一种烟草染色体显微切割技术的制作方法

本发明涉及一种烟草染色体显微切割技术，属于生物技术领域。

背景技术：

植物根尖细胞有丝分裂及染色体制片技术：植物生长旺盛的分生组织如根尖、茎尖、幼叶等都在进行着有丝分裂。取这些组织为材料，经过固定后迅速杀死细胞，并使细胞内的物质和生活状态得以保持，再经过解离、染色、压片等过程，可以迅速地将细胞分散附着于载玻片和盖玻片之间，在显微镜下就可以看到大量处于有丝分裂各个时期的细胞，并进行染色体观察。分裂中期，各染色体的着丝粒排列在赤道面上，两臂伸向赤道面的两旁。纺锤体完全形成，其一端与染色体的着丝粒相连接，另一端集中于细胞的极处。中期染色体高度浓缩，具有各物种染色体的典型形态，是染色体观察的最好时期。

植物染色体显微切割技术：植物染色体显微切割技术就是在显微镜下，主要采用微细玻璃针或激光对特定的染色体或染色体片段进行切割、分离，然后利用切割产物为模板进行外扩增，从而构建染色体或染色体区段特异性的DNA文库，其优点是可以根据研究者的需要，分离到任意一条染色体或染色体片段，快速地建立相应的DNA文库。

烟草根尖细胞压片法染色体制片技术：取种子在室温25℃条件下，摇床上水培振荡萌发，待幼根长至1-3 mm时，转移进行预处理，一般在材料进行有丝分裂高峰期前2-3 h，即8:30-11:30之间处理。预处理液一般有5种：对二氯苯饱和液；0.2%的秋水仙素；0.002 mol/L浓度的8-羟基喹啉溶液；5%的风油精溶液；20%的风油精溶液。预处理时间均为2 h，温度20-25℃。弃处理液后，用乙醇、冰乙酸(3:1)固定材料24 h，在转移至70%酒精溶液中，于0-4℃条件下储存备用。制片材料取根尖分生组织部分，用60℃ 1mol/L HCl恒温解离4-8 min，常规压片法制片，镜检。

由于烟草染色体微小，细胞壁难以充分解离，该技术难以得到分裂相多、分散度高的制片，难以对染色体的数目和形态特征进行定量、定性表述，影响染色体切割。

玉米单染色体的分离：(1)染色体标本制备。取玉米种子于培养皿内25℃ 培养生根，待根长至1-2cm 时加少许自来水于培养皿内，没过根尖，放于4℃冰箱内处理24 h。取根于95%乙醇中固定，置于-20℃过夜，然后换入70%乙醇中在-20℃保存待用。制备染色体标本时，取根尖于2%果胶酶与2%纤维素酶1:l混合液中37℃处理2.5h，常规压片，卡宝品红染色，液氮冰冻去盖片，稍气干后在无水乙醇中脱水2-5 min，立即用于显微分离染色体。(2)染色体显微分离。染色体制片在Olympus倒置显微15×(目镜)×40×(物镜)明视野内找到目标染色体后，在该处加1滴无菌水，用自制的微细玻璃针挑取目的染色体。将粘在微细玻璃针尖上的染色体及针尖一同折断于0.5ml Eppendorf管中，高速离心数秒，-20℃保存待用。

王百合单条染色体和染色体片段的分离：(1)染色体标本制备。取百合种子25℃下萌发。待约10 天后长出1-2cm根时，用0.017%的秋水仙素处理23 h，卡诺固定液(95%乙醇3：冰乙酸1)固定10min后转入70%乙醇中4℃保存待用。取根于2% 果胶酶与2%纤维素酶1:1比率的混合液中37℃酶解3h，蒸馏水洗净后取根尖分生组织少许，卡宝品红染色、压片。镜检后于液氮中速冻，用刀片揭掉盖片。将含有材料的载片放人70%乙醇中脱水5 min，气干后用于显微操作。(2)染色体的切割。用自制的直径1-2mm的玻棒，在Leitz拉针仪上或酒精灯微火上拉制尖端直径1-3μm的微细玻璃针，并将其下弯约1 20°(指针尖与操纵杆之间的角度)。在Leitz显微操作器( Code-No.93114)帮助下，于Leitz Laborlux 2 显微镜下10×(目镜)×10×(物镜)明视野内前后移动玻璃针尖切割百合染色体。(3)染色体和染色体片段的分离。在含有染色体和染色体片段的载片上滴加一小滴无菌水，用上述微细玻璃针轻轻触动染色体和染色体片段。待染色体和染色体片段脱离载片后使其吸附在玻璃针尖上, 轻轻移动玻璃针尖出液面。将玻璃针尖折断并将其及其上的染色体一起放人0.5ml的含有蛋白酶K反应液的Eppendorf管中，4℃保存备用。

水稻单染色体微分离：(1) 染色体标本制备。采用日本晴为背景的粳稻( O. sativa L. ssp. japonica)为材料。盆栽种植，待抽穗期叶耳间距为0cm左右时，取整穗在改良的卡诺固定液中(无水乙醇:冰醋酸=9:1)固定10min后转入70%乙醇中4℃保存。取固定的小穗先在蒸馏水中低渗处理约10min，剥出花药，先用一枚以卡宝品红染色压片。在显微镜下观察是否处于减数分裂终变期或中期I，若处于此时期则把其余花药也进行压片，每个载玻片压一枚花药。制片过程中所用染色液及制片用具均经严格灭菌处理。(2)染色体的显微分离。将制好的染色体标本用液氮冰冻后去掉盖片，于无菌室中放置，待其气干后在倒置显微镜(Olympus 1M )下用手工拉制的玻璃针(尖部直径1- 3μm，向下弯曲120°)借助Leitz显微操作器(Code-No. 933114)对识别的目的染色体进行前后左右的划动，轻轻刮取。最后将粘有目标染色体的玻璃针尖折断于含有20μl蛋白酶K (5 ng/μl，Sigma公司)，1×T4 DNA连接酶缓冲液(Promega公司)配制的0.5 ml Eppendorf管中，12000 r/min离心数秒，-20℃保存待用。

现有的染色体切割技术主要采用ACAS570UVC紫外激光扫描共焦显微系统、流式染色体分级器和玻璃针进行染色体切割、分离和收集研究，但这三种技术体系存在设备操作复杂、技术难度大、污染较重、被分离的目标染色体难以完全回收等重要问题。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是：建立易于操作、目标染色体完全回收且无污染的，基于染色体去壁低渗法制片技术的烟草高效准确的激光显微切割技术。

本发明的技术方案是：一种烟草染色体显微切割技术，包含以下步骤：(1)染色体标本制备：烟草成熟饱满种子在蒸馏水浸泡后，播种在潮湿滤纸上，放置于培养皿内萌发；待根长至0.5-1 cm时，于上午9:00-11:00间剪取新鲜根尖，将其置入饱和α-溴奈溶液室温预处理；蒸馏水清洗，经卡诺I氏固定液固定过夜；蒸馏水清洗后，置入蒸馏水低渗1h，用3%纤维素-果胶酶混合酶液在37℃条件下处理2.5 h，清洗，置入蒸馏水低渗60min；剪取1-2mm根尖分生组织于洁净玻片上，滴加卡诺I氏固定液，将材料压碎涂布并除去大组织残渣，然后加卡诺I氏固定液，微烤至干；Giemsa染液染色，然后冲洗去除染色液，镜检良好中期相标记，激光显微切割备用；(2)染色体显微切割：将制备好的染色体标本片放在激光显微切割系统载物台上，分别在10倍、20倍、40倍和100倍物镜下选择目标染色体后，设置目标染色体的切割路线，将具黏性管盖的离心管安装在激光显微切割系统自动回收装置上；设置切割激光的能量、切割速度、回收弹射激光的能量，进行染色体切割；切割后的目标染色体被回收弹射激光弹射至回收离心管的黏性管盖上；向捕获目标染色体的离心管中加入蛋白酶K反应液，置于37℃水浴中温浴4h，然后75℃20min使蛋白酶K失活，-20℃存放备用。

所述的卡诺I氏固定液组分为乙醇︰冰醋酸=3:1。

所述的培养皿底铺上滤纸。

所述的烟草成熟饱满种子在40-50℃进行浸泡40-50min。

所述的切割激光的能量设置为40-50，切割速度设置为70-80，回收激光能量设置为50-60。

本发明的有益效果：

1. 采用去壁低渗法获得的烟草染色体制片，中期分裂相多、分散度高，中期染色体清晰；

2.用3%纤维素-果胶酶混合酶液在37℃条件下处理2.5 h，并在酶解处理前后经蒸馏水低渗处理；这一处理让细胞充分吸胀大，有利于良好的染色体标本制备，成功切割。向捕获目标染色体的离心管中加入蛋白酶K反应液，置于37℃水浴中温浴4h，充分消化去蛋白。

3. 染色体切割回收采用了PALM公司的LMPC(激光弹射收集)技术，对样本进行主动收集。先切割目标，然后发射一个激光脉冲，把目标向上弹射，克服重力，进入收集装置；

4. 染色体切割回收整个过程简单，没有任何机械接触，无污染、无热损伤，不需要特殊耗材；

5. 染色体可在荧光环境进行切割。

附图说明

图1为烟草(N. alata)中期染色体细胞相单染色体显微切割前后；

图2为Zeiss PALM MicroBeam激光显微切割回收原理。

具体实施方式

实施例1：

(1)染色体标本制备：烟草成熟饱满种子在40℃蒸馏水浸泡50min后，播种在潮湿滤纸上，放置于培养皿内(培养皿底铺上一张滤纸，保持湿润)，于26℃条件下萌发。待根长至0.5-1 cm时，于上午9:00-11:00间剪取新鲜根尖，将其置入饱和α-溴奈溶液室温预处理5h。蒸馏水清洗3次，经卡诺I氏固定液(乙醇︰冰醋酸=3:1)固定过夜。蒸馏水清洗3次后，置入蒸馏水前低渗1h，用3%纤维素-果胶酶混合酶液在37℃条件下处理2.5 h，清洗3次后，置入蒸馏水后低渗60 min。剪取1-2mm根尖分生组织于洁净玻片上，滴加1滴固定液，用镊子迅速将材料压碎涂布并除去大组织残渣。然后加固定液，将玻片的一端抬起使悬液迅速扩散，在酒精灯上微烤至干。Giemsa染液染色30mins，然后经自来水冲洗去除染色液，镜检良好中期相标记，激光显微切割备用。

(2)染色体显微切割：将制备好的染色体标本片放在Zeiss PALM MicroBeam激光显微切割系统载物台上，分别在10倍、20倍、40倍和100倍物镜下选择目标染色体后，PALM RoboSoftware 4.5软件图画工具(Graphic Tools)设置目标染色体的切割路线，将具黏性管盖的离心管安装在激光显微切割系统自动回收装置上(PALM RoboMover CapMover)。切割(Cut)激光的能量、切割速度(Cut Speed)、回收弹射(LPC)激光的能量、拍照、保存等均通过PALM RoboSoftware 4.5软件设置完成。切割激光的能量设置为40，切割速度设置为80，回收激光能量设置为60。切割回收染色体后的黏性离心管加入蛋白酶K反应液，置于37℃水浴中温浴4h，以便蛋白酶K充分消化去蛋白，然后75℃20min使蛋白酶K失活，-20℃存放备用。