加入5％甲酸水溶液500μL，终止反应，冷冻干燥，得到最终酶解产物。

2)将单一内标物质III和最终酶解产物分别注入(超)高效液相色谱-三重四极杆质谱仪中检测，特征肽段1的检出限为2ng，相对标准偏差小于3.11％，回收率为95.6％～97.9％(n＝6)，特征肽段2作为佐证肽段。

实施例6：

样品：牛奶

单一内标物质IV

特征肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

内标肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

特征肽段1 EMPFPK

单一内标肽段II：

内标肽段2 DMPIQAFLLYQEPVLGPVR

1)样品的制备：取牛奶0.5ml，加入1ml细胞裂解液，超声处理5min，精密吸取400μL匀浆液，加入1.6ml甲醇，离心(2000rpm)，弃取上清液，残渣加入单一内标肽段II，加100mmol/L碳酸氢铵溶液800μL，涡旋(800rmp)5min，加入90mmol/L二硫苏糖醇溶液400μL，60℃温育振荡(1000rmp)50min，放置至室温后，加入100mmol/L碘代乙酰胺溶液500μL，30℃温育振荡(1000rmp)40min，加入1mg/ml胰蛋白酶溶液200μL，50℃温育振荡(1000rmp)60min，放置至室温后，加入10％甲酸水溶液800μL，终止反应，冷冻干燥，得到最终酶解产物。

2)将单一内标物质IV和最终酶解产物分别注入(超)高效液相色谱-三重四极杆质谱仪中检测，特征肽段2的检出限为2ng，相对标准偏差小于3.11％，回收率为95.6％～97.9％(n＝6)，特征肽段1作为佐证肽段。

以上实施例中：标准物质的特征肽段可以单独使用也可以与其他特征肽段配成两种标准物质使用，具体实施方式不再一一赘述。

标准物质的特征肽段与其内标肽段配成的混合内标物质，单独使用或与另外一种混合内标物质同时使用，具体实施方式不再一一赘述。

标准物质配成单剂或双剂，具体不再一一赘述。

所述胰蛋白酶为序列级胰蛋白酶、胰蛋白酶中的至少一种。

总之，上述替换的实施例在这里不做赘述。

总之，实验证明，采用本发明的检测试剂盒完全可以对样品中牛β-酪蛋白进行鉴定，并得出所需的绝对含量测定结果，并且灵敏度高、特异性好、精密度高、不受内、外源物质的污染。

本发明的检测试剂盒及检测方法具有专属性强、精密度高、结果准确可靠、操作简便等优点，可用于样品中牛β-酪蛋白含量测定。

蛋白序列

β-酪蛋白

MKVLILACLVALALARELEELNVPGEIVESLSSSEESITRINKKIEKFQSEEQQQTEDELQDKIHPFAQTQSLVYPFPGPIPNSLPQNIPPLTQTPVVVPPFLQPEVMGVSKVKEAMAPKHKEMPFPKYPVEPFTESQSLTLTDVENLHLPLPLLQSWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVLSLSQSKVLPVPQKAVPYPQRDMPIQAFLLYQEPVLGPVRGPFPIIV

β-酪蛋白

MKVLILACLVALALARELEELNVPGEIVESLSSSEESITRINKKIEKFQSEEQQQTEDELQDKIHPFAQTQSLVYPFPGPIPNSLPQNIPPLTQTPVVVPPFLQPEVMGVSKVKEAMAPKHKEMPFPKYPVEPFTESQSLTLTDVENLHLPLPLLQSWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVLSLSQSKVLPVPQKAVPYPQRDMPIQAFLLYQEPVLGPVRGPFPIIV