技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是一种猪圆环病毒2型疫苗效力检验方法。
背景技术：
猪圆环病毒2型(porcine cirovirus type 2,PCV2)是引起仔猪断奶多系统衰竭综合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原。自1991年在加拿大猪群中暴发以来，PMWS已经波及全球，给全世界养猪业造成了巨大的经济损失。PCV2还与增生性坏死性肺炎、母猪繁殖障碍、猪皮炎与肾病综合征和猪呼吸道疾病综合征相关。猪圆环病毒相关疾病(PCV2Associated Disease，PCVD)，主要是PMWS，在2005年给欧洲造成的损失高达6亿欧元。PCV2感染性疾病引起死亡率增高、饲料报酬降低，加上我国规模化猪场饲养管理水平相对较为落后，因此PCVD也给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。
目前，国际上上市的PCV2疫苗分为灭活疫苗、亚单位疫苗和嵌合灭活苗。PCV2疫苗效力检验方法通常是采用仔猪攻毒实验的方法。而我国猪群PCV2污染严重，对于筛选出合格的用于PCV2疫苗开发或者疫苗效力检验的实验猪比较困难，而且仔猪攻毒实验方法存在费时、费力、费钱及PCV2攻毒模型建立困难、检验结果批间差异大等问题。
技术实现要素：
鉴于此，本发明通过猪圆环病毒2型疫苗免疫小白鼠，测定其血清中PCV2特异性抗体水平，提供了一种简捷有效的PCV2疫苗效力检验方法。包括下述步骤：
1.小白鼠的免疫
将猪圆环病毒2型疫苗经皮下免疫小白鼠，10-21天后再按照相同的免疫途径和剂量进行加强免疫一次；
2小白鼠抗体水平的测定
加强免疫14-28天后，处死小白鼠，采集并分离血清，测定抗体水平；
本发明所述的猪圆环病毒2型灭活疫苗效力的检验方法中，所述小白鼠的免疫剂量为0.1-0.2ml，并且分4点免疫。
本发明所述的猪圆环病毒2型疫苗效力检验方法中，所述小白鼠抗体水平的测定方法包括如下操作步骤，
①将待检血清用PBS做倍比稀释；
②加入已经包被PCV2Cap蛋白的ELISA酶标板中；
③放入37℃温箱，作用1h；
④弃去一抗，PBST洗涤；
⑤加入PBS稀释的HRP标记羊抗鼠IgG(二抗)，放入37℃温箱，作用1h；
⑥弃去二抗，用PBST洗涤；
⑦加入显色液进行显色；
⑧加入终止液终止显色；
⑨酶标仪读取OD450，判定疫苗效力；
所述稀释液、洗涤液、显色液、终止液均为现有技术的常规用液。
最优地，本发明所述的首次免疫小白鼠的时间为14天。
最优地，本发明所述的加强免疫小白鼠的时间为21天。
本发明具有如下技术效果：
1.检测时间短，比猪体内效力检验的时间至少减少20天；
2.本发明方法操作简单，可重复性好，结果准确。
3.小白鼠遗传稳定，不会出现实验动物个体差异而引起的实验结果差异显著；
4.用疫苗免疫小白鼠操作简单，同时不需要买大量的实验猪，大大节约了成本、人力，提高了疫苗检测的效率。
具体实施方式
本发明的实施例中利用平行实验的方法建立了免疫小白鼠抗体水平、免疫猪抗体水平及仔猪攻毒保护的关系，发现免疫小白鼠抗体水平与免疫后猪的抗体水平及攻毒后淋巴结感染存在平行关系。应用本发明的方法，可以替代通常采用的PCV2疫苗免疫猪抗体水平实验以及仔猪攻毒保护实验。本发明实施例中还利用本发明检测方法制定出PCV2疫苗效力的合格标准，为PCV2疫苗的大规模生产和检测提供了基础。
实施例1
猪圆环病毒2型灭活疫苗效力的检测
1.灭活疫苗来源
PCV2灭活疫苗的毒株为PCV2-SH株(保藏号CGMCC No.2389)。将PCV2-SH株接种PK15细胞，5天后收获病毒抗原液做为灭活疫苗。
将制备的灭活疫苗分为三组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，其抗原含量经测定分别为105.0TCID50/ml、105.5TCID50/ml、106.0TCID50/ml。下面以三组灭活疫苗为样品，免疫小白鼠测定其血清抗体水平。
2.免疫小白鼠抗体检测
(1)BALB/c小白鼠的免疫
将5-6周龄健康的BALB/c小鼠随机分为4组，每组5只，Ⅰ组采用抗原含量105.0TCID50/ml的猪圆环病毒2型灭活疫苗免疫，Ⅱ组采用抗原含量105.5TCID50/ml的猪圆环病毒2型灭活疫苗免疫，Ⅲ组采用抗原含量106.0TCID50/ml的猪圆环病毒2型灭活疫苗免疫，Ⅳ组为空白组。分四点免疫，每个点免疫0.05ml，14天后再按照相同的免疫途径和剂量加强免疫一次。
(2)小白鼠抗体水平的测定
加强免疫21天后，通过摘除眼球，采集分离血清，测定其抗体水平。操作步骤如下：
①待检血清用稀释液做1:50倍稀释，然后再做2倍系列稀释，至1:102400；
②将稀释后的血清分别加入已经包被PCV2Cap蛋白的ELISA酶标板中，PCV2Cap蛋白由大肠杆菌表达系统表达纯化获得，包被量为0.5μg/孔，步骤①中12个稀释度每个稀释度加1孔，每孔100μl。同时设立小白鼠相同稀释度的阴性血清对照组；
③放入37℃温箱，作用1h；
④弃去一抗，加入洗涤液，300μl/孔，洗涤3次，每次3-5min；
⑤加入用稀释液作5000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG(二抗)，100μl/孔；放入37℃温箱，作用1h；
⑥弃去二抗，用洗涤液，洗涤3次，每次3-5min；
⑦加入显色液100μl/孔，进行室温避光显色10-15min；
⑧加入终止液100μl/孔，终止显色；
⑨酶标仪读取OD450；
⑩结果判定方法：待检血清OD450/同稀释度阴性血清OD450≥2.1判定为阳性结果；待检血清OD450/同稀释度阴性血清OD450≤2.1判定为阴性结果。以阳性结果的最大稀释度做为小白鼠的抗体水平。
小白鼠抗体水平检测结果如下：
I组：5只小白鼠的抗体效价分别为1:200、1:200、1:200、1:200、1:400；Ⅱ组5只小白鼠的抗体效价分别为1:400、1:400、1:400、1:800、1:800；Ⅲ组5只小白鼠的抗体效价分别为1:800、1:800、1:800、1:800、1:1600；Ⅳ组即空白组5只小白鼠的抗体效价均≤1:50。
所用溶液如下：
稀释液配方：
十二水磷酸氢二钠 2.9克
磷酸二氢钾 0.2克
氯化钠 8.0克
氯化钾 0.2克
加水定容至1000ml。
洗涤液配方：
十二水磷酸氢二钠 2.9克
磷酸二氢钾 0.2克
氯化钠 8.0克
氯化钾 0.2克
吐温-20 0.5ml
加水定容至1000ml。
显色液配方：
TMB底物液：(1mg/ml)
TMB粉末 0.01g
DMSO 10ml
TMB底物显色缓冲液(pH5.0,100ml)
柠檬酸：1.02克
十二水磷酸氢二钠 3.69克
显色液：避光显色
TMB底物液 1ml
TMB底物显色缓冲液 9ml
30％双氧水 10μl
终止液配方：2mol/L硫酸
3.猪圆环病毒2型灭活疫苗免疫猪抗体水平测定
(1)实验猪的免疫
将21日龄健康的PCV2抗原抗体阴性及猪蓝耳病抗原抗体阴性断奶仔猪，随机分为4组，每组5只，Ⅰ组采用抗原含量105.0TCID50/ml的猪圆环病毒2型灭活疫苗免疫，Ⅱ组采用抗原含量105.5TCID50/ml的猪圆环病毒2型灭活疫苗免疫，Ⅲ组采用抗原含量106.0TCID50/ml的猪圆环病毒2型灭活疫苗免疫，Ⅳ组为空白组。每头免疫1ml，14天后再按照相同的免疫途径和剂量加强免疫一次。
(2)猪抗体水平的测定
加强免疫21天后，通过前腔静脉进行采血，分离血清，测定其抗体水平。抗体测定方法操作步骤如下：
①待检血清用稀释液做1:50倍稀释，然后再做2倍系列稀释，至1：102400；
②将稀释后的血清分别加入已经包被PCV2Cap蛋白的ELISA酶标板中，PCV2Cap蛋白由大肠杆菌表达系统表达纯化获得，包被量为0.5μg/96孔，每个稀释度加1孔，100μl/孔，同时设立仔猪阴性血清对照，做同样的稀释度；
③放入37℃温箱，作用1h；
④弃去一抗，加入洗涤液，300μl/孔，洗涤3次，每次3-5min；
⑤加入用稀释液做10000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗猪IgG(二抗)，100μl/孔；放入37℃温箱，作用1h；
⑥弃去二抗，用洗涤液；洗涤3次，每次3-5min；
⑦加入TMB显色液100μl/孔，进行室温避光显色10-15min；
⑧加入2mol/L H2SO4溶液100μl/孔，终止显色；
⑨酶标仪读取OD450；
⑩结果判定方法：待检血清OD450/同稀释度阴性血清OD450≥2.1判定为阳性结果；待检血清OD450/同稀释度阴性血清OD450≤2.1判定为阴性结果。以阳性结果的最大稀释度做为小白鼠的抗体水平。
猪抗体水平检测结果如下：
I组：5头猪的抗体效价分别为1:1600、1:1600、1:800、1:3200、1:6400；Ⅱ组5头猪的抗体效价分别为1:3200、1:3200、1:3200、1:3200、1:6400；Ⅲ组5头猪的抗体效价分别为1:3200、1:3200、1:6400、1:6400、1:12800；Ⅳ组即空白组5头猪的抗体效价均为≤1:50。
4.仔猪攻毒保护试验
目前，PCV2攻毒模型很难建立，是因为它的临床症状不明显，临床上主要是因为PCV2和其它病原混合感染，所以很难通过临床症状检验PCV2的感染状况。而PCV2在猪体内主要靶组织是淋巴组织。因此，本实施例采用采集攻毒后仔猪的肺门淋巴结或者腹股沟淋巴结，免疫组织化学(IHC)方法检测其抗原情况，以此判断仔猪攻毒保护结果。
将免疫组和空白组中的所有猪进行PCV2-SH株(106.0TCID50/ml)的攻毒。每头猪滴鼻1ml，颈部肌肉注射2ml，隔离饲养。攻毒后第4、7天分别在两腋下和两臀部注射弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(4mg/ml，0.5ml)和腹腔注射巯基乙酸培养基10ml。在第11天和19天腹腔注射巯基乙酸培养基10ml。攻毒后25天进行剖杀，采集肺门淋巴结或者腹股沟淋巴结进行固定，然后用IHC方法进行抗原检测，比较空白组和免疫组淋巴结中感染PCV2抗原情况，以此判断仔猪攻毒保护结果。试验结果见表1。
将猪圆环病毒2型灭活疫苗3个批次免疫小白鼠抗体水平与免疫猪抗体水平以及仔猪攻毒保护实验的结果，进行了比较，结果见表1。
表1.小白鼠抗体水平与猪抗体水平以及仔猪攻毒保护实验的关系
通过将不同抗原含量的3组猪圆环病毒2型疫苗免疫BALB/c小鼠和PCV2抗原抗体双阴性的断奶仔猪，通过比较免疫小白鼠抗体水平与免疫猪抗体水平，发现两者产生的PCV2抗体具有平行关系，即免疫小白鼠抗体水平与免疫猪抗体水平呈现正相关的关系。
对免疫后的仔猪进行了攻毒保护试验，通过对淋巴结中PCV2抗原的检测，发现仔猪攻毒后淋巴结中感染的PCV2的细胞所占的比例与免疫小白鼠抗体水平具有平行关系，即免疫小白鼠抗体水平越高，淋巴结中感染的PCV2的细胞所占的比例越小，说明表明保护性好；相反免疫小白鼠抗体水平越低，淋巴结中感染的PCV2的细胞所占的比例越大，说明表明保护性差。
3批不同抗原含量的疫苗的仔猪免疫攻毒保护试验结果显示抗原含量为105.0TCID50/ml的疫苗可以提供仔猪40％的保护力，抗原含量为105.5TCID50/ml的疫苗可以提供80％的保护力，抗原含量为106.0TCID50/ml的疫苗可以提供100％的保护力。我们也不难看出攻毒保护试验的结果与小白鼠抗体水平具有平行关系。同时由此可以得出105.5TCID50/ml的抗原为最小保护剂量，此剂量下的疫苗免疫小白鼠抗体水平为1:400或者1:800。由此，利用本发明检测方法可以制定出PCV2疫苗效力的合格标准。本实施例中，采用本发明的方法检测小白鼠抗体水平大于1:400，做为样品疫苗检验合格的标准，即可以达到对猪群产生80％保护率，有效防御PCVD的目的。
综上所述，可以得出免疫小白鼠抗体水平和猪的抗体水平及攻毒后淋巴结感染存在平行关系。应用PCV2疫苗免疫小白鼠，测定其血清中PCV2特异性抗体水平实验，可以替代现有猪圆环病毒2型灭活疫苗效力检验方法通常采用的疫苗免疫猪抗体水平实验以及仔猪攻毒保护实验。
本发明的疫苗效力的检验方法，首次免疫与加强免疫的时间间隔并不限于14天，首次免疫10-21天后再按照相同的免疫途径和剂量进行加强免疫，其疫苗效力的检验的结果与14天的结果无明显差异。加强免疫后与处死小鼠采集血样的时间间隔并不限于21天，加强免疫14-28天后，处死小白鼠，采集并分离血清，其疫苗效力的检验的结果与21天的结果无明显差异。
本发明所述的疫苗效力的检验方法，小白鼠的免疫剂量并不限于0.05ml，免疫剂量为0.1-0.2ml时，疫苗效力的检验的结果与免疫剂量为0.05ml的结果无明显差异。
本发明的检测疫苗的方法，不限于应用于PCV2灭活疫苗，因为其他类型的PCV2疫苗如基因工程疫苗、亚单位疫苗也可以在小白鼠体内引起免疫反应，其他类型PCV2疫苗，如基因工程疫苗、亚单位疫苗均可以用本发明之方法检测。
猪圆环病毒2型灭活疫苗免疫小白鼠抗体水平测定方法检测时间短，操作简单，成本低，得到的结果准确，可重复性好，具有很好的应用价值和广阔的市场前景。