基于DNA纳米带模板金颗粒组装纳米项链的方法与流程

本发明属于检测分析领域，具体涉及DNA纳米带模板金颗粒一步法组装纳米项链及其制备方法和应用。

背景技术：

DNA纳米技术源自美国科学家Seeman在上个世纪80年代提出来的一个想法：利用DNA的碱基互补所形成的周期性规律结构作为蛋白等其他分子结晶的框架，这样可以为晶体学提供一个理想的研究工具。而在2006年，Rothemund则进一步利用M13噬菌体的长度7249nt的基因组DNA作为主链，通过设计人工合成的216条短链将其弯曲“折”成了各种二维结构，这就是所谓的“DNA折纸”。该技术具有过程简单、容易操作和极高产率等优点，目前已广泛应用于生物传感、物质检测、单分子水平分析、疾病诊断及治疗等领域。

纳米金即指金的微小颗粒，其直径在1～100nm，由氯金酸通过还原法可以方便地制备各种不同粒径的纳米金，其颜色依直径大小而呈红色至紫色。纳米金颗粒由于具有大的比表面积、高表面能、高的表面活性而展现出小尺寸效应、表面效应和量子表面尺寸效应等特性，使其在催化、光学、电学及生物技术等领域有着广泛的应用前景。尤其是其能与多种生物大分子结合，且不影响其生物活性。

拉曼光谱(Raman spectra)，是一种散射光谱。拉曼光谱分析法是基于印度科学家C.V.Raman所发现的拉曼散射效应，对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息，并应用于分子结构研究的一种分析方法。Feldmann(ühler,P.,Roller,E.M.,Schreiber,R.,Liedl,T.,Lohmüller,T.,&Feldmann,J.Nano Letters,2014(5),2914-2919)和Finkelstein(Pilo-Pais,M.,Watson,A.,Demers,S.,Labean,T.H.,&Finkelstein,G.Nano Letters,2014(4),2099-2104.)两位学者于2014年就DNA折纸组装研究表面拉曼增强效应，但迄今为止，尚没有使用DNA纳米带将金纳米颗粒组装成纳米结构，用于拉曼检测和其他方面的研究和专利文献报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提出一种简单易操作的通过DNA纳米带和金纳米颗粒组装构建纳米项链的方法，通过合成金纳米颗粒，与DNA纳米带组装，构建成纳米项链结构，纳米项链有序的结构经过拉曼信号分子修饰后可以使得信号进一步增强，丰富了DNA纳米结构的检测手段。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：基于DNA纳米带模板金颗粒组装纳米项链的方法，包含以下步骤：

A：合成制备金纳米颗粒；

B：将摩尔浓度为1μmol/L～5μmol/L的DNA骨架链与摩尔浓度为1μmol/L～5μmol/L的订书钉单链按按体积比1:1～1:5混合；

C：加入金纳米颗粒，并搅拌混匀；

D：将步骤C的溶液在45℃～25℃条件下梯度退火，形成纳米项链结构。

进一步，上述金纳米颗粒由以下方法制备：

(2.1)将浓度为1％～2％的氯金酸溶液置于加盖的容器中，搅拌并油浴煮沸；

(2.2)往步骤2.1中的溶液加入摩尔浓度为0.01mol/L～1mol/L的柠檬酸钠，煮沸

并大力搅拌1min～30min；

(2.3)关闭热源，大力搅拌1min～30min，静置直至室温。

作为优选，上述金纳米颗粒为20nm金颗粒。

为进一步增强拉曼光谱分析时的信号，上述金纳米颗粒可以经ssDNA1所示核苷酸序列修饰，包含以下步骤：

(3.1)金纳米颗粒溶液与ssDNA1所示核苷酸序列按摩尔比为100:1～20:1混合，搅拌混匀，在20～40℃条件下震荡孵育2～10h；

(3.2)将步骤3.1溶液滴加氯化钠溶液，滴加3～5次，每次滴加不超过5μL，间隔时间0.5～1h，滴加完毕后在20～40℃条件下震荡孵育2～10h；

(3.3)采用离心提纯法浓缩步骤3.2获得的溶液，将离心产物常温保存。

上述离心提纯法的离心提纯参数优选为9000rpm，10min，离心提纯三次。

作为优选，上述2.1步骤中的容器为三颈烧瓶。

作为优选，上述2.1步骤中的油浴的温度为150℃。

本发明具有以下的优点：

(1)DNA纳米带结构简单，形成产率高，对外界环境要求低，同时具有精确的空间可寻址性，加入纳米金颗粒后避免了繁琐的标记步骤；

(2)金纳米颗粒可以通过化学方法大量合成，大大降低成本；

(3)4-mba信号分子具有很强的拉曼信号，修饰纳米项链，使其在拉曼检测中更具有优势；

(4)借助原子力显微镜和透射电镜对纳米项链进行表征，因此具有简便、可靠、低成本、较低的实验条件要求等优势。

附图说明

图1为纳米项链结构组装和检测示意图；

图2为合成20nm金纳米颗粒透射电镜图；

图3为合成DNA纳米带AFM图；

图4为一步法合成金纳米项链AFM图；

图5为对纳米项链上修饰4-MBA的拉曼信号检测结果，其中包含纳米项链的透射电镜图。

具体实施方式

现结合附图对本发明作进一步详细说明，以使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚。

本发明中，20nm金纳米颗粒可以由以下方法制得：

(1.1)将浓度为1％～2％的氯金酸溶液置于加盖的三颈烧瓶中，搅拌并油浴煮沸；

(1.2)往步骤1.1中的溶液加入摩尔浓度为0.01mol/L～1mol/L的柠檬酸钠，煮沸并大力搅拌1min～30min。

(1.3)关闭热源，大力搅拌1min～30min，静置直至室温待用。

金纳米颗粒为经ssDNA1所示核苷酸序列修饰后的金纳米颗粒，由以下方法制得：

(2.1)金纳米颗粒溶液与ssDNA1所示核苷酸序列按摩尔比为100:1～20:1混合，搅拌混匀，在20～40℃条件下震荡孵育2～10h；

(2.2)将步骤2.1溶液滴加氯化钠溶液，滴加3～5次，每次滴加不超过5μL，间隔时间0.5～1h，滴加完毕后在20～40℃条件下震荡孵育2～10h；

(2.3)采用离心提纯法浓缩步骤2.2获得的溶液，将离心产物常温保存。

在上述准备的基础上，纳米项链可以通过以下方法制备：

(3.1)将摩尔浓度为1μmol/L～5μmol/L的DNA骨架链与摩尔浓度为1μmol/L～5μmol/L的订书钉单链按按体积比1:1～1:5混合，加入离心产物并搅拌混匀；

(3.2)将步骤3.1的溶液在45℃～25℃条件下梯度退火。

本发明所述纳米项链结构构建方法，如图1所示，如下：在DNA纳米带中的订书钉链伸出捕获立链，利用DNA特异性杂交，将修饰上巯基DNA的金纳米颗粒组装上DNA纳米带，经4-MBA拉曼信号分子修饰后使用拉曼仪器检测其信号强度。

为便于本领域的技术人员进一步理解和实施本发明，现提供如下的相关实施例：实施例1：关于如何制备20nm金纳米颗粒

(1)将质量分数为1％的氯金酸溶液置于加盖的三颈烧瓶中，搅拌并油浴(150℃)煮沸；

(2)往步骤(1)中的溶液加入摩尔浓度为40mmol/L的柠檬酸钠，煮沸并大力搅拌10min，使溶液混匀；

(3)关闭热源，大力搅拌15min，溶液从黄色变成红色，静置直至室温；

(4)反应结束后，采用离心提纯法浓缩步骤(3)获得的溶液，将离心产物分散到超纯水中。

通过透射电子显微镜表征本实施例制备获得的20nm金纳米颗粒的形貌，结果如图2所示。从TEM图结果可见，本实施例制备获得的金纳米颗粒材料粒径均一、分布均匀，进过测量统计，金纳米颗粒的直径为20±2nm。实施例1制备获得的金纳米颗粒溶液用于实施例2中制备经ssDNA1修饰的金纳米颗粒的原料。

实施例2：关于制备经ssDNA1修饰的金纳米颗粒

取实施例1中150μL金纳米颗粒溶液，制备ssDNA1修饰的金纳米颗粒：

(1)将150μL金纳米颗粒溶液离心清洗1次，9000rpm离心10分钟，将离心产物分散到100μL超纯水中；

(2)取5μL 100μM的ssDNA1加入到步骤(1)中的溶液，同时加入1.5μL质量分数为1％的十二烷基硫酸钠溶液，震荡混匀，置于温度为37℃、转速为250rpm的恒温摇匀仪，震荡孵育4h；

(3)往步骤(2)溶液中滴加2mol/L的氯化钠溶液，每次滴加2.5μL，间隔半小时，滴加4次，滴加完毕后，置于温度为37℃、转速为250rpm的恒温摇匀仪，震荡孵育8h；

(4)步骤(3)反应结束后，采用离心提纯法浓缩步骤(3)获得的ssDNA1修饰的纳米金棒，离心提纯参数为9000rpm，10min，离心提纯三次，最终得到15μL的浓缩金纳米颗粒溶液，常温放置待用。

其中，与末端修饰捕获链的订书钉链互补的SH-DNA序列如下：

5’-TTTTTTTTTTTTTTT AGCGA-3’，(ssDNA1)。

实施例3：关于基于DNA纳米带模板金颗粒的组装方法

(1)将摩尔浓度为4μmol/L的DNA骨架链(nanoribbon-scafford)与摩尔浓度为4μmol/L的订书钉单链(nanoribbon-staple1,Modificatory nanoribbon-staple1,nanoribbon-staple2,nanoribbon-staple3,Modificatory nanoribbon-staple3)按等体积混合，每种链各取2μL，加入10μL 1×TAE-Mg缓冲液至20μL，震荡混匀。再加入例2中浓缩金纳米颗粒溶液10μL，震荡混匀。

(2)将步骤(1)混合溶液置于PCR仪中以0.1℃/10s的速率从45℃～25℃退火，取新解离的云母片，滴入5μL反应后的上述混合物，干燥后，采用原子力显微镜进行表征，表征结果见图3和图4。

从图3中可以看出合成的DNA纳米带产率极高，纳米带的长度大概在1μm左右。在图4中，大部分的DNA纳米带都已与金纳米颗粒组装，组装金颗粒数目最多的有25个，因为纳米带的长度不均一，所以组装上的金颗粒数目也不一样。

其中，DNA骨架链和订书钉单链的序列如下：

5’-CAGGGCTGGGCATAGAAGTCAGGGCAGAGACGAGTTGAGAATACGAGTTGAGAATACGAGTTGAGAATCCGACCATTGTGCGCTATCTTCATCTTA-3’，(nanoribbon-scafford)。

5’-CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3’，(nanoribbon-staple1)。

5’-AAAAAAAAAAAAAAACAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3’(Modificatory nanoribbon-staple1)。

5’-CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG-3’，(nanoribbon-staple2)。

5’-TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT-3’，(nanoribbon-staple3)。

5’-AAAAAAAAAAAAAAATCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT-3’(Modificatory nanoribbon-staple3)。

实施例4：关于对纳米项链拉曼信号检测

取300目碳支持膜，滴入10μL例3反应后的溶液，常温干燥后采用透射电子显微镜进行表征，表征结果如图5中的小图所示，我们可以看到形成的金纳米项链中各个金纳米颗粒间距均一，且平均间距小于5nm。

取长宽为1cm×1cm的硅片，在其光滑面滴入5μL的DNA纳米带、20nm金颗粒和金纳米项链溶液，静置10min，使样品吸附到硅片表面。再往20nm金颗粒和金纳米项链溶液中滴加4-MBA拉曼信号分子，静置2h，4-MBA充分附着到金纳米颗粒表面。使用拉曼显微镜测试三个样品的拉曼信号(激发光波长为633nm)，结果如图5所示，信号最低的为DNA纳米带，接近为0；金纳米颗粒修饰上4-MBA拉曼信号分子后的信号强度较DNA纳米带高，1075cm^-1和1580cm^-1两处为4-MBA的信号强度峰；金纳米项链修饰上4-MBA拉曼信号分子后的信号最强，大约为金纳米颗粒的3倍。有以上结果可以得出以下结论：经DNA纳米带组装的金纳米颗粒，由于颗粒间距得以控制，使得拉曼信号分子的检测强度得到成倍的增强，有力地证实了本发明所述的DNA纳米结构检测信号分子的可靠性。

本发明利用DNA纳米结构和纳米金独特优势，将DNA纳米带和20nm金颗粒组装成金纳米项链，该结构与信号分子的结合的方法为各种信号分子的检测拓展了思路，开辟了新的路径。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明所限定的范围。