本发明涉及肿瘤标志物检测技术领域，尤其是涉及一种检测尿液中单羟酚类代谢物的试剂盒及其制备方法。
背景技术：
肿瘤标志物是指在肿瘤的发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身所产生的或者是由机体对肿瘤细胞反应而产生的，反映肿瘤存在和生长的一类物质，包括蛋白质、激素、酶(同工酶)及癌基因产物等。化验患者血液或体液中的肿瘤标志物，可在肿瘤普查中早期发现肿瘤,并观察肿瘤治疗的疗效以及判断患者预后。
单羟酚类代谢物(即酪氨酸、色氨酸等)作为肿瘤标志物，已经被众多学者所认知，例如CN102004103、快速尿液单羟酚代谢物检测在恶性肿瘤中的诊断价值(检验医学与临床，2016第6期，李兴翠等)、尿液单羟酚类代谢物检测在恶性肿瘤早期预测中的应用价值(检验医学与临床，2015年第16期，黄学梅等)。
目前这些检测方法均为无机化学试剂检测法，无机化学检测法的优点是检测试剂制备简单。但是，尿液中的单羟酚类代谢物的含量是及其微量的，并且尿液中还存在多种其他多种成分会影响检测结果，因此，开发一种更为精密、特异性更高的检测方法迫在眉睫。
技术实现要素：
针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种检测尿液中单羟酚类代谢物的试剂盒及其制备方法。本发明对尿液中微量的单羟酚类代谢物具有特异性检测功能，检测方法简单、快速，准确率高。
本发明的技术方案如下：
检测尿液中单羟酚类代谢物的试剂盒，包括盛装有检测试剂的安瓿瓶，所述检测试剂为吸附有显色混合物的壳聚糖复合纤维素气凝胶。其制备方法为：
(1)将天然纤维素进行溶解，得到纤维素溶液，再将纤维素溶液流延或涂覆成膜状，通过凝固再生和水洗，制备成厚度为20～25微米的纤维素膜；
(2)在步骤(1)制备得到的纤维素膜上流延或涂覆一层壳聚糖溶液，凝固后得到一层厚度为20～25微米的壳聚糖膜；
(3)用无水乙醇对步骤(2)得到的纤维素-壳聚糖复合膜进行置换，去除其中的水分，然后将纤维素-壳聚糖复合膜反转放置，使纤维素膜位于上方；
(4)在步骤(3)得到的纤维素-壳聚糖复合膜的纤维素膜上流延或涂覆一层壳聚糖溶液，凝固后得到一层厚度为20～25微米的壳聚糖膜，得到壳聚糖-纤维素-壳聚糖复合膜；
(5)用无水乙醇对步骤(4)得到的壳聚糖-纤维素-壳聚糖复合膜进行置换，去除其中的水分，然后经冷冻干燥或临界干燥，得到壳聚糖-纤维素-壳聚糖复合气凝胶；
(6)将酪氨酸酶和色氨酸酶按照2:1的质量比混合均匀得到酶混合物，并且将高碘酸钠和2,4-二硝基苯阱、氢氧化钠按照2:1:0.5的质量比混合均匀得到标记混合物；
(7)将酶混合物和标记混合物按照2～3:1的质量比混合，然后置于去离子水配制成固体质量分数为15～20％的混悬液，然后将步骤(5)得到的复合气凝胶放入该混悬液中，在水浴振荡器中振荡固定3～5小时，即得。
所述酪氨酸酶和色氨酸酶为市售哺乳动物酪氨酸酶和色氨酸酶。优选的，所述酪氨酸酶和色氨酸酶为市售人酪氨酸酶和色氨酸酶或大鼠酪氨酸酶和色氨酸酶。
其检测方法为：检验时温度20℃左右为宜，取新鲜清洁尿样(最好是早晨第一次尿液)3ml加入装有试剂的安瓿瓶中，摇匀后静放3～5分钟，然后与比色卡进行比色，如果是无色到黄色，则是阴性；如果是粉色、紫色或者红色、棕色，则为阳性；如果是其他颜色，则为无效。
气凝胶是一种具有纳米结构的多孔材料，其孔隙率高达90％以上，密度最低可至0.001g/cm3，是目前世界上最轻的固体材料之一。它明显不同于孔洞结构在微米和毫米级的多孔材料，具有极大的比表面积。由于其特有的纳米多孔、三维网络结构，使其具有许多独特的性能。壳聚糖复合纤维素气凝胶的微观结构是具有超大比表面积的三维立体网络状蜂窝结构，每个微小蜂窝中都吸附有若干个酪氨酸酶。本发明制备得到的双层气凝胶的结构更为疏松，比表面积更大，可以达到500m2/g，并且纤维素和壳聚糖都是亲生物性材料，不会对酪氨酸酶产生影响。
酪氨酸酶和色氨酸酶通过固定酶的方法固定在双层气凝胶的孔隙中，这种方法可以使酪氨酸酶和色氨酸酶牢固粘结在气凝胶孔隙中，不需要小心翼翼的搬运，更为适合普通人购买、运送和使用。并且固定化酶的方法可以使酪氨酸酶和色氨酸酶更为均匀的分布，并且是单层分布。这使得在气凝胶的空隙中，在平均单位面积上有最多的单层酪氨酸酶存在，当其遇到酪氨酸时，可以有最高的灵敏度和反应速度。
酪氨酸酶和色氨酸酶来自于市售的人酪氨酸酶；其他哺乳动物如大鼠酪氨酸酶也可以用。酪氨酸酶与尿液中的酪氨酸接触以后，迅速的将酪氨酸分解为邻苯二酚。显色试剂为高碘酸钠粉末，邻苯二酚与高碘酸钠反应生成邻苯二琨，呈粉红色，可以由肉眼观察到。色氨酸酶与尿液中的色氨酸接触以后可以分解为丙酮酸、吲哚等物质，其中所含的丙酮酸可与2,4-二硝基苯阱反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯踪，其在碱性溶液中呈樱红色。
本发明有益的技术效果在于：
本发明提供的试剂盒检测方法简单，便于各种人群自测；检测时间短，显色效果明显，检测者无需专业知识即可进行判断；检测效果灵敏，准确率高，适于大范围推广应用。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进行具体描述。
实施例1
一种检测尿液中单羟酚类代谢物的试剂盒，包括盛装有检测试剂的安瓿瓶，所述检测试剂为吸附有显色混合物的壳聚糖复合纤维素气凝胶。其制备方法为：
(1)用氢氧化钠将天然纤维素进行溶解，得到4wt％的纤维素溶液，再将纤维素溶液流延或涂覆成膜状，通过凝固再生和水洗，制备成厚度为20微米的纤维素膜；
(2)在步骤(1)制备得到的纤维素膜上流延或涂覆一层壳聚糖溶液，溶解壳聚糖的溶剂为乙酸，制备得到的壳聚糖浓度为5wt％；凝固后得到一层厚度为20微米的壳聚糖膜；
(3)用无水乙醇对步骤(2)得到的纤维素-壳聚糖复合膜进行置换，去除其中的水分，然后将纤维素-壳聚糖复合膜反转放置，使纤维素膜位于上方；
(4)在步骤(3)得到的纤维素-壳聚糖复合膜的纤维素膜上流延或涂覆一层壳聚糖溶液，凝固后得到一层厚度为20微米的壳聚糖膜，得到壳聚糖-纤维素-壳聚糖复合膜；
(5)用无水乙醇对步骤(4)得到的壳聚糖-纤维素-壳聚糖复合膜进行置换，去除其中的水分，然后经冷冻干燥或临界干燥，得到壳聚糖-纤维素-壳聚糖复合气凝胶；
(6)将酪氨酸酶和色氨酸酶按照2:1的质量比混合均匀得到酶混合物，并且将高碘酸钠和2,4-二硝基苯阱、氢氧化钠按照2:1:0.5的质量比混合均匀得到标记混合物；所述酪氨酸酶和色氨酸酶为市售人酪氨酸酶和色氨酸酶；
(7)将酶混合物和标记混合物按照2:1的质量比混合，然后置于去离子水配制成固体质量分数为15％的混悬液，然后将步骤(5)得到的复合气凝胶放入该混悬液中，在水浴振荡器中振荡固定5小时，即得。
其检测方法为：检验时温度20℃左右为宜，取新鲜清洁尿样(最好是早晨第一次尿液)3ml加入装有试剂的安瓿瓶中，摇匀后静放3～5分钟，然后与比色卡进行比色，如果是无色到黄色，则是阴性；如果是粉色、紫色或者红色、棕色，则为阳性；如果是其他颜色，则为无效。这一方法的检测准确率在99.2％以上，并且无效状态的检出率在0.001％以下。
实施例2
一种检测尿液中单羟酚类代谢物的试剂盒，包括盛装有检测试剂的安瓿瓶，所述检测试剂为吸附有显色混合物的壳聚糖复合纤维素气凝胶。其制备方法为：
(1)用氢氧化钠和尿素将天然纤维素进行溶解，得到6wt％的纤维素溶液，再将纤维素溶液流延或涂覆成膜状，通过凝固再生和水洗，制备成厚度为25微米的纤维素膜；
(2)在步骤(1)制备得到的纤维素膜上流延或涂覆一层壳聚糖溶液，溶解壳聚糖的溶剂为乙酸，制备得到的壳聚糖浓度为3wt％；凝固后得到一层厚度为25微米的壳聚糖膜；
(3)用无水乙醇对步骤(2)得到的纤维素-壳聚糖复合膜进行置换，去除其中的水分，然后将纤维素-壳聚糖复合膜反转放置，使纤维素膜位于上方；
(4)在步骤(3)得到的纤维素-壳聚糖复合膜的纤维素膜上流延或涂覆一层壳聚糖溶液，凝固后得到一层厚度为25微米的壳聚糖膜，得到壳聚糖-纤维素-壳聚糖复合膜；
(5)用无水乙醇对步骤(4)得到的壳聚糖-纤维素-壳聚糖复合膜进行置换，去除其中的水分，然后经冷冻干燥或临界干燥，得到壳聚糖-纤维素-壳聚糖复合气凝胶；
(6)将酪氨酸酶和色氨酸酶按照2:1的质量比混合均匀得到酶混合物，并且将高碘酸钠和2,4-二硝基苯阱、氢氧化钠按照2:1:0.5的质量比混合均匀得到标记混合物；所述酪氨酸酶和色氨酸酶为市售大鼠酪氨酸酶和色氨酸酶；
(7)将酶混合物和标记混合物按照3:1的质量比混合，然后置于去离子水配制成固体质量分数为20％的混悬液，然后将步骤(5)得到的复合气凝胶放入该混悬液中，在水浴振荡器中振荡固定3小时，即得。
其检测方法为：检验时温度20℃左右为宜，取新鲜清洁尿样(最好是早晨第一次尿液)3ml加入装有试剂的安瓿瓶中，摇匀后静放3～5分钟，然后与比色卡进行比色，如果是无色到黄色，则是阴性；如果是粉色、紫色或者红色、棕色，则为阳性；如果是其他颜色，则为无效。这一方法的检测准确率在99％以上，并且无效状态的检出率在0.002％以下。