一种金银花多酚氧化酶复合抑制剂的制备方法及应用与流程

本发明涉及一种金银花多酚氧化酶复合抑制剂的制备方法及应用，属于中药炮制领域。

背景技术：

金银花为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或初开的花，其性寒、味甘；归肺、胃经；具有清热解毒，疏散风热的功效。作为药食两用的大宗中药，金银花具有很高的医疗保健作用和极高的经济价值。金银花采摘期为每年5至9月份，新鲜的金银花颜色绿白、花蕾饱满、含水量高、贮藏困难。金银花主要保藏方法是采摘后立即脱水干制，目前我国金银花的干燥方法主要采用热风干燥法。但金银花经热风干燥处理会产生酶促褐变并伴随着绿原酸、木犀草苷等有效成分含量的降低，从而导致其药用价值的降低，直接影响其品质、外观和商业价值。此外，金银花花期长,开花次数多(可达4-6茬)，传统干燥工艺干燥后，仅1、2茬可达到药典标准，因此减缓、抑制金银花的酶促褐变受到越来越多的关注。

目前防止金银花褐变的主要措施有:热风干燥、真空干燥、微波真空联合干燥、热泵远红外联合干燥等干燥方法，近年也有人采用抗坏血酸、4-己基间苯二酚、l-半胱氨酸、柠檬酸、丙酮等单一抑制剂对提取的多酚氧化酶进行体外抑制研究。

真空干燥、微波真空联合干燥、热泵远红外联合干燥等干燥方法存在设备投资大，且对金银花中指标性成分木犀草苷含量提高不明显等问题。

本发明利用复方多酚氧化酶抑制剂，对新鲜金银花褐变进行控制，提高金银花中指标性成分木犀草苷含量，不仅可增加1-2茬金银花的品质，还可使3-4茬金银花有可能达到药典标准，提高药用金银花的产量和质量。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种复方多酚氧化酶抑制剂,所述抑制剂绿色环保，各组分协同效应好,防褐变能力强,能够对新鲜金银花在干燥过程中的褐变进行有效控制，对其指标性成分木犀草苷的含量有明显提高,对另一指标性成分绿原酸的含量也有一定程度的提高。

所述金银花多酚氧化酶复合抑制剂，其特征在于，含有曲酸、维生素c、β-环糊精、氯化钠，为水溶液。

所述金银花多酚氧化酶复合抑制剂水溶液中含有0.1～0.4％质量分数的曲酸、0.005～0.015％质量分数的维生素c、0.05～0.15％质量分数的β-环糊精、0.5～1.5％质量分数的氯化钠。优选维生素c、β-环糊精、曲酸、氯化钠质量百分含量分别为0.01％、0.10％、0.40％、0.50％。

所述金银花多酚氧化酶复合抑制剂以水为溶剂。

制备方法：将曲酸、维生素c、β-环糊精、氯化钠溶于蒸馏水中即可。

本发明的金银花多酚氧化酶复合抑制剂用于控制新鲜金银花褐变，提高金银花中指标性成分木犀草苷含量。

进一步将待处理的新鲜金银花浸泡在配制好的金银花多酚氧化酶复合抑制剂水溶液中120分钟，沥干水分后，风干干燥；优选，金银花与复方多酚氧化酶抑制剂水溶液的质量比为1:8。

采用本发明金银花多酚氧化酶复合抑制处理金银花后木犀草苷含量的测定方法，其特征在于，采用高效液相色谱法，具体操作如下：

①对照品溶液的制备

精密称定1.06mg木犀草苷对照品，10.02mg绿原酸对照品，置25ml棕色量瓶中，加入70％乙醇溶解并定容，配制成每1ml含42.40μg的木犀草苷，含400.80μg的绿原酸的混合对照品溶液，冰箱冷藏保存；

②供试品溶液的制备

精密称取金银花粉末(过四号筛)约2g，置200ml具塞锥形瓶中，精密入70％乙醇50ml，称定重量，超声(功率250w,频率35khz)60min，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml，挥干溶剂，残渣加70％乙醇溶解，置5ml棕色量瓶中，加70％乙醇定容，摇匀，即得；上述70％乙醇指的是质量百分含量为70％的乙醇水溶液；

③含量测定色谱条件

色谱柱：色谱柱：zorbaxsb-phenyl柱，4.6mm×250mm，3.5μm，柱温：20℃，检测波长：350nm，流速：1ml/min，流动相：乙腈-质量百分含量为5％冰醋酸水溶液进行梯度洗脱，0～15min，10％乙腈→20％乙腈；15～32min，20％乙腈；32～38min，20％乙腈→35％乙腈；38～40min，35％乙腈→10％乙腈；40～50min，10％乙腈，流速：1.0ml/min，检测波长：350nm，柱温：20℃，进样量：10μl，理论板数按木犀草苷计算不低于20000，上述乙腈的百分含量为乙腈在流动相的体积百分含量；

采用本发明的抑制剂能明显提高木犀草苷的含量,对另一指标性成分绿原酸的含量也有一定程度的提高。采用本发明的木犀草苷含量的测定方法，是对药典的改进，能准确测得木犀草苷含量。

附图说明

图1为木犀草苷含量测定线性关系图；

图2为木犀草苷+绿原酸混合对照品hplc图；

图3为直接干燥的金银花中木犀草苷hplc图；

图4为采用复方多酚氧化酶抑制剂处理后的金银花中木犀草苷hplc图；

图5为绿原酸含量测定线性关系图；

图6为绿原酸对照品hplc图；

图7为直接干燥的金银花中绿原酸hplc图；

图8为采用复方多酚氧化酶抑制剂处理后的金银花中绿原酸hplc图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

采用本发明金银花多酚氧化酶复合抑制处理金银花后木犀草苷含量的测定方法，采用高效液相色谱法，具体操作如下：

④对照品溶液的制备

精密称定1.06mg木犀草苷对照品，10.02mg绿原酸对照品，置25ml棕色量瓶中，加入70％乙醇溶解并定容，配制成每1ml含42.40μg的木犀草苷，含400.80μg的绿原酸的混合对照品溶液，冰箱冷藏保存；

⑤供试品溶液的制备

精密称取金银花粉末(过四号筛)约2g，置200ml具塞锥形瓶中，精密入70％乙醇50ml，称定重量，超声(功率250w,频率35khz)60min，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml，挥干溶剂，残渣加70％乙醇溶解，置5ml棕色量瓶中，加70％乙醇定容，摇匀，即得；上述70％乙醇指的是质量百分含量为70％的乙醇水溶液；

⑥含量测定色谱条件

色谱柱：色谱柱：zorbaxsb-phenyl柱，4.6mm×250mm，3.5μm，柱温：20℃，检测波长：350nm，流速：1ml/min，流动相：乙腈-质量百分含量为5％冰醋酸水溶液进行梯度洗脱，0～15min，10％乙腈→20％乙腈；15～32min，20％乙腈；32～38min，20％乙腈→35％乙腈；38～40min，35％乙腈→10％乙腈；40～50min，10％乙腈，流速：1.0ml/min，检测波长：350nm，柱温：20℃，进样量：10μl，理论板数按木犀草苷计算不低于20000，上述乙腈的百分含量为乙腈在流动相的体积百分含量。

所述绿原酸的含量的测定方法按《中国药典》2015版绿原酸的测定方法进行，具体操作如下：

①绿原酸对照品溶液的制备精密称定10.02mg绿原酸对照品，置25ml棕色量瓶中，加入50％甲醇溶解并定容；再精密量取1ml，置10ml棕色量瓶中，加入50％甲醇定容，配制成每1ml含40.08μg的绿原酸对照品溶液，冰箱冷藏保存。

②绿原酸供试品溶液的制备精密称取金银花粉末(过四号筛)0.5g，置200ml具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醉50ml，称定重量。超声处理(功率250w，频率35khz)30min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失量，摇匀，滤过。精密移取续滤液5ml，置25ml棕色量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

③绿原酸含量测定色谱条件色谱柱：inertsilods-3c18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-0.4％磷酸溶液(13:87)，流速：1.0ml/min，检测波长：327nm，柱温：室温，进样量：10μl，理论板数按绿原酸计算不低于1000。

实施例1

1、新鲜金银花的褐变抑制

(1)原料金银花的选择:选择新鲜、无病害、表皮无明显损伤、无发黄的新鲜的金银花花蕾。

本实施例中金银花于2016年7月28日采自河北省邢台市巨鹿(第三茬金银花)。

(2)复方多酚氧化酶抑制剂配方一的配置：将维生素c、β-环糊精、曲酸、氯化钠分别按照质量百分比0.01％、0.10％、0.40％、0.50％进行称量并溶解在100ml水中。

(3)防褐变处理:将挑选好的金银花按1:8(质量比)的料液比浸泡在配制好的复方多酚氧化酶抑制剂水溶液中120分钟后取出沥干。

(4)干燥处理，将用复方多酚氧化酶抑制剂配方一处理的金银花样品和未处理的金银花同时用热风干燥法干燥处理。

2、褐变抑制效果评价：药典规定金银花按干燥品计算，含木犀草苷不得少于0.050％。采用高效液相色谱法测定，直接进行热风干燥的金银花中木犀草苷含量为0.04356％，采用配方一处理的金银花中木犀草苷含量为0.06706％，经配方一处理的第三茬金银花中木犀草苷含量比直接热风干燥的提高了53.95％，并达到了药典要求，绿原酸含量提高了11.34％。

实施例2

1、新鲜金银花的褐变抑制

(1)原料金银花的选择:选择新鲜、无病害、表皮无明显损伤、无发黄的新鲜的金银花花蕾。

本实施例中金银花于2016年7月28日采自河北省邢台市巨鹿(第三茬金银花)。

(2)复方多酚氧化酶抑制剂配方二的配置：将维生素c、β-环糊精、曲酸、氯化钠分别按照质量百分比0.015％、0.10％、0.40％、1.00％进行称量并溶解在100ml水中。

(3)防褐变处理:将挑选好的金银花按1:8(质量比)的料液比浸泡在配制好的复方多酚氧化酶抑制剂水溶液中120分钟后取出沥干。

(4)干燥处理，将用复方多酚氧化酶抑制剂配方二处理的金银花样品和未处理的金银花同时用热风干燥法干燥处理。

2、褐变抑制效果评价：药典规定金银花按干燥品计算，含木犀草苷不得少于0.050％。采用高效液相色谱法测定，直接进行热风干燥的金银花中木犀草苷含量为0.04356％，采用配方二处理的金银花中木犀草苷含量为0.06588％，经配方二处理的第三茬金银花中木犀草苷含量比直接热风干燥的提高了51.24％，并达到了药典要求，绿原酸含量提高了13.56％。

实施例3

1、新鲜金银花的褐变抑制

(1)原料金银花的选择:选择新鲜、无病害、表皮无明显损伤、无发黄的新鲜的金银花花蕾。

本实施例中金银花于2016年7月28日采自河北省邢台市巨鹿(第三茬金银花)。

(2)复方多酚氧化酶抑制剂配方三的配置：将维生素c、β-环糊精、曲酸、氯化钠分别按照质量百分比0.015％、0.10％、0.25％、0.50％进行称量并溶解在100ml水中。

(3)防褐变处理:将挑选好的金银花按1:8(质量比)的料液比浸泡在配制好的复方多酚氧化酶抑制剂水溶液中120分钟后取出沥干。

(4)干燥处理，将用复方多酚氧化酶抑制剂配方三处理的金银花样品和未处理的金银花同时用热风干燥法干燥处理。

2、褐变抑制效果评价：药典规定金银花按干燥品计算，含木犀草苷不得少于0.050％。采用高效液相色谱法测定，直接进行热风干燥的金银花中木犀草苷含量为0.04356％，采用配方三处理的金银花中木犀草苷含量为0.06350％，经配方三处理的第三茬金银花中木犀草苷含量比直接热风干燥的提高了45.77％，并达到了药典要求，绿原酸含量提高了10.74％。

从实验结果可以看出,以上三种复方多酚氧化酶抑制剂对于金银花中木犀草苷含量均有明显提高，并且均使试验所用的第三茬金银花中木犀草苷含量达到药典要求，其中配方一效果最好。由此可见复方多酚氧化酶抑制剂能够对新鲜金银花的褐变进行有效控制，显著提高其指标性成分木犀草苷的含量，另一指标性成分绿原酸的含量也有所提高，使3茬金银花可做药用，增加了金银花的产量和质量，具有较好的经济价值和广泛的应用前景。