本发明涉及一种检测方法，具体是一种青霉素检测方法。
背景技术：
抗生素作为一种主要的代表性兽药，在食品安全及世界贸易迅速发展的今天，受到了广泛的关注，目前对其检测仍然主要集中在动物源性食品中，主要的检测方法有高效液相色谱法，高效液相色谱-串联质谱法，毛细管电泳法，酶联免疫法。抗生素菌渣是抗生素生产企业在生产过程中的废弃物，底物主要由大豆、花生饼、玉米蛋白、淀粉等组成，外观呈豆腐渣样，气味因培养的菌类不同而异；内部含粗蛋白、脂肪、糖份等营养成分以及水和少量的抗生素残留成份，当环境温度在15～20℃时24小时、25～0℃时3小时会变臭液化，遇水、雨、雪、雾或蒸汽时会加速液化变质。一般每100m³的发酵液可形成约30～40m³的湿菌渣，据有关资料统计，我国年排放量约为100万吨以上。由于药渣黏度大，不能排入下水道，只能占用土地堆放。如果这些药渣不能被无害化处置利用，不仅会浪费大量资源，而且会污染生态环境。过去一直对菌渣采用干燥加工处理后作为饲料或饲料添加剂使用。但是，目前研究结果发现，药渣中的微量抗生素容易在被饲喂的畜禽体内残留，长期食用这种含有药物残留的动物源性食品，会对人类肝脏造成损伤。章明奎等人对抗生素诱导土壤可培养细菌产生耐药性进行了研究。抗生素在菌丝体残留量的检测在国外研究尚早，主要的检测方法是高效液相色谱法，1994年，L.H.Christensen等人所建立的青霉素发酵过程中中间产物的高效液相色谱法作为一种经典的检测方法被广泛使用，C18柱子被用来进行分离，乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液作为流动相，之后也有一些文献报道了青霉素G及其降解产物的高效液相色谱法。但这些方法的灵敏度均较低，不能满足现代残留检测分析的要求。目前在国内文献中鲜少提到菌渣中抗生素的残留检测方法，且方法较不完善，并没有明确的方法检出限及回收率实验，不具有明显的可靠性，因此尚需要进一步研究，其中，刘慧娟等人在青霉素酶在青霉素菌渣无害化处理中的应用中采用高效液相色谱法进行了研究，此外，微生物法在菌渣中抗生素残留的检测也有应用，但本方法不具有一定的专一性，所测抗生素可能含有其降解产物。因此，准确可靠的残留检测方法还有待探讨。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种青霉素检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种青霉素检测方法，包括如下步骤：（1）配制细菌内毒素检测用分散液：取甘油、阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂，溶于注射用水或细菌内毒素检查用水中，调pH至6～8，去内毒素，得分散液，其中，甘油浓度为0.1～2%（v/v），阴离子表面活性剂浓度为0.05～0.5%（w/v），非离子表面活性剂浓度为0.1～1%（v/v）；（2）绘制标准曲线，拟合标准曲线方程：青霉素标准品溶解于溶剂中，并利用溶剂稀释配制成浓度在0.1μg·m ML-1～2000μg·m ML-1之间不同梯度浓度的青霉素标准溶液，然后采用0.45μm针头过滤器过滤，利用高效液相色谱法进行检测，以色谱峰面积为纵坐标、以青霉素标准溶液浓度为横坐标将高效液相色谱法检测绘制成标准曲线，然后进行拟合，得到标准曲线方程：Y=kX+b，方程中Y表示色谱峰面积，X表示青霉素的浓度，k和b为常数；所述的溶剂由乙腈和水按乙腈与水的体积比为1:1混合而成；（3）提取：首先将青霉素菌渣加入提取液中，混合均匀后超声提取25min～35min，然后进行离心分离，离心分离得到的上清液即为青霉素粗提液，向青霉素粗提液中加入无水硫酸钠和正己烷，再次进行离心分离，离心分离后分三层，取中间层，即为青霉素提取液；所述的青霉素菌渣的质量与提取液的体积比为1g:(3mL～5mL)；所述的提取液由乙腈和质量分数为0.3%的甲酸水溶液按乙腈与质量分数为0.3%的甲酸水溶液的体积比为3:1混合而成；所述的无水硫酸钠与青霉素菌渣的质量比为(0.8～1.2):1；所述的正己烷的体积与青霉素菌渣的质量比为(0.8mL～1.2mL):1g；（4）活化处理：首先采用5.0mL甲醇过WatersOasis-C18固相萃取小柱，然后采用5.0mL蒸馏水过WatersOasis-C18固相萃取小柱，即完成WatersOasis-C18固相萃取小柱活化处理；（5）洗脱：在过柱流速为1.0mL·min-1～3.0mL·min-1和真空条件下将步骤二得到的青霉素提取液过步骤三得到的活化处理后WatersOasis-C18固相萃取小柱，然后采用质量分数为5%的甲醇水溶液淋洗，再采用洗脱液进行洗脱，洗脱得到的液体在水浴温度为24℃～26℃下N2吹干，然后加入复溶溶剂溶解N2吹干得到的固体，然后采用0.45μm针头过滤器过滤，得到待检测液；所述的洗脱液的体积与步骤二中所述的青霉素菌渣的质量比为(0.6mL～1.0mL):1g；所述的洗脱液由乙腈和甲醇按乙腈与甲醇的体积比为3:1混合而成；所述的复溶溶剂的体积与步骤二中所述的青霉素菌渣的质量比为0.2mL:1g；所述的复溶溶剂由乙腈和水按乙腈与水的体积比为1:1混合而成。
作为本发明进一步的方案：所述阴离子表面活性剂HLB值为2～13。
作为本发明再进一步的方案：所述阴离子表面活性剂的HLB值为14～18。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明灵敏度高，可满足我国对于青霉素在动物性组织中的最高残留限量的检测要求，可为青霉素菌渣资源化利用为饲料提供一定的技术依据。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明实施例中，一种青霉素检测方法，包括如下步骤：（1）配制细菌内毒素检测用分散液：取甘油、阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂，溶于注射用水或细菌内毒素检查用水中，调pH至6～8，去内毒素，得分散液，其中，甘油浓度为0.1～2%（v/v），阴离子表面活性剂浓度为0.05～0.5%（w/v），非离子表面活性剂浓度为0.1～1%（v/v）；（2）绘制标准曲线，拟合标准曲线方程：青霉素标准品溶解于溶剂中，并利用溶剂稀释配制成浓度在0.1μg·m ML-1～2000μg·m ML-1之间不同梯度浓度的青霉素标准溶液，然后采用0.45μm针头过滤器过滤，利用高效液相色谱法进行检测，以色谱峰面积为纵坐标、以青霉素标准溶液浓度为横坐标将高效液相色谱法检测绘制成标准曲线，然后进行拟合，得到标准曲线方程：Y=kX+b，方程中Y表示色谱峰面积，X表示青霉素的浓度，k和b为常数；所述的溶剂由乙腈和水按乙腈与水的体积比为1:1混合而成；（3）提取：首先将青霉素菌渣加入提取液中，混合均匀后超声提取25min～35min，然后进行离心分离，离心分离得到的上清液即为青霉素粗提液，向青霉素粗提液中加入无水硫酸钠和正己烷，再次进行离心分离，离心分离后分三层，取中间层，即为青霉素提取液；所述的青霉素菌渣的质量与提取液的体积比为1g:(3mL～5mL)；所述的提取液由乙腈和质量分数为0.3%的甲酸水溶液按乙腈与质量分数为0.3%的甲酸水溶液的体积比为3:1混合而成；所述的无水硫酸钠与青霉素菌渣的质量比为(0.8～1.2):1；所述的正己烷的体积与青霉素菌渣的质量比为(0.8mL～1.2mL):1g；（4）活化处理：首先采用5.0mL甲醇过WatersOasis-C18固相萃取小柱，然后采用5.0mL蒸馏水过WatersOasis-C18固相萃取小柱，即完成WatersOasis-C18固相萃取小柱活化处理；（5）洗脱：在过柱流速为1.0mL·min-1～3.0mL·min-1和真空条件下将步骤二得到的青霉素提取液过步骤三得到的活化处理后WatersOasis-C18固相萃取小柱，然后采用质量分数为5%的甲醇水溶液淋洗，再采用洗脱液进行洗脱，洗脱得到的液体在水浴温度为24℃～26℃下N2吹干，然后加入复溶溶剂溶解N2吹干得到的固体，然后采用0.45μm针头过滤器过滤，得到待检测液；所述的洗脱液的体积与步骤二中所述的青霉素菌渣的质量比为(0.6mL～1.0mL):1g；所述的洗脱液由乙腈和甲醇按乙腈与甲醇的体积比为3:1混合而成；所述的复溶溶剂的体积与步骤二中所述的青霉素菌渣的质量比为0.2mL:1g；所述的复溶溶剂由乙腈和水按乙腈与水的体积比为1:1混合而成。所述阴离子表面活性剂HLB值为2～13。所述阴离子表面活性剂的HLB值为14～18。
实施例1：
本发明青霉素检测方法，包括如下步骤：（1）配制细菌内毒素检测用分散液：取甘油、阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂，溶于注射用水或细菌内毒素检查用水中，调pH至6，去内毒素，得分散液，其中，甘油浓度为0.1%（v/v），阴离子表面活性剂浓度为0.05%（w/v），非离子表面活性剂浓度为0.1%（v/v）；（2）绘制标准曲线，拟合标准曲线方程：青霉素标准品溶解于溶剂中，并利用溶剂稀释配制成浓度在0.1μg·mL-1～2000μg·mL-1之间不同梯度浓度的青霉素标准溶液，然后采用0.45μm针头过滤器过滤，利用高效液相色谱法进行检测，以色谱峰面积为纵坐标、以青霉素标准溶液浓度为横坐标将高效液相色谱法检测绘制成标准曲线，然后进行拟合，得到标准曲线方程：Y=kX+b，方程中Y表示色谱峰面积，X表示青霉素的浓度，k和b为常数；所述的溶剂由乙腈和水按乙腈与水的体积比为1:1混合而成；（3）提取：首先将青霉素菌渣加入提取液中，混合均匀后超声提取25min～35min，然后进行离心分离，离心分离得到的上清液即为青霉素粗提液，向青霉素粗提液中加入无水硫酸钠和正己烷，再次进行离心分离，离心分离后分三层，取中间层，即为青霉素提取液；所述的青霉素菌渣的质量与提取液的体积比为1g:(3mL～5mL)；所述的提取液由乙腈和质量分数为0.3%的甲酸水溶液按乙腈与质量分数为0.3%的甲酸水溶液的体积比为3:1混合而成；所述的无水硫酸钠与青霉素菌渣的质量比为(0.8～1.2):1；所述的正己烷的体积与青霉素菌渣的质量比为(0.8mL～1.2mL):1g；（4）活化处理：首先采用5.0mL甲醇过WatersOasis-C18固相萃取小柱，然后采用5.0mL蒸馏水过WatersOasis-C18固相萃取小柱，即完成WatersOasis-C18固相萃取小柱活化处理；（5）洗脱：在过柱流速为1.0mL·min-1～3.0mL·min-1和真空条件下将步骤二得到的青霉素提取液过步骤三得到的活化处理后WatersOasis-C18固相萃取小柱，然后采用质量分数为5%的甲醇水溶液淋洗，再采用洗脱液进行洗脱，洗脱得到的液体在水浴温度为24℃～26℃下N2吹干，然后加入复溶溶剂溶解N2吹干得到的固体，然后采用0.45μm针头过滤器过滤，得到待检测液；所述的洗脱液的体积与步骤二中所述的青霉素菌渣的质量比为(0.6mL～1.0mL):1g；所述的洗脱液由乙腈和甲醇按乙腈与甲醇的体积比为3:1混合而成；所述的复溶溶剂的体积与步骤二中所述的青霉素菌渣的质量比为0.2mL:1g；所述的复溶溶剂由乙腈和水按乙腈与水的体积比为1:1混合而成。所述阴离子表面活性剂HLB值为2。所述阴离子表面活性剂的HLB值为14。
实施例2：
青霉素检测方法，包括如下步骤：（1）配制细菌内毒素检测用分散液：取甘油、阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂，溶于注射用水或细菌内毒素检查用水中，调pH至8，去内毒素，得分散液，其中，甘油浓度为2%（v/v），阴离子表面活性剂浓度为0.5%（w/v），非离子表面活性剂浓度为1%（v/v）；（2）绘制标准曲线，拟合标准曲线方程：青霉素标准品溶解于溶剂中，并利用溶剂稀释配制成浓度在0.1μg·m min-1～2000μg·m min-1之间不同梯度浓度的青霉素标准溶液，然后采用0.45μm针头过滤器过滤，利用高效液相色谱法进行检测，以色谱峰面积为纵坐标、以青霉素标准溶液浓度为横坐标将高效液相色谱法检测绘制成标准曲线，然后进行拟合，得到标准曲线方程：Y=kX+b，方程中Y表示色谱峰面积，X表示青霉素的浓度，k和b为常数；所述的溶剂由乙腈和水按乙腈与水的体积比为1:1混合而成；（3）提取：首先将青霉素菌渣加入提取液中，混合均匀后超声提取25min～35min，然后进行离心分离，离心分离得到的上清液即为青霉素粗提液，向青霉素粗提液中加入无水硫酸钠和正己烷，再次进行离心分离，离心分离后分三层，取中间层，即为青霉素提取液；所述的青霉素菌渣的质量与提取液的体积比为1g:(3mL～5mL)；所述的提取液由乙腈和质量分数为0.3%的甲酸水溶液按乙腈与质量分数为0.3%的甲酸水溶液的体积比为3:1混合而成；所述的无水硫酸钠与青霉素菌渣的质量比为(0.8～1.2):1；所述的正己烷的体积与青霉素菌渣的质量比为(0.8mL～1.2mL):1g；（4）活化处理：首先采用5.0mL甲醇过WatersOasis-C18固相萃取小柱，然后采用5.0mL蒸馏水过WatersOasis-C18固相萃取小柱，即完成WatersOasis-C18固相萃取小柱活化处理；（5）洗脱：在过柱流速为1.0mL·min-1～3.0mL·min-1和真空条件下将步骤二得到的青霉素提取液过步骤三得到的活化处理后WatersOasis-C18固相萃取小柱，然后采用质量分数为5%的甲醇水溶液淋洗，再采用洗脱液进行洗脱，洗脱得到的液体在水浴温度为26℃下N2吹干，然后加入复溶溶剂溶解N2吹干得到的固体，然后采用0.45μm针头过滤器过滤，得到待检测液；所述的洗脱液的体积与步骤二中所述的青霉素菌渣的质量比为(0.6mL～1.0mL):1g；所述的洗脱液由乙腈和甲醇按乙腈与甲醇的体积比为3:1混合而成；所述的复溶溶剂的体积与步骤二中所述的青霉素菌渣的质量比为0.2mL:1g；所述的复溶溶剂由乙腈和水按乙腈与水的体积比为1:1混合而成。所述阴离子表面活性剂HLB值为13。所述阴离子表面活性剂的HLB值为18。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。