一种基于微流控芯片的船舶压载水快速检测装置及方法与流程

本发明涉及船舶压载水中微藻的检测技术，特别是一种基于微流控芯片的船舶压载水快速检测装置及方法。

背景技术：

船舶压载水是海洋生物入侵的主要危害之一，外来的海洋生物入侵会导致当地的生态系统被破坏，主要包括对工业，农业以及对人类的身体健康造成危害。在《船舶压载水及沉积物控制和管理国际公约》中规定了船舶排放时的压载水性能应满足标准。其中重要的一项就是船舶压载水中存活的不同生物尺寸的浓度，然而微藻细胞是船舶压载水中最常见的生物，也是现在应该处理和检测的主要目标之一。

目前，流式细胞仪(flow cytometry，FCM)是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器，也适用于荧光样品的检测和分析，主要包括样品的流动技术、细胞的计数和分选技术，计算机对数据的采集和分析技术等。流式细胞仪以流式细胞术为理论基础，是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光学和计算机等学科知识综合应用的结晶。其特点是：测量速度快、被测群体大、可进行多参数测量，在生物、医学领域应用广泛。但是该仪器体积庞大、价格昂贵，不能集成便携，也不利于广泛应用。

针对以上的问题，人们提出了基于微流控芯片的便携式流式细胞仪，微流控芯片(microfluidic chip)技术将预处理、反应、分离和检测等单元集成到单个芯片内，具有集成度高、体积小等特点，代表了微型化仪器发展的方向。

中国专利201310491678.X公开的《一种基于微流控芯片的便携式荧光检测装置及其检测方法》和201410249765.9公开的《一种船舶压载水处理过程的分析装置及其分析方法》都属于基于微流控芯片的便携式流式细胞仪。

但是，上述专利都是基于单层微流控芯片技术的，单层微流控芯片对微藻细胞或微粒的分离检测所能达到的效果有限，尤其在单层微流控芯片上对不同尺寸的细胞或微粒的进行分离时，由于微粒或细胞的的尺寸不同，单层微流控芯片上的微通道很容易被大的微粒或细胞堵住，导致微流控芯片不能正常工作，从而影响对船舶压载水的检测的结果，除此之外，当样品中所含有的物质复杂时，单层微流控芯片的作用受到很大局限，很难满足达到分离和检测一体化的需求。

技术实现要素：

为解决现有技术存在的上述问题，本发明要设计一种能够防止微流控芯片微通道堵塞并能实现分离和分析一体化的、集成度高的、免标记的用于现场快速测量的一种基于微流控芯片的船舶压载水快速检测装置及方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种基于微流控芯片的船舶压载水快速检测装置，包括平台、分离组件、样品前处理组件、光激发组件、光检测组件和数据处理组件，所述平台为暗室结构，分离组件和光检测组件固定在平台内，所述分离组件分别与样品前处理组件、光检测组件和光激发组件连接，所述光检测组件与数据处理组件连接；

所述的样品前处理组件包含滤网，用于样品的前处理和提纯，经过处理的样品通过微管进入分离组件；

所述分离组件由多层微流控芯片键合而成，各层微流控芯片之间充分键合；第一层微流控芯片上设置样品槽、鞘液槽、混合液通道、分离槽、检测通道和废液储液槽，中间各层微流控芯片设置立方体阵列区、分离槽、检测通道和废液储液槽，最底下一层微流控芯片设置立方体阵列区、检测通道和废液储液槽，且相邻两层微流控芯片的上层立方体阵列区的微柱间隔大于下层立方体阵列区的微柱间隔。

本发明所述分离组件由三层微流控芯片充分键合而成；第一层微流控芯片上设置样品槽、鞘液槽A、鞘液槽B、混合液通道、分离槽Ⅰ、检测通道Ⅰ和废液储液槽Ⅰ，所述样品槽、鞘液槽A和鞘液槽B分别通过样品通道、鞘液通道A和鞘液通道B与混合液通道连通，所述混合液通道经分离槽Ⅰ与检测通道Ⅰ连通，检测通道Ⅰ的末端连接废液储液槽Ⅰ；所述样品槽、鞘液槽A和鞘液槽B均设有液体注射泵，起到对液体进行推动的作用；

第二层微流控芯片上设置立方体阵列区Ⅰ、分离槽Ⅱ、检测通道Ⅱ和废液储液槽Ⅱ，所述立方体阵列区Ⅰ入口与第一层微流控芯片的分离槽Ⅰ连通、立方体阵列区Ⅰ出口经分离槽Ⅱ与检测通道Ⅱ连通，检测通道Ⅱ的末端连接废液储液槽Ⅱ；所述立方体阵列区Ⅰ的微柱间隔为18-22μm；

第三层微流控芯片上设置立方体阵列区Ⅱ、检测通道Ⅲ和废液储液槽Ⅲ，所述立方体阵列区Ⅱ入口与第二层微流控芯片的分离槽Ⅱ连通、立方体阵列区Ⅱ出口经检测通道Ⅲ连接废液储液槽Ⅲ；所述立方体阵列区Ⅱ的微柱间隔为9-11μm。

本发明所述样品槽、鞘液槽A和鞘液槽B均通过各自的通道连接到混合液通道的一端。

本发明所述样品前处理组件包括滤网，所述数据处理组件使用包括微处理器；所述光检测组件包括光电倍增管或单光子计数模块。

本发明所述样品前处理组件封装在平台的顶部，光检测组件在平台的内部位于分离组件的下方，数据处理组件在平台的外部且封装在平台的底部，光激发组件在平台的侧壁上且通过密封结构与平台连接。

本发明所述分离组件的每一层微流控芯片都有微通道，第一层微流控芯片微通道的开口面向下，第二层微流控芯片微通道的开口面向上，第三层微流控芯片微通道的开口面向上；第一层微流控芯片微通道包括样品通道、鞘液通道A、鞘液通道B、混合液通道和检测通道Ⅰ；第二层微流控芯片微通道包括检测通道Ⅱ、立方体阵列区Ⅰ与分离槽Ⅱ之间的连接通道；第三层微流控芯片微通道包括检测通道Ⅲ。

一种基于微流控芯片的船舶压载水快速检测装置的检测方法，包括如下步骤：

A、将样品溶液放到样品前处理组件中将与检测物质的尺寸规格相差较大的物质与杂质过滤掉，处理完的样品经过前处理组件与分离组件相连的微管进入分离组件中的样品槽；

将鞘液加入到鞘液槽A和鞘液槽B，在液体注射泵的推动作用下，使鞘液和前处理的样品分别沿着鞘液通道A、鞘液通道B和样品通道经过第一层微流控芯片的分离槽Ⅰ，利用立方体阵列区Ⅰ的过滤作用进行分离，尺寸规格大于立方体阵列区Ⅰ的微柱间隔的细胞与微粒进入检测通道Ⅰ，进行活性和数量的检测，然后流入废液储液槽Ⅰ；同理第二层微流控芯片进行尺寸规格在立方体阵列区Ⅱ的微柱间隔与立方体阵列区Ⅰ的微柱间隔之间的细胞与微粒的分离与活性和数量的检测；第三层微流控芯片进行尺寸规格在立方体阵列区Ⅱ的微柱间隔以下的细胞和微粒的分离、并进行活性和数量的检测。

B、当有样品进入任一个分离槽时，开启光激发组件、光检测组件、数据处理组件、鞘液槽的液体注射泵，使鞘液和微藻分别沿着鞘液通道和样品通道经过检测通道流向废液储液槽，微藻经过检测区域时微藻单细胞内叶绿素被激发光激发产生瞬时光子辐射；

C、通过脉冲信号的强弱和数量，获取船舶压载水中微藻活性强弱和微藻数量。

与现有技术相比，本发明有益效果为：

1、由于样品中的物质粒径大小的不同，本发明通过三层或多层微流控芯片，针对物质粒径的大小，在不同层设置不同的微柱间隙，可以根据要分离的物质粒径的大小不同进行设计，微柱间隙可以设计成3μm以上的任意尺寸，结构设计灵活，能够快速满足不同的实际需要，对于不同尺寸的物质，可以通过三层或多层微流控芯片，进行快速的分离。在每层都有检测区域，能够对分离完的物质进行及时检测，实现了对样品中的物质快速的分离与检测。

2、本发明操作简单，只需将样品放入样品前处理组件，样品前处理组件进行粗过滤后，进入分离组件，打开液体注射泵和其他相应的组件，分离组件能自动的分离和检测组件能及时的检测，无需人为干扰、此操作也无需专业人员，满足现场检测的需要。

3、本发明将样品放入样品前处理组件，样品前处理组件进行粗过滤后，将较大尺寸的物质进行了过滤和提纯，从而防止了微通道的堵塞。

4、本发明的船舶压载水在鞘液作用下，船舶压载水中微藻细胞聚焦后一个一个经过检测区域，避免了多个微藻细胞同时经过检测区域而产生的误差，在检测区域处，利用一束激发光照射微藻细胞，使微藻细胞内叶绿素吸收激发光并产生叶绿素荧光，叶绿素荧光被光检测组件检测到，光强大小表征微藻细胞活性强弱，光强越强，则微藻细胞活性越强；反之，光强越弱，则微藻细胞活性越弱。本发明通过检测微藻自身荧光信号强度自动完成对微藻活性的区分，操作简单，克服了传统方法中人工计数时带来的人为因素影响、误差以及对操作人员须具备丰富的水生生物学知识的要求。

5、本发明对于微藻活性的判别是通过检测微藻自身荧光信息进行的，这些荧光信息是与其活性密切相关的内在探针，这样无需对微藻进行外部标记，不仅能够克服外部标记过程中带来的误差、操作复杂、耗时等缺点，更重要的是这种利用微藻自身内在探针的免标记方法具有普适性；

6、本发明由于采用多层微流控芯片作为船舶压载水检测的微平台，而相关的光电检测设备亦可采用体积较小的结构形式，因此，相对于现有大型检测设备，本检测装置具有体积小、重量轻、便于携带，能够进行手持用于现场检测等优点。

7、本发明的平台为暗室结构，能有效排除除激发光之外其余杂散光的干扰，光激发组件优选为固定在平台内或通过密封结构与平台连接，其目的在于使平台不透光。

附图说明

本发明共有附图5幅，其中：

图1为船舶压载水中快速检测装置结构示意图。

图2位分离组件三层微流控芯片键合后的整体示意图。

图3为分离组件中第一层微流控芯片的结构示意图。

图4为分离组件中第二层微流控芯片的结构示意图。

图5为分离组件中第三层微流控芯片的结构示意图。

其中：1、样品前处理组件，2、平台，3、分离组件，4、光激发组件，5、光检测组件，6、数据处理组件，7、样品槽，8、鞘液槽A，9、鞘液槽B，10、混合液通道，11、分离槽Ⅰ，12、检测通道Ⅰ，13、废液储液槽Ⅰ，14、立方体阵列区Ⅰ，15、分离槽Ⅱ，16、检测通道Ⅱ，17、废液储液槽Ⅱ，18、立方体阵列区Ⅱ，19、检测通道Ⅲ，20、废液储液槽Ⅲ。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的说明；下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

如图1-5所示，一种基于微流控芯片的船舶压载水快速检测装置，包括平台2、分离组件3、样品前处理组件1、光激发组件4、光检测组件5和数据处理组件6，所述平台2为暗室结构，分离组件3和光检测组件5固定在平台2内，所述分离组件3分别与样品前处理组件1、光检测组件5和光激发组件4连接，所述光检测组件5与数据处理组件6连接；

所述的样品前处理组件7包含滤网，用于样品的前处理和提纯，经过处理的样品通过微管进入分离组件3；

所述分离组件3由多层微流控芯片键合而成，各层微流控芯片之间充分键合；第一层微流控芯片上设置样品槽、鞘液槽、混合液通道、分离槽、检测通道和废液储液槽，中间各层微流控芯片设置立方体阵列区、分离槽、检测通道和废液储液槽，最底下一层微流控芯片设置立方体阵列区、检测通道和废液储液槽，且相邻两层微流控芯片的上层立方体阵列区的微柱间隔大于下层立方体阵列区的微柱间隔。

本发明所述分离组件3由三层微流控芯片充分键合而成；第一层微流控芯片上设置样品槽7、鞘液槽A8、鞘液槽B9、混合液通道10、分离槽Ⅰ11、检测通道Ⅰ12和废液储液槽Ⅰ13，所述样品槽7、鞘液槽A8和鞘液槽B9分别通过样品通道、鞘液通道A和鞘液通道B与混合液通道10连通，所述混合液通道10经分离槽Ⅰ11与检测通道Ⅰ12连通，检测通道Ⅰ12的末端连接废液储液槽Ⅰ13；所述样品槽7、鞘液槽A8和鞘液槽B9均设有液体注射泵，起到对液体进行推动的作用；

第二层微流控芯片上设置立方体阵列区Ⅰ14、分离槽Ⅱ15、检测通道Ⅱ16和废液储液槽Ⅱ17，所述立方体阵列区Ⅰ14入口与第一层微流控芯片的分离槽Ⅰ11连通、立方体阵列区Ⅰ14出口经分离槽Ⅱ15与检测通道Ⅱ16连通，检测通道Ⅱ16的末端连接废液储液槽Ⅱ17；所述立方体阵列区Ⅰ14的微柱间隔为18-22μm；

第三层微流控芯片上设置立方体阵列区Ⅱ18、检测通道Ⅲ19和废液储液槽Ⅲ20，所述立方体阵列区Ⅱ18入口与第二层微流控芯片的分离槽Ⅱ15连通、立方体阵列区Ⅱ18出口经检测通道Ⅲ19连接废液储液槽Ⅲ20；所述立方体阵列区Ⅱ18的微柱间隔为9-11μm。

本发明所述样品槽7、鞘液槽A8和鞘液槽B9均通过各自的通道连接到混合液通道10的一端。

本发明所述样品前处理组件1包括滤网，所述数据处理组件6使用包括微处理器；所述光检测组件5包括光电倍增管或单光子计数模块。

本发明所述样品前处理组件1封装在平台2的顶部，光检测组件5在平台2的内部位于分离组件3的下方，数据处理组件6在平台2的外部且封装在平台2的底部，光激发组件4在平台2的侧壁上且通过密封结构与平台2连接。

本发明所述分离组件3的每一层微流控芯片都有微通道，第一层微流控芯片微通道的开口面向下，第二层微流控芯片微通道的开口面向上，第三层微流控芯片微通道的开口面向上；第一层微流控芯片微通道包括样品通道、鞘液通道A、鞘液通道B、混合液通道10和检测通道Ⅰ12；第二层微流控芯片微通道包括检测通道Ⅱ16、立方体阵列区Ⅰ14与分离槽Ⅱ15之间的连接通道；第三层微流控芯片微通道包括检测通道Ⅲ19。

一种基于微流控芯片的船舶压载水快速检测装置的检测方法，包括如下步骤：

A、将样品溶液放到样品前处理组件1中将与检测物质的尺寸规格相差较大的物质与杂质过滤掉，处理完的样品经过前处理组件与分离组件3相连的微管进入分离组件3中的样品槽7；

将鞘液加入到鞘液槽A8和鞘液槽B9，在液体注射泵的推动作用下，使鞘液和前处理的样品分别沿着鞘液通道A、鞘液通道B和样品通道经过第一层微流控芯片的分离槽Ⅰ11，利用立方体阵列区Ⅰ14的过滤作用进行分离，尺寸规格大于立方体阵列区Ⅰ14的微柱间隔的细胞与微粒进入检测通道Ⅰ12，进行活性和数量的检测，然后流入废液储液槽Ⅰ13；同理第二层微流控芯片进行尺寸规格在立方体阵列区Ⅱ18的微柱间隔与立方体阵列区Ⅰ14的微柱间隔之间的细胞与微粒的分离与活性和数量的检测；第三层微流控芯片进行尺寸规格在立方体阵列区Ⅱ18的微柱间隔以下的细胞和微粒的分离、并进行活性和数量的检测。

B、当有样品进入任一个分离槽时，开启光激发组件4、光检测组件5、数据处理组件6、鞘液槽的液体注射泵，使鞘液和微藻分别沿着鞘液通道和样品通道经过检测通道流向废液储液槽，微藻经过检测区域时微藻单细胞内叶绿素被激发光激发产生瞬时光子辐射；

C、通过脉冲信号的强弱和数量，获取船舶压载水中微藻活性强弱和微藻数量。

本发明的一个实施例如下：

本发明的检测方法，包括如下步骤：

1、将5μL船舶压载水样品放入样品前处理组件1中进行粗过滤和提纯，处理完的样品会在样品前处理组件7与分离组件3相连的微管中进入分离组件3中的样品槽7，将10μL鞘液分别加入到鞘液槽A8和鞘液槽B9，开启光激发组件4、光检测组件5、数据处理组件6，开启鞘液槽鞘液槽A8、鞘液槽B9和样品槽7的液体注射泵，使鞘液和前处理完的样品分别沿着混合液通道10进入分离槽Ⅰ11进行分离，分离后的物质进入检测通道Ⅰ12对物质进行检测，同理，其余两层微流控芯片分离后的物质进入检测通道Ⅱ16和检测通道Ⅲ19，混合液经过以上三层微流控芯片的分离槽，完成分离，然后每一层微流控芯片的不同尺寸规格的物质进入各层的检测区域。

2、由于船舶压载水中微藻经过检测区域时微藻单细胞内叶绿素被激发光激发产生瞬时光子辐射；所以通过各层检测区域的微藻就会被光激发组件4激发出光信号。

3、利用光检测组件5接收每个微藻发出的由激发光激发产生的光信号。

4、利用数据处理组件6，将光信号转化为数字脉冲信号，可以通过脉冲的个数确定微藻在样品中的微藻的密度。

通过以上步骤完成了对不同尺寸规格的微藻和微粒进行快速的分离与检测。